專利名稱：探針法檢測cho細胞dna含量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種定量檢測CHO細胞DNA(即中國倉鼠卵巢細胞基因組DNA)含量的方法。
背景技術：
基因工程領域所用基因表達系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的糖基化修飾，因而表達產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質分子。哺乳動物細胞的規(guī)模化生產技術也日漸成熟和完善。因此，通過哺乳動物細胞培養(yǎng)表達制備治療性重組蛋白質藥物已經成為當今生物制藥領域的主流技術，目前已經上市和正在進行臨床試驗的蛋白質藥物中，70%來自于哺乳動物細胞， 而這其中CHO細胞是最常用的細胞系。為了確保治療性重組蛋白質藥物的產品質量，歐美食品和藥品管理局以及我國國家食品藥品監(jiān)督管理局都對藥品中宿主細胞殘留DNA量提出了明確的要求。分子雜交分析以及Threshold immunoassay分析具有靈敏度低、耗費時間長、不易定量檢測等缺陷?；蚩截悢?shù)是指某一種基因或某一段特定的DNA序列在基因組中出現(xiàn)的次數(shù)。對 CHO細胞基因工程細胞株進行基因拷貝數(shù)的分析對于評價基因工程細胞株的穩(wěn)定性、遺傳特性具有重要的意義。而選擇合適的內參是準確分析某一特定基因拷貝數(shù)的基礎。定量PCR是在PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR 技術是一種在PCR反應體系中加入熒光染料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術具有靈敏度高、特異性強、結果準確、 自動化程度高和實時性等特點。Taqman探針是基于與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對的一類寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’端，而淬滅基團則在3’末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。 隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數(shù)量呈正比關系。Taqman探針技術因其靈敏度較高，特異性強，是目前備受推崇的熒光定量PCR 使用技術。MGB探針的淬滅基團采用非熒光淬滅基團，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。本發(fā)明的熒光PCR方法采用Taqman探針技術，克服傳統(tǒng)檢測方法靈敏度低、實施費用高等缺點，提供一種簡單、廉價、準確率高的定量熒光PCR檢測方法以及用于該方法的試齊U盒。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種使用實時熒光PCR技術來定性與定量檢測CHO細胞DNA 的方法，本方法可用于檢測治療蛋白質藥物、重組疫苗及單克隆抗體等產品CHO細胞殘留DNA，從而對重組蛋白質藥物生產過程進行質量監(jiān)測。本發(fā)明采用GeneBank登錄號為EF540878. 1的核苷酸序列，設計特異引物和 Taqman探針，以提取的CHO細胞基因組DNA為模板進行熒光定量PCR。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，采用GeneBank登錄號為EF540878. 1 的核苷酸序列設計特異性引物對及Taqman探針，對待測樣本提取DNA后進行實時熒光定量 PCR，根據(jù)所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。所述待檢樣本可為但不限于CHO細胞表達或生產的治療蛋白質藥物、重組疫苗或單克隆抗體。所述的特異引物對序列為Primer-F 的核苷酸序列為5，-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3，(SEQ ID NO 1)；Primer-R 的核苷酸序列為5，-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，(SEQ ID NO 2)；所述Taqman探針序列核苷酸為Probe :5，-CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，(SEQ ID NO :3)。其中所述Taqman探針的5’端標記有熒光報告基團，熒光報告基團優(yōu)選為FAM，也可為其它具有相似功能的基團，3’端標記有淬滅基團，淬滅基團為MGB或BHQ1，也可為其它具有相似功能的基團。所述實時熒光定量PCR檢測反應體系中含有DNA模板、Taq酶、dNTPs、Rox染料、 Mg2+、PCR緩沖液、Taqman探針、正向引物和反向引物。Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg2+及PCR 緩沖液均為常見組分，其含量亦為常規(guī)。一般而言，所述PCR反應體系中，正向引物濃度為0. 2-lymol/L，反向引物濃度為0. 2-1 μ mol/L，探針濃度為0. 2-3ymol/L, Taq酶用量為 50000-200000U/L，dNTP 含量為 0. 1-0. 5mM/L, Mg2+ 濃度為 3. 0-6. OmM/L，引物總濃度為 0. 4-2. 0 μ mol/L, PCR緩沖液則稀釋為IX。反應體系一般可設為30 μ L。所述DNA模板可以來自待測樣本，也可以來自參考品或陽性質控品。所述實時熒光定量PCR中，每次檢測均設立參考品，陰性質控品和陽性質控品。參考品為CHO細胞基因組DNA，其DNA濃度可為1. 0X 107_5. 0X 107fg/μ L，如3. 0X107fg/ ul。使用時用DNA稀釋液稀釋成7個濃度梯度，分別為3.0X105fg/y l,3.0X104fg/y 1, 3. OX 103fg/ μ 1，3. 0X 102fg/ μ 1，3. 0X 101 / μ 1，及 3. Ofg/ μ 1。其中陽性質控品為 CHO 細胞基因組DNA，濃度可為3. OX 103fg/ul，陰性對照品為純水。所述DNA稀釋液可為常規(guī)。 優(yōu)選由EDTA、NaOH和iTris-HCl溶液配制而成，其中iTris-HCl濃度為5. 0-10. OmM/L, EDTA 的濃度為0. 5-1. OmM/L,用NaOH溶液調節(jié)pH為6. 0-8. 5。該DNA稀釋液能高效稀釋低濃度的DNA樣品，而且適合于PCR擴增。所有待檢樣品均需通過提取后溶解于DNA稀釋液或純水中。實時熒光定量PCR反應程序優(yōu)選為95°C預變性IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)。根據(jù)所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。基于上述熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，本發(fā)明還進一步提供了一種熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的試劑盒，包括PCR擴增反應液、參考品、陰性質控品、陽性質控品以及DNA稀釋液，所述PCR擴增反應液含有Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg2+、PCR緩沖液、正向引物、反向引物以及Taqman探針，其中，所述正向引物、反向引物及Taqman探針為Genebank登錄號為EF540878. 1序列的特異性引物及探針。較佳的，試劑盒中，所述正向引物、反向引物及Taqman探針的核苷酸序列如前所述。所述PCR擴增反應液中，正向引物濃度為0.2-1.0ymol/L，反向引物濃度為
0.2-1. Oymol/L, Taqman 探針濃度為 0. 2-3. Oymol/L, Taq 酶用量為 50000-200000U/L， dNTP 含量為 0. 1-0. 5mM/L，Mg2+濃度為 3. 0-6. OmM/L，引物總濃度為 0. 4-2. 0 μ mol/L，PCR 緩沖液則稀釋為IX。所述參考品為CHO細胞基因組DNA，其CHO細胞基因組DNA的濃度可為
1.OX 107-5. 0X 107fg/y L，如3. 0X107f g/ul。其中陽性質控品為CHO細胞基因組DNA，濃度可為3. OX 103fg/ul，陰性對照品為純水。所述DNA稀釋液可為常規(guī)。優(yōu)選由EDTA、Na0H和 Tris-HCl溶液配制而成，其中iTris-HCl濃度為5. 0-10. 0mM/L, EDTA的濃度為0. 5-1. OmM/ L，用NaOH溶液調節(jié)pH為6. 0-8. 5。本發(fā)明的試劑盒可以與常規(guī)市購DNA提取試劑盒組合使用，也可進一步包括DNA 提取液，所述DNA提取液可采用常規(guī)市購的DNA提取試劑盒中所含試劑。本發(fā)明提供的實施熒光定量PCR方法可以定量檢測出CHO細胞DNA的濃度低于 3. Ofg/ul，表明本方法具有非常好的靈敏度，且具有較高的特異性。本發(fā)明提供的實時熒光定量PCR方法可以檢測重組蛋白產程中間樣品、半成品、 成品等樣品中的CHO細胞殘留DNA，還為分析CHO細胞中特定基因的拷貝數(shù)提供內參?？梢詾橹亟M蛋白藥物的生產提供可靠的質控證據(jù)，為重組蛋白藥物研發(fā)和安全生產提供重要支持。


