本發(fā)明屬于組織工程學生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含黑色素細胞的體外皮膚測試模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

皮膚是最大的人體器官，由外向內(nèi)大致可分為3層：表皮層、真皮層和皮下組織。表皮層包括角質(zhì)層和基底層，其中，角質(zhì)層是皮膚的最外層，能耐受一定的物理、化學、機械性傷害，對內(nèi)部組織起保護作用?；讓邮潜砥拥淖畹讓?，由基底細胞和黑色素細胞構(gòu)成。黑素細胞在皮膚細胞中發(fā)揮著防御者的作用，黑素細胞通過生成黑素顆粒抵御紫外線以及環(huán)境污染對皮膚的傷害作用。

化妝品、藥品等產(chǎn)品上市前都要進行大量的測試以保障產(chǎn)品的安全性與功效性。傳統(tǒng)的功效性評價是使用動物進行。然而，動物實驗本身存在如試驗評分主觀性強、結(jié)果重復性差、動物和人之間的種屬差異等弊端均影響對待測樣品正確評價。3r理論的提出以及國內(nèi)外對3r研究的迅速發(fā)展，不再以動物模式為基礎(chǔ)的評價方法成為的生物醫(yī)學研究的重要方向。歐盟甚至制定法規(guī)來禁止銷售采用動物做實驗的產(chǎn)品和原料，這對體外檢測的研究發(fā)展發(fā)揮著關(guān)鍵的推動作用。

“一白遮百丑”一直是愛美人士的對皮膚的追求，這使得美白化妝品在化妝品市場占有重要的地位。目前對于美白化妝品的安全以及功效評價是基于動物模型如豚鼠進行驗證，但是隨著歐盟對動物實驗的嚴令禁止，美白化妝品的安全與功效評價成為的化妝品上市前的一大難題。所以急需開發(fā)一種能夠評價美白化妝品安全與功效的皮膚模型填補漏洞，并最終完成美白功效性驗證。

專利cn101538555a公開了一種采用i型膠原與成纖維細胞制備的真皮層類似物，然后接種角質(zhì)形成細胞、黑色素細胞，并通過體外培養(yǎng)制備出功能性色素等同物。這種方法所制備的皮膚模型包含真皮層和表皮層。但是這種皮膚模型含有的真皮層中的細胞外基質(zhì)主要來源于其他動物如牛，而且影響角質(zhì)形成細胞從培養(yǎng)基中汲取營養(yǎng)成分，導致后期表皮的生發(fā)只含有1層或是兩層，這與人的表皮結(jié)構(gòu)存在很大差異，并且難應(yīng)用于長期穩(wěn)定的檢測中。

專利fr2689904和wo95/10600公開了一種含有角質(zhì)形成細胞和黑素細胞的表皮類似物，但是模型在構(gòu)建過程中使用的黑素細胞是具有tpa誘導，而tpa是一種致癌性物質(zhì)，它的存在會影響黑素細胞的生長以及影響后期模型的生發(fā)。

專利cn105353114a公開了一種包含成纖維細胞，黑素細胞以及角質(zhì)形成細胞共建的色素模型。這種構(gòu)建方法所制備的皮膚模型含有真皮層和表皮層。但是這種皮膚模型的真皮層只含有成纖維細胞，這樣不利于成纖維細胞沒有影響物質(zhì)的供給，無法進行伸展以及基質(zhì)的分泌，最終導致真皮層死亡，而表皮層與培養(yǎng)基之間存在空隙，最終導致表皮層不能接觸營養(yǎng)物質(zhì)導致死亡。

專利cn1493367a公開了一種可調(diào)節(jié)分泌的組織工程皮膚，此皮膚模型中包含角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和黑素細胞。但是此制備的模型應(yīng)用于臨床損傷修復，模型過大并且沒有形成封閉的空間而不利于化妝品以及藥品的檢測。

