專利名稱:固定化細(xì)胞色素p450bm-3的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及固定化酶生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其一種涉及固定化細(xì)胞色素P450BM-3的制備方法。
背景技術(shù):
酶在食品、輕工、醫(yī)藥、化工、分析檢測(cè)、環(huán)境保護(hù)和科學(xué)研究等方面的應(yīng)用均取得了顯著成效。然而由于酶的穩(wěn)定性較差,易變性失活;酶反應(yīng)后與底物和產(chǎn)物混合在一起,難于回收,造成了浪費(fèi),此外還給產(chǎn)物分離帶來(lái)困難。將酶人工固定,制成固定化酶,不僅使酶可以回收,反復(fù)或連續(xù)使用,降低成本,還提高了酶的穩(wěn)定性,簡(jiǎn)化了產(chǎn)物的提純工藝。酶的固定化方法可分為結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法三大類。包埋法可分為網(wǎng)格型和微囊型兩種,將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型;將酶包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng),很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu),酶活回收率較高,是應(yīng)用最廣泛的方法。
細(xì)胞色素P450 BM-3又稱CYP102,來(lái)源于Bacillus megaterium,能溶于水,是一種長(zhǎng)鏈脂肪酸(C12-C20)ω-羥化酶,能催化飽和或不飽和脂肪酸的末端氧化和環(huán)氧化。P450 BM-3的分子量為117,641Da,由兩個(gè)不同的區(qū)域組成,一部分包含有FAD和FMN還原酶,另一部分是血紅素蛋白,共同組成一條多肽鏈,heme部位能結(jié)合底物和吸收氧氣,黃素部位(FAD和FMN)能從NADPH接受電子并將其轉(zhuǎn)移到血紅素活性位點(diǎn)。
目前,通過(guò)定向進(jìn)化得到的P450 BM-3突變體(如F87V、L188G和A74G)進(jìn)一步拓展了底物,能羥化短碳鏈的烷烴和烷酸(C8-C10)、環(huán)烷烴、芳烴和雜環(huán)化合物等等。
細(xì)胞色素P450 BM-3作用于烷烴、脂肪酸等,通常顯示出高度的底物和立體選擇性。它能在C-H鍵中引入一個(gè)氧原子,產(chǎn)生光學(xué)純的化合物,此外,可被用于使立體和位置選擇性的化合物加單氧化作用以產(chǎn)生重要的生物活性,如將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為14,15-EET。由于底物結(jié)構(gòu)通常是疏水化合物,而產(chǎn)物的水溶性更高,因此P450 BM-3可用于處理環(huán)境有毒物質(zhì),如多環(huán)芳烴。綜上所述,細(xì)胞色素P450 BM-3在醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境檢測(cè)和保護(hù)及化學(xué)合成等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
然而,天然P450 BM-3價(jià)格非常昂貴,極易失活,十分不穩(wěn)定。因此這些缺陷成為P450 BM-3廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸,而固定化P450 BM-3無(wú)疑是較好的選擇之一,它能克服游離酶的一些缺點(diǎn),提高P450 BM-3的穩(wěn)定性,延長(zhǎng)其活性的保留時(shí)間。還能使固定化P450 BM-3應(yīng)用于生物反應(yīng)器。
NaCS-PDMDAAC于20世紀(jì)80年代初由民主德國(guó)科學(xué)院高分子化學(xué)所的Dautzenberg博士首先開(kāi)發(fā)出來(lái)。該微膠囊由纖維素硫酸鈉(NaCS)和聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDMDAAC)等兩種水溶性聚合物電解質(zhì)經(jīng)過(guò)反應(yīng)制得。通過(guò)NaCS與PDMDAAC反應(yīng)制備的膠囊,是一層厚度約為20-100μm的多孔性膜圍成的中空微囊。膠囊有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度,可以承受3-6牛頓的正面壓力。而且多孔性膜的物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不受光熱影響,在pH2~10范圍內(nèi)都不發(fā)生變化,不溶于大部分的有機(jī)溶劑。此外,該膜還具備良好的生物相容性,對(duì)微生物和動(dòng)植物細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性。
從歐洲專利EP1196603已知,P450 BM-3被固定化在以下幾種介質(zhì)Glasperlen 100-200μm(Schueller)、Amberlite XAD16、Dowex50 WX4和EP-100上,殘余酶活依次為3.1%、15.2%、9.1%和18.2%。此固定化方法酶活回收很低,且借助物理吸附固定化,酶易從介質(zhì)上脫落下來(lái)。2003年,Maurer Steffen等研究共固定P450 BM-3和NADPH依賴的甲酸脫氫酶于正硅酸乙酯溶膠-凝膠中。固定化酶的相對(duì)活力為52.4%,室溫下半衰期為29天,在4℃貯存36天無(wú)活力損失。但此固定化過(guò)飛十程需在4℃冷藏至少3天,然后再需凍干48h以上。整個(gè)制備過(guò)程比較復(fù)雜,周期也很長(zhǎng),而且此過(guò)程酶也很容易失活。
大腸埃希氏菌(ZJMLH-01)CGMCC No1185于2004年7月6日,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是提供一種NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化P450 BM-3的制備方法。
它是在0~10℃溫度下,按質(zhì)量比6~15∶100將細(xì)胞色素P450 BM-3粗酶液混勻于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6~5.1%的纖維素硫酸鈉(NaCS),用4~7號(hào)針頭滴入2~3倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4~8%的聚二甲基二丙烯基氯化銨(PDMDAAC)中,再繼續(xù)攪拌30~60min,然后用去離子水或緩沖液洗滌三次,吸干即可。
本分明充分利用了NaCS-PDMDAAC微膠囊良好的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性,多孔性膜的物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不受光熱影響,在pH2~10范圍內(nèi)都不發(fā)生變化,不溶于大部分的有機(jī)溶劑。本發(fā)明的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便,條件溫和;固定化酶穩(wěn)定性好;能用于生物反應(yīng)器,具有工業(yè)應(yīng)用的前景。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明的固定化P450 BM-3的性質(zhì)固定化P450 BM-3的最適pH是7.8,比游離P450 BM-3的pH8.0略有下降。
固定化P450 BM-3的最適溫度為42℃,比游離P450 BM-3的37℃有所提高。
固定化P450 BM-3在0~25℃范圍內(nèi)酶活基本不變,比游離P450 BM-3對(duì)熱穩(wěn)定性大大提高。
固定化P450 BM-3在pH7.0~8.0間活力穩(wěn)定,這與游離P450 BM-3較一致。
固定化P450 BM-3在4℃下貯存30天,酶活損失22.3%,而同樣條件下游離酶酶活降為12.3%。
實(shí)施例11.粗酶液的提取發(fā)酵所得菌體以5ml緩沖液/(3g濕菌體)溶解,懸浮后在冰浴中超聲3min左右(200W,超聲時(shí)間2s,間隙時(shí)間5s,工作次數(shù)75)。破胞液于4℃,8000r/min離心20min,上清液即為粗酶液。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為39.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為19.7%。
實(shí)施例21.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為39.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.5%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.2%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用60mMTris-Hcl(pH7.5)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為19.4%。
