間充質(zhì)干細胞分化的制作方法
【專利說明】間充質(zhì)干細胞分化
[0001 ]本申請是申請人于2010年7月13日提交的題為“間充質(zhì)干細胞分化”的中國專利申請201080031985.4的分案申請。
[0002]對相關申請的交叉參考引用
[0003]本申請根據(jù)美國法典35第1.119(e)款，要求美國臨時申請?zhí)?1/225,293(2009年7月14日遞交)的權(quán)利，該臨時申請的全部內(nèi)容通過參考引用并入本文。
[0004]發(fā)明背景
[0005]骨關節(jié)炎(OA)是最常見的肌骨疾病。目前，大約有4千萬美國人患有該病，由于人口老齡化和平均壽命的增加，該數(shù)字在接下來的20年內(nèi)預計將增加到6千萬，使得該疾病成為導致殘疾的第四位主要原因。OA的特征在于關節(jié)的緩慢退行性降解，包括關節(jié)軟骨(含有為關節(jié)提供潤滑和緩沖的細胞和基質(zhì))和位于關節(jié)軟骨下的軟骨下骨。目前，對OA的療法包括以口服NSAIDs或選擇性環(huán)加氧酶2(C0X-2)抑制劑來減輕痛苦、以例如皮質(zhì)類固醇和透明質(zhì)素等藥劑進行關節(jié)內(nèi)(IA)注射、以及外科手術(shù)的方法。
[0006]間充質(zhì)干細胞(MSCs)存在于成人的關節(jié)軟骨中，其分離后能夠在體外被程序化以經(jīng)歷分化而成軟骨細胞和其它間充質(zhì)細胞譜系。這部分地受生長因子(TGFi3s、BMPs)、血清條件和細胞-細胞接觸的調(diào)節(jié)。
發(fā)明概要
[0007]本發(fā)明提供了改善或防止哺乳動物關節(jié)炎或關節(jié)損傷的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括對哺乳動物的關節(jié)施用組合物，所述組合物包含有效量的多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO:1或25具有至少95%同一性的氨基酸序列，從而改善或防止哺乳動物關節(jié)炎或關節(jié)損傷。
[0008]在一些實施方案中，個體具有關節(jié)炎或關節(jié)損傷。在一些實施方案中，個體沒有關節(jié)炎或關節(jié)損傷，但具有關節(jié)炎或關節(jié)損傷的風險。
[0009]在一些實施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。
[0010]在一些實施方案中，氨基酸序列與SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28具有至少95%同一性。在一些實施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28。
[0011]在一些實施方案中，氨基酸序列與SEQ ID NOs:5-24之任一至少80%相同。在一些實施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。
[0012]在一些實施方案中，關節(jié)炎選自骨關節(jié)炎、創(chuàng)傷性關節(jié)炎和自身免疫性關節(jié)炎。
[0013]在一些實施方案中，哺乳動物為人。
[0014]在一些實施方案中，組合物還包括透明質(zhì)酸。
[0015]本發(fā)明也提供了誘導間充質(zhì)干細胞分化形成軟骨細胞的方法，所述軟骨細胞形成軟骨基質(zhì)。在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括使間充質(zhì)干細胞與足夠量的多肽接觸以誘導干細胞分化形成軟骨細胞，所述多肽包含與SEQ ID NO:1或25具有至少95%同一性的氨基酸序列。
[0016]在一些實施方案中，本發(fā)明方法在體外進行。在一些實施方案中，本發(fā)明方法在體內(nèi)進行，干細胞存在于哺乳動物體內(nèi)。在一些實施方案中，哺乳動物為人。
[0017]在一些實施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。
[0018]在一些實施方案中，氨基酸序列與SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28具有至少95%同一性。在一些實施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28。
[0019]在一些實施方案中，氨基酸序列與SEQ ID NOs:5-24之任一至少80%相同。在一些實施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。
[0020]本發(fā)明也提供了用于關節(jié)內(nèi)遞送和全身遞送的藥物組合物。在一些實施方案中，組合物包含藥學有效量的多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO:1或25具有至少95%同一性的氨基酸序列。
[0021]在一些實施方案中，組合物還包括透明質(zhì)酸。
[0022]在一些實施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。
[0023]在一些實施方案中，氨基酸序列與SEQ ID NOs:2、3、4、26、27或28具有至少95%同一性。在一些實施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28。
[0024]在一些實施方案中，氨基酸序列與SEQ ID NOs:5_24之任一至少80%相同。在一些實施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。
[0025]本發(fā)明的其它特征、優(yōu)點和實施方案可以從以下詳細描述和權(quán)利要求中得到闡明或顯而易見。此外，應理解的是，上述發(fā)明概述和以下的詳細描述均是舉例說明性的，旨在提供進一步的解釋而不是限制本發(fā)明的保護范圍。
[0026]定義
[0027]術(shù)語“肽模擬物”(peptidomimetic)和“模擬物”(mimetic)指合成的化學化合物，所述化合物與天然或非天然產(chǎn)生的多肽(例如，ANGPTL3)具有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能特征。肽類似物普遍用在制藥業(yè)中，作為與模板肽具有類似特性的非肽藥物。這些類型的非肽化合物被稱為“肽模擬物” (peptide mime tics 或peptidomime tics) (Fauchere ,J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.30:1229(1987)，通過參考引用將它們整合到本文中)?？梢允褂迷诮Y(jié)構(gòu)上與治療有用的肽相似的肽模擬物來產(chǎn)生等效的或增強的治療或預防效果。通常，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生物學或藥理學活性的多肽)相似，例如在目的多肽中所發(fā)現(xiàn)的，但是其一個或多個肽鍵任選地被選自如下的鍵替代:例如-CH2NH-、-CH2S-、_CH2-CH2-、-CH=CH-(順式和反式)、-C0CH2-、_CH(OH)CH2-、和-CH2S0-。模擬物可以完全由合成的、非天然的氨基酸類似物組成，或者是由部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物組成的嵌合分子。模擬物也可以并入任何數(shù)量的天然氨基酸保守性替換，只要該替換不實質(zhì)性地改變模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性。例如，如果模擬組合物能夠執(zhí)行目的多肽的至少一種活性，它就屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0028]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可替換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語適用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及適用于其中一個或多個氨基酸殘基為對應的天然氨基酸的人工化學模擬物的氨基酸聚合物。