專利cn103983762a公開了一種含有黑素細胞和角質(zhì)形成細胞的皮膚模型，這種皮膚模型的構(gòu)建過程中，黑素細胞和角質(zhì)形成細胞按照一定的比例接種到支架上，但是黑素細胞比角質(zhì)形成細胞貼壁時間長，導致后期模型形成過程中，黑素細胞不位于表皮的基底層，這與人的皮膚結(jié)構(gòu)存在很大的差異。

以上公布的皮膚模型，在其生長過程中使用的培養(yǎng)基都含有影響黑色素形成的物質(zhì)如維生素c、維生素e等，而維生素c對黑素的形成具有還原作用，最終對評價結(jié)果產(chǎn)生一定的影響作用。

從以上的分析中可以看出，雖然現(xiàn)在已有相關(guān)的黑色素模型被開發(fā)，但是這些模型的種子細胞以及組織形態(tài)與天然皮膚的結(jié)構(gòu)具有一定的差異性，對后期評價中存在一定的局限性。結(jié)合目前人們對藥物及化妝品的長期功效具有較高的要求。因此，建立具有高穩(wěn)定性的黑色素皮膚模型具有較好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種含黑色素細胞的體外皮膚測試模型的構(gòu)建方法，解決了利用現(xiàn)有方法構(gòu)建的皮膚測試模型不適用于人們對藥物及化妝品的長期功效評價的問題。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種含黑色素細胞的體外皮膚測試模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

步驟一：配制培養(yǎng)基

使用人表皮角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，分別配置培養(yǎng)基a和培養(yǎng)基b；

培養(yǎng)基a：在基礎(chǔ)液中添加對黑色素細胞促進黑色素生成的生長因子，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基a；培養(yǎng)基b：以培養(yǎng)基a為基礎(chǔ)液，添加促進表皮復層化的氯化鈣，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基b；

步驟二：表皮層的構(gòu)建

將角質(zhì)形成細胞與黑素細胞分別采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液，分別接種到均勻接種到transwell小室中，再加入培養(yǎng)基a進行浸沒式培養(yǎng)，37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~5天，形成含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)；

步驟三、含黑色素的皮膚測試模型表皮層后期培養(yǎng)

將步驟三中含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)基b進行氣液面培養(yǎng)，使液面與表皮層結(jié)構(gòu)的表面平齊，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~15天，得到所述含黑色素的皮膚測試模型。

本發(fā)明的特點還在于：

進一步地，上述基礎(chǔ)液為模型培養(yǎng)所特有的細胞培養(yǎng)液—kc-growth，培養(yǎng)液a為在kc—growth（1l）中添加促細胞生長的特殊因子配制而成，配制好的培養(yǎng)液a中各因子的濃度分別為，氫化可的松0.2-0.8μg/ml，胰島素0.8-1.8μg/ml，堿性成纖維細胞生長因子0.05-0.15ng/ml，牛腦垂體提取物10~100μg/ml；培養(yǎng)液b以培養(yǎng)基a為基礎(chǔ)液，添加促進表皮復層化的氯化鈣配制而成，配制好的培養(yǎng)液b中氯化鈣的濃度為0.47-0.6mmol/l。

進一步地，步驟2表皮層的構(gòu)建前，先使用25μg/ml~75μg/ml的多聚賴氨酸對transwell培養(yǎng)小室底膜進行過夜包被，可以解決黑素細胞貼壁性差的因素，提高貼壁效率。

進一步地，transwell培養(yǎng)小室采用四周固定、底膜具有微孔結(jié)構(gòu)的碳酸脂膜的小室，與傳統(tǒng)的浸沒式培養(yǎng)相比，表皮層的構(gòu)建建立于具有微孔結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)小室薄膜上并進行浸沒式培養(yǎng)，這樣的培養(yǎng)方式更有利于角質(zhì)形成細胞與黑素細胞從培養(yǎng)基中汲取營養(yǎng)成分，對表皮細胞的增殖分化以及發(fā)育生長提供了豐富的營養(yǎng)以及適宜的微環(huán)境，可提高模型的穩(wěn)定性。