圖1參考品擴增曲線。擴增曲線有明顯的指數(shù)增長期，每個濃度的擴增曲線均勻疊和在一起，表明本方法重復性好。圖2參考品標準曲線。由圖可知，當參考品濃度為3.0X105fgl·! l，3.0X104fg/ μ 1,3. 0X103fg/y 1,3. 0X102fg/y 1,3. OXIO'fg/y 1,3. Ofg/μ 1 時，樣品的 Ct 值為-之間，檢測下線低于3. Ofg/ul。繪制得到的標準曲線斜率為-3. 445，相關系數(shù)(R2) = 0.999， 擴增效率為95. 1%。標準曲線線性良好，檢測靈敏度可達到3. Ofg/μ 1。圖3樣品定量分析的擴增曲線。擴增曲線有明顯的指數(shù)增長期，表明提取樣品可用本方法進行定量分析。圖4樣品定量分析標準曲線。當參考品濃度為3.0X106fg/y l，3.0X105fgy 1， 3. 0X104fgy 1,3. 0X103fgy 1,3. OX 102fg/μ 1，3. OX 101 /μ 1,3. Ofg/μ 1 時，繪制得到的標準曲線斜率為-3. 351，相關系數(shù)(R2) = 1.0，擴增效率為98. 789%。標準曲線線性及擴增效率良好，所分析樣品均在標準曲線分析范圍內。圖5實施例3特異性分析擴增曲線圖6實施例3特異性分析標準曲線
具體實施例方式本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步說明，所列實例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1 熒光定量PCR法檢測CHO細胞DNA殘留的引物設計及參考品制備1、材料和試劑DNTPs, Taq DNA聚合酶、熒光染料及PCR緩沖液為市售產品，7500Fast熒光定量 PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司產品，DNA稀釋液由本實驗室采用分析純試劑配制，基因組 DNA提取試劑盒為美國Bio-Tek公司產品。2、引物及探針的設計與合成以 Genebank 登錄序列(Genebank 登錄號 EF540878. 1)為模板，使用 Primer Primer 5. 0軟件(美國I^remierBiosoft公司)設計PCR引物及探針，通過預實驗，從中選擇如下組合。Primer-F 的核苷酸序列為5，-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3，；Primer-R 的核苷酸序列為5，-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，；Probe :5， -CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，弓丨物及探針由上海生工生物工程有限公司合成。3、檢測參考品制備及檢測培養(yǎng)CHO細胞，離心收集細胞，用PBS無菌洗滌2次，按基因組DNA提取試劑盒說明書提取CHO細胞基因組DNA，分光光度法測定其在260nm(A-260)測定其濃度并稀釋成 30ng/y l(3.0X107fg/y 1)，分裝后_20°C儲存，作為參考品使用。取7支新的1. 5mL低吸附離心管，分別標記為SDO、SDl、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6， 向每管中各加入45 μ L DNA稀釋緩沖液(Tris-HCl 10mM/L, EDTA ImM/L，pH為8)。SDO管中加入5yL CHO DNA參考品(3.0X107f g/ul)，渦旋混勻器充分混勻，之后每一管依次加入5 μ L上一濃度梯度稀釋液，各管加入DNA后均用渦旋混勻器充分混勻，再進行下一個梯度稀釋。參考品制備后，配置如下PCR反應體系PCR 體系=PCR 緩沖液(IOX) 3. O μ 1 ；dNTP (2mM/L) 2. O μ 1 ；MgCl2 (50mM/L) 2. O μ 1 ； Rox 染料(50Χ)0·6μ 1 ；正向引物(ΙΟμπιοΙ/υ .Ομ 1 ；反向引物(ΙΟμπιοΙ/υ .Ομ 1 ；探針 (10ymol/L)l. 5μ 1 Taq 酶(50U/μ 1)0. 1μ 1 ；模板 9.5 μ 1 ；純水 9.3 μ 1。PCR反應體系配置完成后，在ABI 7500Fast型熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR條件為95°C預變性IOmin ；95°C 15s，60°C 60s, 40個循環(huán)；分析標準曲線。實驗結果如圖1，圖2所示。實施例2熒光定量PCR法檢測CHO細胞DNA濃度在分析CHO細胞基因拷貝數(shù)的應用1、目的為分析目的基因的基因拷貝數(shù)提供內參。2、制備 CHO 細胞 DNA收集不同細胞株、不同傳代次數(shù)的CHO細胞，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組 DNA，先用分光光度法初步測定所提基因組DNA的濃度，將樣品做適當稀釋，使各樣品在標準曲線范圍內。3、選用7個濃度的參考品，參考品濃度分別為3.0X106fg/l·! l，3.0X105fg/l·! 1，3. 0X104fg/y 1,3. 