[0029]術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸、以及以和天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸、以及隨后被修飾的氨基酸(例如，羥脯氨酸、T -羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸)。氨基酸類似物是指具有和天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)(即，與氫、羧基、氨基和R基團結(jié)合的α碳)的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但是保留了和天然存在的氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)。天然編碼的氨基酸為20種常見氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)以及吡咯賴氨酸和砸代半胱氨酸。
[0030]“保守修飾的變體”適用于氨基酸和核酸序列。就具體的核酸序列而言，保守修飾變體是指那些編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或是在核酸不編碼氨基酸序列時編碼基本相同的序列的核酸。因為遺傳密碼的簡并性，任何給定的蛋白質(zhì)都可以由許多功能相同的核酸編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個由密碼子規(guī)定丙氨酸的位置，該密碼子可以改變?yōu)槿魏紊鲜鱿鄳拿艽a子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異為“沉默變異”，它屬于保守修飾變異的一種。在本文中每一個編碼多肽的核酸序列也描述該核酸的每一種可能的沉默變異。技術(shù)人員知道，可以對核酸中的每一個密碼子進行修飾(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，每一個所描述的序列都隱含編碼多肽的核酸的每一個沉默變異。
[0031]關于氨基酸序列，技術(shù)人員知道，導致編碼序列中單氨基酸或小百分數(shù)氨基酸改變、添加或缺失的核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單替換、缺失或插入，當該改變導致氨基酸被化學上類似的氨基酸替換時，是“保守修飾變體”。提供功能類似的氨基酸的保守置換表在本領域公知。這樣的保守修飾變體另外附加于并且不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因。
[0032]以下八組中每一組包含互相之間保守替換的氨基酸:
[0033]I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
[0034]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
[0035]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
[0036]4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);
[0037]5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);
[0038]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
[0039]7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);以及
[0040]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(見，例如Creighton ,Proteins (1984))。
[0041]通過在比較窗口內(nèi)對兩個最佳比對的序列進行比較來確定“序列同一性百分比”，其中，與不包含添加或缺失的參考序列(例如，本發(fā)明的多肽)相比較，多核苷酸序列在比較窗內(nèi)的部分可以包含添加或缺失(即，空位)，以獲得兩個序列的最佳比對。百分比的計算如下:計算兩個序列中一致的核酸堿基或氨基酸殘基出現(xiàn)的位置的數(shù)量以得到匹配位置的數(shù)量，以匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中位置的總數(shù)并將結(jié)果乘以100，從而得到序列同一性百分比。
[0042]在兩個或多個核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“相同”或百分比“同一性”是指，兩個或更多個序列或子序列是相同的序列。當使用以下序列比較算法之一或通過手工比對和目視檢查進行測定時，當為在比較窗口或指定區(qū)域內(nèi)獲得最大對應性而進行比較和比對時，如果兩個序列具有規(guī)定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在規(guī)定區(qū)域上，或在未規(guī)定時，在整個序列上，60%相同，任選地65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同)，則兩個序列是“基本相同的”。本發(fā)明提供分別與本文中例示的多肽(例如，SEQ ID NOs:1-28之任一)基本相同的多肽，以及這些多肽的應用，包括但不限于用于治療或預防關節(jié)炎或關節(jié)損傷。可選地，同一性存在于參考序列的至少約50個核苷酸長度的區(qū)域上，或更優(yōu)選地，存在于100至500個、或1000個或更多個核苷酸長度的區(qū)域上或整個長度上。
[0043]為了進行序列比較，典型地，一個序列充當參考序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，指定子序列的坐標，如果需要的話，指定序列算法的程序參數(shù)?？梢允褂媚J的程序參數(shù)，或指定替代參數(shù)。然后，序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計算出測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性。
[0044]本文中所使用的“比較窗口”包括具有選自以下的任一數(shù)量的連續(xù)位置的區(qū)段:20至600、通常約50至約200、更多地是約100至約150，在該區(qū)段中在對兩個序列進行最優(yōu)比對后，可以將序列與具有相同數(shù)量的連續(xù)位置的參考序列進行比較。用于進行比較的序列比對方法在本領域公知。用于進行比較的最優(yōu)序列比對可以按以下方法來進行:例如，Smith和Waterman(1970) (Adv.Appl.Math.2: 482c)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(1970)(J.Mol.B11.48:443)的同源性比對算法，Pear son和Lipman (1988) (Proc.Nat ’1.Acad.Sc1.USA 85:2444)的相似性搜索方法，以計算機執(zhí)行這些算法(Wisconsin遺傳學軟件包(Computer Group , 575Science Dr.,Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA)，或手工比對和目視檢查(見，例如Ausubel等，Current Protocols in MolecularB1logy( 1995年增刊)。
[0045]兩個適合于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0,它們分別描述于Altschul 等(1977) Nuc.Ac ids Res.25: 3 389-340 2和Altschu I 等(1990)J.Mol.B11.215:403-410中。用于進行BLAST分析的軟件可以從美國國家生物技術(shù)信息中心公開獲取。該算法包括首先