進一步地，將角質(zhì)形成細胞與黑素細胞分別接種到均勻接種到transwell小室中采用分步接種方式，所述分步接種方式為以下任一種：（1）先接種黑色素細胞，再接種角質(zhì)形成細胞；（2）先接少量的角質(zhì)形成細胞，一定時間后接種黑色素細胞，最后再接種角質(zhì)形成細胞的方式。

進一步地，采用所述接種方式（1）時，接種黑色素細胞后先在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待黑素細胞貼壁率達到90%~95%時，再接種角質(zhì)形成細胞；采用所述接種方式（2）時，先將接種的角質(zhì)形成細胞在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0.5小時，再接種黑素細胞，再在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待黑素細胞貼壁率達到90%~95%時，再最后接種角質(zhì)形成細胞。兩種接種方式都模擬了自然皮膚中黑素細胞位于表皮基底層的表皮干細胞之間，最終形成與自然皮膚相似的表皮結(jié)構(gòu)。

更進一步地，采用所述接種方式（1）時，黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例為1:1~1:30；采用所述接種方式（2）時，先接種的角質(zhì)形成細胞與黑素細胞的接種比例為1:10~1:1，黑色素細胞與最后接種的角質(zhì)形成細胞的接種比例為1:1~1:30。通過上述的皮膚模型兩種細胞的接種比例可以模擬人體皮膚中黑素細胞與角質(zhì)形成細胞的比例以及不同人種的兩種細胞的比例。

更進一步地，步驟2所述黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞接種的細胞總密度為2~10×10⁶個/cm²。

本發(fā)明所構(gòu)建的皮膚測試模型培養(yǎng)時間大大縮短，并且結(jié)構(gòu)與真實皮膚的相似，具有清晰可見的復層化結(jié)構(gòu)，包含基底層，棘層，顆粒層和角質(zhì)層，并且黑素細胞位于基底層，分布于角質(zhì)形成細胞中，并且在表皮的不同層可以看到清晰可見的黑素顆粒。

本發(fā)明所構(gòu)建的黑色素皮膚檢測模型后期培養(yǎng)穩(wěn)定性好。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)小室底層pc膜和基底層的細胞緊密連接，并可防止表皮層的收縮，更重要的是培養(yǎng)小室是相同外徑的半封閉狀態(tài)，作為化妝品功效的檢測工具，更有利于檢測的平行性與穩(wěn)定性。本發(fā)明的檢測模型不僅具有檢測化妝品的功效，而且具有制作簡單、成本低、產(chǎn)品穩(wěn)定的優(yōu)點。

本發(fā)明的色素皮膚模型，由于收縮率微乎其微，表皮層復層化結(jié)構(gòu)含有黑素細胞成分，并且能合成和分泌黑色素，構(gòu)建出的顏色有三種，與三種人的膚色相似，所以在美白化妝品的檢測中主要功能有：（1）美白化妝品對黑素形成的抑制作用；（2）美白原料物的篩選評價；（3）化妝品對皮膚的安全性評價；（4）防曬化妝品的功效評價。本發(fā)明的色素皮膚模型可準確用于化妝品的安全與功效評價的檢測。

與已有的皮膚模型相比，本發(fā)明的色素皮膚模型具有以下優(yōu)點：可以通過不同比例的黑素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例形成不同色度的皮膚模型，以此模擬不同人種的皮膚，更加準確地反映針對不同人種的化妝品的美白以及防曬功效的評價。本發(fā)明的色素皮膚模型在整個培養(yǎng)過程中沒有影響黑素細胞形成黑色素的成分，保證的模型中黑素細胞形成黑素顆粒的能力，提高了模型的穩(wěn)定性。本發(fā)明的色素皮膚模型只含有黑素細胞以及角質(zhì)形成細胞，這使得黑素細胞對外界的刺激更為靈敏，使化妝品功效與安全的快速準確檢測得到保證。本發(fā)明的原料成本低，制作周期短，穩(wěn)定性良好，可大量生產(chǎn)，所制備的色素皮膚模型可準確用于化妝品的安全與功效評價的檢測。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的原代培養(yǎng)后傳代培養(yǎng)第3代的黑素色細胞的鏡下形態(tài)照片；