0X103fg/y 1，3. OX 102fg/μ 1,3. OX IOlfg/μ 1,3. Ofg/μ 1 參考實施例1所述方法進行定量PCR分析。擴增結果及標準曲線如圖3，圖4所示。4、通過定量PCR方法分析目的基因的表達情況，再以各個樣品CHO細胞DNA濃度為內參進行校正。實施例3熒光定量PCR法檢測CHO細胞殘留DNA的應用及特異性分析1、制備包括以下PCR擴增反應液及稀釋液PCR 體系=PCR 緩沖液(IOX) 3. 0 μ 1 ；dNTP (2mM/L) 2. 0 μ 1 ；MgCl2 (50mM/L) 2. 0 μ 1 ； Rox 染料(50Χ)0·6μ 1 ；正向引物(10μπιο1/υ ·0μ 1 ；反向引物(10μπιο1/υ ·0μ 1 ；探針 (10ymol/L)l. 5μ 1 Taq 酶(50U/μ 1)0. 1μ 1 ；模板 9.5 μ 1 ；純水 9.3 μ 1。DNA稀釋液以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為5. 0mM/L,EDTA的濃度為1. OmM/ L，用NaOH溶液調節(jié)pH為8. 0。2、樣品采集、運送和保存樣品采集包括各種用CHO細胞做為宿主細胞生產的重組蛋白藥物半成品、成品等，按照國家生物制品檢定所取樣要求進行操作，密封送檢。用作分析本方法特異性所用細胞株購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)、質粒為本實驗室自制。樣品保存和運送樣品可立即用于檢測，也可保存于-20°C待檢，保存期為6個月。 樣品運送時應保存于0°c -8°c。3、檢測步驟a)樣品處理與DNA提取本例測定樣品包括Wil2_S細胞基因組DNA(30pg/l·! 1)，正常人血清基因組DNA(批號CP18)，pHLXlOl質粒(IO7拷貝/ μ 1)，利妥昔單克隆抗體成品(羅氏公司，批號 Β6029)，HLX-01單克隆抗體半成品(本公司生產，批號RS20110102)，CHO細胞基因組DNA 樣品(提取的CHO基因組DNA做為陽性樣品，紫外分光光度法定量其濃度為30pg/ul)。采用磁珠富集法提取DNA。提取樣品時，同時提取陽性質控品及陰性質控品，陰性質控品用于判斷提取過程中有無污染，陽性質控品用于測定提取收率。所有待檢樣品均需通過提取后溶解于試劑盒所帶DNA稀釋液或純水中。b) PCR擴增與結果分析檢測時設立參考品，陰性質控品和陽性質控品。參考品使用時用DNA稀釋液稀釋成 6 個濃度梯度，分別為 3. 0X 105fg/ μ 1, 3. 0X 104fg/ μ 1, 3. 0X 103fg/ μ 1, 3. 0X 102fg/ μ 1，3. OXIOWg/y 1，及 3. Ofg/μ 1。PCR反應液配置完成后。在ABI 750(FaSt型熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，條件為95°C預變性IOmin ；95°C 15s,60°C lmin,40個循環(huán)。同時加參考品檢測作標準曲線。反應結束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。結果顯示，標準曲線相關系數(shù)為0.998，大于 0. 99，擴增效率為104%介于95% -105%之間。測定結果經儀器處理根據(jù)標準曲線計算出檢測樣品中CHO細胞DNA殘留量，樣品檢測結果如附圖5、圖6所示，其中Wi 12-S細胞基因組 DNA，正常人血清基因組DNA，pHLXlOl質粒，利妥昔單克隆抗體成品，HLX-01單克隆抗體原液，檢測結果Ct值均低于檢測下限；CHO細胞基因組DNA樣品的Ct值為19. 34，參照同一次實驗中線性定量參考品的標準曲線圖，可以判定樣品中CHO細胞殘留DNA的濃度為33. 7pg/ PL·結果表明本試劑盒具有較好的專一性。
實施例4試劑盒的制備本方法也可進一步開發(fā)為檢測試劑盒，實施例如下制備包括以下組成成分的試劑盒DNA稀釋液(lml/管)1管、PCR擴增反應液(lml/管)1管、陰性質控品(150 μ 1/ 管)2管、陽性質控品(150 μ 1/管)2管、參考品(50 μ 1/管)1管。陽性質控品為CHO細胞基因組DNA，濃度可為3. 0 X 103fg/ul。所述陰性對照品為純水。參考品為CHO細胞基因組DNA，濃度為3. 0 X 107fg/ul。DNA稀釋液(選自以下任一)配方一以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為5. OmM/L, EDTA的濃度為1. OmM/L, 用NaOH溶液調節(jié)pH為8. 5。配方二 以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為8mM/L，EDTA的濃度為0. 7mM/L,用 NaOH溶液調節(jié)pH為8.0。配方三以去離子水為溶劑，Tris-HCl濃度為10. OmM/L, EDTA的濃度為0. 5mM/L, 用NaOH溶液調節(jié)pH為6.0。PCR 擴增反應液Taq 酶 100000U/L，dNTP 含量為 0. 5mM/L, Mg2+ 濃度為 5mM/L，Rox 染料(50X)20ml/L, PCR緩沖液(IOX) 100ml/L，正向引物濃度為0. 5 μ mol/L，反向引物濃度為0. 5 μ mol/L, Taqman探針濃度為0. 8 μ mol/L,混合配置。試劑盒準備完成后，儲存于-20°C。