實(shí)施例31.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為39.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的3.6%的NaCS混合,用7#針頭滴入40ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH7.8)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為17.3%。
實(shí)施例41.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為62.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為26.8%。
實(shí)施例51.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為62.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH7.5 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為22.0%。
實(shí)施例61.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為62.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.5 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為20.1%。
實(shí)施例71.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為62.5U/gPro)與18.8mL溶于25mM pH8.2 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為23.7%。
實(shí)施例81.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為119U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為28.2%。
實(shí)施例91.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為119U/gPro)與18.8mL溶于10mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為14.0%。
實(shí)施例101.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為119U/gPro)與18.8mL溶于75mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為23.1%。
實(shí)施例111.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取3ml粗酶液(比活為39.5U/gPro)與17mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的5.1%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.2%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為13.5%。
實(shí)施例121.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取2ml粗酶液(比活為39.5U/gPro)與18mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.5%的NaCS混合,用4#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.0%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為15.6%。
實(shí)施例131.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為33.8U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.0%的PDMDAAC(分子量<200,000)中,再繼續(xù)攪拌60min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為23.2%。
實(shí)施例141.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為33.8U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.0%的PDMDAAC(分子量200,000~350,000)中,再繼續(xù)攪拌60min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為25.1%。
實(shí)施例151.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為33.8U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.2%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.0%的PDMDAAC(分子量350,000~450,000)中,再繼續(xù)攪拌60min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為37.0%。
實(shí)施例161.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為94.8U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0 Tris-Hcl緩沖液的4.7%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.0%的PDMDAAC(分子量350,000~450,000)中,再繼續(xù)攪拌60min,然后用50mMTris-Hcl(pH8.0)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為32.5%。
實(shí)施例171.粗酶液的提取同實(shí)施例1。
2.酶的固定化取1.2ml粗酶液(比活為39.5U/gPro)與18.8mL溶于50mM pH8.0磷酸鹽緩沖液的4.5%的NaCS混合,用6#針頭滴入50ml溶于相同條件緩沖液的6.2%的PDMDAAC(分子量350,000~450,000)中,再繼續(xù)攪拌40min,然后用60mMTris-Hcl(pH7.5)洗滌三次,吸干。相對(duì)酶活為34.7%。
權(quán)利要求
1.一種NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化細(xì)胞色素P450 BM-3的制備方法,其特征在于在0~10℃溫度下,按質(zhì)量比6~15∶100將細(xì)胞色素P450 BM-3粗酶液混勻于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6~5.1%的纖維素硫酸鈉(NaCS),用4~7號(hào)針頭滴入2~3倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4~8%的聚二甲基二丙烯基氯化銨(PDMDAAC)中,再繼續(xù)攪拌30~60min,然后用去離子水或緩沖液洗滌三次,吸干即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化細(xì)胞色素P450BM-3的制備方法,其特征在于所說(shuō)的細(xì)胞色素P450 BM-3粗酶液為CGMCCNo.1185重組大腸埃希氏菌細(xì)胞破碎液直接離心后所得的上清液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化細(xì)胞色素P450BM-3的制備方法,其特征在于所說(shuō)NaCS和PDMDAAC均溶于10~75mM pH7.5~8.5的緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化細(xì)胞色素P450BM-3的制備方法,其特征在于所說(shuō)的緩沖液為T(mén)ris-Hcl或磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種NaCS-PDMDAAC微膠囊固定化細(xì)胞色素P450 BM-3的制備方法。它是在0~10℃溫度下,按質(zhì)量比6~15∶100將細(xì)胞色素P450 BM-3粗酶液混勻于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6~5.1%的纖維素硫酸鈉(NaCS),用4~7號(hào)針頭滴入2~3倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4~8%的聚二甲基二丙烯基氯化銨(PDMDAAC)中,再繼續(xù)攪拌30~60min,然后用去離子水或緩沖液洗滌三次,吸干即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,條件溫和;固定化酶穩(wěn)定性好;能用于生物反應(yīng)器,具有工業(yè)應(yīng)用的前景。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1597947SQ200410053250
公開(kāi)日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日
發(fā)明者梅樂(lè)和, 楊建麗, 譚培生, 姚善涇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)