圖2是本發(fā)明實施例提供的多聚賴氨酸處理小室底膜后黑素細胞貼壁改變的對比統(tǒng)計圖；

圖3是本發(fā)明實施例提供的不同接種方式的色素皮膚模型的表觀圖；

圖4是本發(fā)明實施例提供的不同接種方式色素皮膚模型的組織學圖片；

圖5是本發(fā)明實施例提供的黑素細胞與角質(zhì)形成細胞不同接種比的色素皮膚模型的表觀圖；

圖6是本發(fā)明實施例提供的黑素細胞與角質(zhì)形成細胞不同接種比的色素皮膚模型的組織學圖片；

圖7是本發(fā)明實施例提供的培養(yǎng)基（含有維生素c）與模型培養(yǎng)基（不含維生素c）的模型表觀圖；

圖8是本發(fā)明實施例提供的色素皮膚模型體外檢測化妝品的外觀圖；

圖9是本發(fā)明實施例提供的色素皮膚模型體外檢測化妝品的黑素含量圖；

圖10是本發(fā)明實施例提供的色素皮膚模型體外檢測化妝品的黑素顆粒分布圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不限于這些實施方式。

其中，本發(fā)明的說明書中的術(shù)語“上”、“中”和“下”是一種基于附圖的相對概念，用于區(qū)別不同對象，而不是用于限定特定順序。

以下實施例所使用的原代黑色素細胞和角質(zhì)形成細胞均來源于包皮環(huán)切術(shù)的正常皮膚組織，原代黑色素細胞的獲取及傳代詳見劉源的《構(gòu)建含黑色素細胞組織工程皮膚的研究》，得到的黑色素細胞見附圖1，圖片中顯示的黑色素細胞具有較好的細胞狀態(tài)，黑色素細胞胞核透光性好，細胞樹突分支較少（樹突量<3個），黑色素細胞分級為3級，具有較好的細胞活性及生物學功能。角質(zhì)形成細胞的獲取及傳代詳見馬英智的《人表皮干細胞的分離、純化培養(yǎng)及鑒定》。

同時，以下實施例均使用人表皮角質(zhì)形成細胞的培養(yǎng)基（kc-growth）作為基礎(chǔ)液，分別配置培養(yǎng)基a和培養(yǎng)基b。

培養(yǎng)基a：以kc-growth為基礎(chǔ)液（1l），添加對形成細胞增殖有重要作用的因子氫化可的松0.2-0.8μg/ml，胰島素0.8-1.8μg/ml，牛腦垂體提取物10~100μg/ml；以及對添加對黑色素細胞（以下簡稱黑素細胞）生成黑色素具有重要作用的因子如堿性成纖維細胞生長因子0.05-0.15ng/ml；制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基a。

培養(yǎng)基b：以培養(yǎng)基a為基礎(chǔ)液（1l），添加對角質(zhì)形成細胞分化具有重要作用的氯化鈣0.47-0.6mmol/l，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基b。

實施例1一種含黑色素的體外皮膚測試模型的構(gòu)建

本實施例提供的培養(yǎng)基a：以kc-growth為基礎(chǔ)液（1l），添加對形成細胞增殖有重要作用的因子氫化可的松0.2μg/ml，胰島素1.8μg/ml，牛腦垂體提取物100μg/ml；以及對添加對黑色素細胞（以下簡稱黑素細胞）生成黑色素具有重要作用的因子如堿性成纖維細胞生長因子0.05ng/ml；制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基a。

培養(yǎng)基b：以培養(yǎng)基a為基礎(chǔ)液（1l），添加對角質(zhì)形成細胞分化具有重要作用的氯化鈣0.47mmol/l，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基b。

