專利名稱：一種單一型黑色素及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種黑色素及其合成方法和在藥品及化妝品中的應用。
背景技術：
黑色素(melanin)是不溶于水和幾乎所有溶劑的無定形小顆粒，黑色素廣泛存在于動植物和微生物中的非均質的類多酚聚合體。目前天然黑色素的提取主要是用動物組織 (烏骨雞、章魚等)、植物(黑米、黑芝麻等)、微生物(產(chǎn)黑色素放線菌、真菌等)。黑色素的應用廣泛，能作為紫外線吸收劑、抗氧化劑、自由基清除劑、陽離子螯合劑和新型天然的藥物載體，也可用來治療某些與黑色素缺乏有關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。另外，黑色素在化妝品、染發(fā)劑的裝飾作用以及生物殺蟲劑的光保護劑等方面有著廣闊的應用前景。早在1%4年Commoner在研究蛙卵的黑素組織工作中就提出黑素可以俘獲自由基，并把他們穩(wěn)定在黑素基質中，亦即說明黑色素中含有自由基。電子順磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)的工作原理是未成對電子在外加磁場中吸收微波輻射會改變電子自旋的狀態(tài)，所以Era波譜可以用來檢測自由基是否存在、自由基濃度、順磁性物質的電子順磁共振光譜及證明自由基的結構，波峰大小代表未成對電子含量的多寡。由于黑色素不溶于水和其他的有機容易，不能用核磁共振等技術測定其復雜的結構，而紅外光譜anfrared Spectroscopy, IR)可以測試固態(tài)的樣品，且測試迅速，操作方便，重復性好，靈敏度高。頂能夠提供許多關于官能團的信息，可以幫助確定部分乃至全部分子類型及結構，常用來測定黑色素等固態(tài)樣品。目前已知的黑色素是復合型黑色素，尚未見單一型黑色素的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的問題是公開一種單一型黑色素及其制備方法和在藥品及化妝品中的應用。本發(fā)明所述黑色素的特征是黑色的高分子聚合物，不溶于水、強酸和其他有機溶劑，微溶于強堿，EI5R測試顯示其含有1，8-DHN自由基。本發(fā)明所采用的技術方案是一是以1，8_ 二羥基萘為原料在酸性條件下與等摩爾的NaNOJt用，產(chǎn)物過濾后沉淀用乙酸乙酯洗三次，得到的黑色粉末即為粉末狀 DHN-melanin。二是以1，8-二羥基萘為原料在pH5的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液中加入真菌TLOl胞外粗蛋白(含有漆酶)進行催化，反應液用乙酸乙酯萃取，水相/有機相界面有不溶物，收集不溶物，分別用水、甲醇漂洗，晾干后得到片狀DHN-melanin。一、粉末狀DHN-melanin的制備方法
(1)將1，8-DHN加入酸性緩沖液中，攪拌，
(2)攪拌過程中不斷加入NaNO2至等摩爾，室溫攪拌半小時，
(3)將反應產(chǎn)物過濾，得到的沉淀分別用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗兩次，
(4)沉淀自然晾干，經(jīng)過EI3R測試、IR測試、電鏡觀察證實為粉末DHN-melanin。
二、片狀DHN-melanin的制備方法
(1)硫酸銨濃縮法制備真菌IFB-TLOl(Maldinia eschscholzii IFB-TL01，現(xiàn)保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCCM 207198，保藏日期是2007. 12. 13)胞外粗蛋白，利用ABTS法測定粗蛋白中含有漆酶等氧化酶，
(2)粗蛋白的最適pH在5，在IOmlpH5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中加入5 mg 1， 8-DHN、200U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反應 8 h,
(3)將反應液用乙酸乙酯萃取，有機相/水相界面有不溶物，將不溶物收集，分別用甲醇、水漂洗兩次，晾干后得到片狀黑色固體，經(jīng)過EI3R測試、頂測試、電鏡觀察證實為片狀 DHN—melanin。melanin的EPR測試說明片狀DHN-melanin相對粉末狀DHN-melanin含有較多的自由基。電鏡結果顯示粉末狀DHN-melanin是不均一的顆粒，大小在400-1200 nm之間；片狀DHN-melanin是不規(guī)則片狀。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在公開了一種單一型的黑色素的制備方法，可以用在化妝品中起抗氧化和射線、清除自由基的作用，可以用在染發(fā)劑中起裝飾作用，也可用在生物殺蟲劑方面起光保護劑的作用。


圖1為粉末狀DHN-melanin的電鏡照片圖2為粉末狀DHN-melanin的EI3R測試3為粉末狀DHN-melanin的頂測試圖
圖4為片狀DHN-melanin的電鏡照片圖5為片狀DHN-melanin的ESR測試6為片狀DHN-melanin的頂測試圖。
具體實施例方式通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限定。實施例1 粉末狀DHN-melanin的制備方法
1)將1，8-DHN慢慢加入檸檬酸-Na2HPO4緩沖液(pH5.0 )中，攪拌，
2)攪拌過程中不斷加入IM的NaNO2溶液至等摩爾，室溫攪拌半小時，
3)將反應產(chǎn)物過濾，不溶物分別用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗兩次，