本實施例的皮膚測試模型的構(gòu)建，依下述步驟進行：

步驟一、含黑色素的皮膚測試模型表皮層的構(gòu)建

采用濃度為25~75μg/ml的多聚賴氨酸進行小室底部的包被，實驗顯示，多聚賴氨酸包被可以解決黑素細胞貼壁性差的因素，與不進行包被預(yù)處理相比，貼壁效率提高了40%（附圖2），將第3代或第4代黑色素細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)）接種到transwell小室進行皮膚模型的構(gòu)建，首先將黑素細胞均勻接種到小室中，在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)5小時，待黑素細胞貼壁率達到90%~95%時，將體外培養(yǎng)的第6代或第7代的角質(zhì)形成細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)），并接種到黑素細胞的上層，其中表皮層的構(gòu)建中黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例為1:10，接種的細胞總密度為5×10⁶cells/cm²，加入培養(yǎng)基a在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中進行浸沒式培養(yǎng)2天，每天換液，形成含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)。

步驟二、含黑色素的皮膚測試模型表皮層后期培養(yǎng)

將步驟二中未成熟的表皮結(jié)構(gòu)的體外測試皮膚模型置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)基b進行氣液面培養(yǎng)，使液面與皮膚模型表面平齊，每天換液，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-15天，本實施例選擇12天，得到所述含黑色素的皮膚測試模型。

實施例2一種含黑色素的體外皮膚測試模型的構(gòu)建

本實施例培養(yǎng)基a、b同實施例1。

本實施例的皮膚測試模型的構(gòu)建，依下述步驟進行：

步驟一、含黑色素的皮膚測試模型表皮層的構(gòu)建

采用濃度為25~75μg/ml的多聚賴氨酸進行小室底部的包被，將體外培養(yǎng)的第6代或第7代的角質(zhì)形成細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液接種到小室中，角質(zhì)形成細胞與黑素細胞的接種比例為1:10~1:1，本實施例選擇1:5。然后將接種了角質(zhì)形成細胞的小室在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)0.5小時，然后將第3代或第4代黑素細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液接種到小室中（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)），在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)3小時，待黑素細胞貼壁率達到90%~95%時，再將體外培養(yǎng)的第6代或第7代的角質(zhì)形成細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)）接種黑素細胞的上層，其中黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例為1:1~1:30，本實施例選擇1:10，接種的細胞密度為5×10⁶cells/cm²，加入培養(yǎng)基a在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中進行浸沒式培養(yǎng)2天，每天換液，形成含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)。

步驟二、含黑色素的皮膚測試模型表皮層后期培養(yǎng)

將步驟二中未成熟的表皮結(jié)構(gòu)的體外測試皮膚模型置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)基b進行氣液面培養(yǎng)，使液面與皮膚模型表面平齊，每天換液，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天，得到所述含黑色素的皮膚測試模型。

含黑色素的皮膚測試模型的后期鑒定

對實施例1、2所構(gòu)建的含黑色素的皮膚測試模型進行表觀拍照，黑素含量檢測并進行多聚甲醛溶液固定，包埋，脫水，切片，行he染色，觀察其結(jié)構(gòu)（見附圖3-4）。附圖3結(jié)果顯示：在黑素細胞與角質(zhì)形成細胞相同比例的前提下，先接種黑素細胞，再接種角質(zhì)形成細胞（圖中a），或先接種角質(zhì)形成細胞，再接種黑素細胞，最后再接種角質(zhì)形成細胞（圖中b），這兩種不同的接種方式并不會影響后期黑素細胞的分泌黑素顆粒，以及皮膚的顏色。附圖4結(jié)果顯示：這兩種接種方式所構(gòu)建的黑色素的體外皮膚測試的模型的表皮層均是包含基底層、棘細胞層、顆粒層和角質(zhì)層結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)層次分明的表皮層結(jié)構(gòu)。

實施例3一種含黑色素不同膚色的體外皮膚測試模型的構(gòu)建

本實施例培養(yǎng)基a：以kc-growth為基礎(chǔ)液（1l），添加對形成細胞增殖有重要作用的因子氫化可的松0.8μg/ml，胰島素1.2μg/ml，牛腦垂體提取物50μg/ml；以及對添加對黑色素細胞（以下簡稱黑素細胞）生成黑色素具有重要作用的因子如堿性成纖維細胞生長因子0.15ng/ml；制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基a。