4)沉淀自然晾干，經(jīng)過EI3R測試、IR測試、電鏡觀察證實為粉末DHN-melanin。實施例2 硫酸銨濃縮法制備真菌eschscholzii IFB-TL01胞外粗蛋白真菌IFB-TLOl在PDA平板上活化，將新鮮的菌體塊接種到1 L錐形瓶中，每瓶含有400
mL的ME培養(yǎng)基，接種5 - 6瓶于搖床上，在150 — 200 rpmJ8°C條件下培養(yǎng)4天后，將菌體過濾，菌液在4°C，10，000 rpm離心20 min出去殘留菌絲體；菌液中緩慢加入硫酸銨，使其終濃度為80%(每升菌液加入516g硫酸銨)，4°C下磁力攪拌器攪拌過夜使蛋白充分沉淀； 4°C下10，OOOrpm離心20 min后去除上清；沉淀用適量檸檬酸-Na2HPO4緩沖液溶解(濾紙過濾除去不溶物)；置于透析袋中透析；之后將酶液進行凍干成褐色粉末。
實施例3 真菌IFB-TLOl胞外粗蛋白酶活測定
參照Robort Bourbounais方法，以3-乙基苯并噻唑_6_磺酸(ABTQ為底物，測定酶對其的氧化速率。具體方法為反應在室溫下進行，總反應體積為3 ml，包括0.5 ml 0.5 mmol/L ABTS和1. 5 ml 0. 1 mmol/L檸檬酸，添加1 ml發(fā)酵液，在420 nm下測定其吸光值的變化，酶的單位定義為每分鐘酶液吸光值增加量Δ 0D420/ (ml. min)，證明TLOl胞外粗蛋白有漆酶(或氧化酶)活性。實施例4 片狀DHN-melanin的制備方法
1)硫酸銨濃縮制備的粗蛋白的最適PH在5，在IOmlpH5的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液中加入 5 mg 1，8-DHN、200 U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反應 8 h，
2)將反應液用乙酸乙酯萃取，有機相/水相界面有不溶物，將不溶物收集，分別用甲醇、水漂洗兩次，晾干后得到片狀黑色固體，經(jīng)過EI3R測試、頂測試、電鏡觀察證實為片狀 DHN—melanin。實施例5 兩種melanin的· OH自由基清除活性測定
1)所需溶劑=CuSO4溶液，1. 14 mmol/ L ；苯甲酸溶液，0. 925 mmol/ L ；抗壞血酸(AA)， 0. 97mmol/ L溶液(使用前配制)；磷酸鹽緩沖溶液，pH7. 40。2)在IOmL的試管中依次分別加入5. 00 mL pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液，0. 30 mL 1.14 mol/ L CuSO4 溶液，1.20 L 0.925 mmol/ L 苯甲酸和 LOOmL 97 μ mol/ L AA，定容至10 ml搖勻，在室溫下放置90 min，取200μ 1加到黑色的96孔板上，然后在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為四4 nm和414 nm下測定相對熒光強度。3)在以上體系中加入一定量的黑色素，測定熒光強度為Fs，未加黑色素的空白體系，其熒光強度為Ftl ；未加抗壞血酸及黑色素的體系，其熒光強度為F，則清除率
權利要求
1.一種單一型黑色素，其特征是黑色的高分子聚合物，不溶于水、強酸和其他有機溶劑，微溶于強堿，Era測試顯示其含有1，8-DHN自由基，紅外光譜。
2.根據(jù)權利要求1所述單一型黑色素的制備方法，其特征是由下列步驟組成(1)粉末狀DHN-melanin1)將1，8-DHN加入酸性緩沖液中，攪拌，2)攪拌過程中不斷加入NaNO2至等摩爾，室溫攪拌半小時，3)將反應產(chǎn)物過濾，得到的沉淀分別用乙酸乙酯、甲醇、水漂洗兩次，4)沉淀自然揮干，經(jīng)過ESR測試、電鏡觀察證實為粉末DHN-melanin；(2)片狀DHN-melanin1)硫酸銨濃縮法制備真菌eschscholziiIFB-TL01胞外粗蛋白，利用ABTS 法測定粗蛋白中含有的漆酶，2)粗蛋白的pH為5，在10ml pH5的檸檬酸-Nei2HPO4緩沖液中加入5 mg 1，8_DHN、 200U 的粗蛋白，28°C，180 rpm 反應 8 h，3)將反應液用乙酸乙酯萃取，有機相/水相界面有不溶物，將不溶物收集，分別用甲醇、水漂洗兩次，涼干即得到片狀黑色固體，經(jīng)過ESR測試、電鏡觀察證實為片狀 DHN-melaninο
3.權利要求1所述單一型黑色素在清除羥自由基中的應用。
4.權利要求1所述單一型黑色素在制備化妝品中起抗氧化和射線、清除自由基的作用。
5.權利要求1所述單一型黑色素在制備染發(fā)劑中起裝飾作用。
6.權利要求1所述單一型黑色素在制備生物殺蟲劑中起光保護劑作用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種單一型黑色素及其制備方法和在藥品及化妝品中的應用本發(fā)明一是以1，8-二羥基萘為原料在酸性條件下與NaNO2作用得到的黑色粉末即為粉末二羥基萘－黑色素(DHN-melanin)；二是以1，8-二羥基萘在真菌DaldiniaeschscholziiIFB-TL01胞外粗蛋白的催化下得到片狀的DHN-melanin。得到的兩種形態(tài)的黑色素均有較強的羥基自由基清除活性。本發(fā)明可以用在化妝品中起抗氧化和射線、清除自由基的作用，可以用在染發(fā)劑中起裝飾作用，也可用在生物殺蟲劑方面起光保護劑的作用，適用于藥品及化妝品等生物醫(yī)藥技術領域。
文檔編號C12P1/02GK102225995SQ20111009949
公開日2011年10月26日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權日2011年4月20日
發(fā)明者宋勇春, 宋雅男, 汪偉, 沈薇, 譚仁祥 申請人:南京大學