培養(yǎng)基b：以培養(yǎng)基a為基礎(chǔ)液（1l），添加對角質(zhì)形成細胞分化具有重要作用的氯化鈣0.6mmol/l，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基b。

本實施例的皮膚測試模型的構(gòu)建，依下述步驟進行：

步驟一、含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型表皮層的構(gòu)建

采用濃度為25~75μg/ml的多聚賴氨酸進行小室底部的包被，將體外培養(yǎng)的第6代或第7代的角質(zhì)形成細胞與第3代或第4代黑色素細胞采用培養(yǎng)基a分別制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)）接種到小室進行皮膚模型的構(gòu)建，其中表皮層的構(gòu)建中黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例分別按照1:4，1:10，1:30的比例接種（都采用先接種黑素細胞再接種角質(zhì)形成細胞），接種的細胞密度為10×10⁶cells/cm²，加入培養(yǎng)基a在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中進行浸沒式培養(yǎng)2天，每天換液，形成含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)。

步驟二、含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型表皮層后期培養(yǎng)

將步驟二中未成熟的表皮結(jié)構(gòu)的體外測試皮膚模型置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)基b進行氣液面培養(yǎng)，使液面與皮膚模型表面平齊，每天換液，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12天，得到所述含黑色素的皮膚測試模型。

含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型的后期鑒定

對本實施例所構(gòu)建的含黑色素的皮膚測試模型進行表觀拍照，黑素含量檢測并進行多聚甲醛溶液固定，包埋，脫水，切片，行he染色，觀察其結(jié)構(gòu)（見附圖5-6），圖5為黑素細胞與角質(zhì)形成細胞不同接種比的色素皮膚模型的表觀圖（a表示1:4，b表示1:10，c表示1:30），其結(jié)果顯示：不同的接種比例會形成不同亮度的皮膚模型。圖6為黑素細胞與角質(zhì)形成細胞不同接種比的色素皮膚模型的組織學。其結(jié)果顯示：不同的接種比例的色素皮膚模型，三種表皮層的各層都含有不同的黑素顆粒，隨著接種比例的增大黑素顆粒變多。

實施例4一種含黑色素不同膚色的體外皮膚測試模型的構(gòu)建

培養(yǎng)基a：以kc-growth為基礎(chǔ)液（1l），添加對形成細胞增殖有重要作用的因子氫化可的松0.5μg/ml，胰島素0.8μg/ml，牛腦垂體提取物10μg/ml；以及對添加對黑色素細胞（以下簡稱黑素細胞）生成黑色素具有重要作用的因子如堿性成纖維細胞生長因子0.15ng/ml；制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基a。

培養(yǎng)基b：以培養(yǎng)基a為基礎(chǔ)液（1l），添加對角質(zhì)形成細胞分化具有重要作用的氯化鈣0.5mmol/l，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基b。

本實施例的皮膚測試模型的構(gòu)建，依下述步驟進行：

步驟一、含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型表皮層的構(gòu)建

采用濃度為25~75μg/ml的多聚賴氨酸進行小室底部的包被，將第3代或第4代黑色素細胞分別采用培養(yǎng)基a1（含有維生素c），培養(yǎng)基a2(不含有維生素c)制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)）接種到小室進行皮膚模型的構(gòu)建，首先將黑素細胞均勻接種到小室中，在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)5小時，待黑素細胞貼壁率達到90%~95%時，將體外培養(yǎng)的第6代或第7代的角質(zhì)形成細胞采用培養(yǎng)基a1或a2制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)），并接種到黑素細胞的上層，其中表皮層的構(gòu)建中黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例為1:1~1:30，優(yōu)選1:10接種的細胞密度為1×10⁶cells/cm²，加入培養(yǎng)基a在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中進行浸沒式培養(yǎng)5天，每天換液，形成含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)。

步驟二、含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型表皮層后期培養(yǎng)

將步驟二中未成熟的表皮結(jié)構(gòu)的體外測試皮膚模型置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架表面，分別加入培養(yǎng)基b1(含有維生素c)，培養(yǎng)基b2(不含有維生素c)進行氣液面培養(yǎng)，使液面與皮膚模型表面平齊，每天換液，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-15天，本實施例選擇12天，得到所述含黑色素的皮膚測試模型。

含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型的后期鑒定

對本實施例所構(gòu)建的含黑色素的不同膚色的皮膚測試模型進行表觀拍照，黑素含量檢測并進行多聚甲醛溶液固定，包埋，脫水，切片，行he染色，觀察其結(jié)構(gòu)（見附圖7，其中a不含vc，b含vc），結(jié)果顯示：使用含維生素c培養(yǎng)基構(gòu)建的色素皮膚模型的表觀顏色明顯比使用不含維生素c構(gòu)建的色素皮膚模型表觀顏色淺。

實施例5一種含黑色素的體外皮膚測試模型的構(gòu)建

本實施例培養(yǎng)基a、b同實施例4。

本實施例的皮膚測試模型的構(gòu)建，依下述步驟進行：

步驟一、含黑色素的皮膚測試模型表皮層的構(gòu)建

采用濃度為5~75μg/ml的多聚賴氨酸進行小室底部的包被，將3代黑色素細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)）接種到小室進行皮膚模型的構(gòu)建，首先將黑素細胞均勻接種到小室中，在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)5小時，待黑素細胞完全貼壁，體外培養(yǎng)的7代的角質(zhì)形成細胞采用培養(yǎng)基a制成細胞懸液（懸液總量＝每個小室接種量（100~300μl）×小室個數(shù)），并接種到黑素細胞的上層，其中表皮層的構(gòu)建中黑色素細胞與角質(zhì)形成細胞的接種比例為1:10，接種的細胞密度為5×10⁶cells/cm²，加入培養(yǎng)基a在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中進行浸沒式培養(yǎng)1天，每天換液，形成含黑色素細胞的表皮層結(jié)構(gòu)。

步驟二、含黑色素的皮膚測試模型表皮層后期培養(yǎng)

將步驟二中未成熟的表皮結(jié)構(gòu)的體外測試皮膚模型置于培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)基b進行氣液面培養(yǎng)，使液面與皮膚模型表面平齊，每天換液，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，得到所述含黑色素的皮膚測試模型。

含黑色素的皮膚測試模型的后期鑒定

黑色素模型構(gòu)建完成后，進行uvb暴露（50mj/cm²），然后進行采用氫氧化鈉提取法(見徐寶軍《天然產(chǎn)物增白作用的初步篩選》)進行黑色素的提取，并用酶聯(lián)免疫印跡法檢測黑色素含量的變化趨勢，觀察黑色素模型后期的反應(yīng)情況。對照組為不進行uvb照射的結(jié)果，uvb組為每天采用uvb照射(劑量為50mj/cm²)，uvb+樣品組（化合物）為每天采用uvb照射(劑量為50mj/cm²)并在培養(yǎng)基中加入功效性原料進行功效驗證。結(jié)果見附圖8-10，圖8上排為氣液面0天的皮膚模型，中排為氣液面3天的皮膚模型，下排為氣液面9天的皮膚模型，其結(jié)果顯示：含黑色素的體外皮膚模型在受到外界刺激后會產(chǎn)生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成。圖9結(jié)果與表觀結(jié)果較吻合顯示：含黑色素的體外皮膚模型在受到外界刺激后會產(chǎn)生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成。圖10結(jié)果與表觀以及黑素含量檢測結(jié)果吻合顯示：含黑色素的體外皮膚模型在受到外界刺激后會產(chǎn)生黑色素的形成，化合物的加入可抑制外界刺激后黑色素的形成以及轉(zhuǎn)移。

盡管以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方案進行了描述，但本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方案，上述的具體實施方案僅僅是示意性的、指導性的，而不是限制性的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本說明書的啟示下，在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所保護的范圍的情況下，還可以做出很多種的形式，這些均屬于本發(fā)明保護之列。