權利要求
1.一種熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，采用GeneBank登錄號為EF540878. 1 的核苷酸序列設計特異性引物對及Taqman探針，對待測樣本提取DNA后進行實時熒光定量 PCR，根據(jù)所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。
2.如權利要求1所述熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，其特征在于，所述的特異引物對包括正向引物I^rimer-F和反向引物I^rimer-R，其中Primer-F 序列為5，-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3，，Primer-R 序列為5’ -TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，；所述 Taqman 探針序列為5’ -CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，。
3.如權利要求1所述熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR檢測反應體系中含有DNA模板、Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg2+、PCR緩沖液、 Taqman探針、正向引物和反向引物。
4.如權利要求1所述熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR中，每次檢測均設立參考品，陰性質控品和陽性質控品。
5.如權利要求1所述熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR的反應程序為95°C預變性IOmin ；95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)。
6.如權利要求1-5任一所述熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的方法，其特征在于，所述待檢樣本可為但不限于CHO細胞表達或生產的治療蛋白質藥物、重組疫苗或單克隆抗體。
7.一種熒光定量PCR檢測CHO細胞DNA的試劑盒，包括PCR擴增反應液、參考品、陰性質控品、陽性質控品以及DNA稀釋液，所述PCR擴增反應液含有Taq酶、dNTPs、R0X染料、 Mg2+、PCR緩沖液、正向引物、反向引物以及Taqman探針，其中，所述正向引物、反向引物及 Taqman探針為Genebank登錄號為EF540878. 1序列的特異性引物及探針。
8.如權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述的特異引物對包括正向引物ft~imer-F 和反向引物I^imer-R，其中Primer-F 序列為5’ -ACAGGTTTCTGCTTCTGGCT-3’ ；Primer-R 序列為5’ -TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3，；所述 Taqman 探針序列為5’ -CTGTTCTAAGTAGACTGCGAGCCCT-3，。
9.如權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述PCR擴增反應液中，正向引物濃度為 0. 2-1. 0 μ mol/L,反向引物濃度為 0. 2-1. 0 μ mol/L, Taqman 探針濃度為 0. 2-3. 0 μ mol/L, Taq 酶用量為 50000-200000U/L，dNTP 含量為 0. 1-0. 5mM/L, Mg2+ 濃度為 3. 0-6. OmM/L，引物總濃度為0. 4-2. 0 μ mol/L, PCR緩沖液則稀釋為IX。
10.如權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述參考品為CHO細胞基因組DNA，所述陽性質控品為CHO細胞基因組DNA，所述陰性對照品為純水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種探針法檢測CHO細胞DNA含量的方法，采用GeneBank登錄號為EF540878.1的核苷酸序列設計特異性引物對及Taqman探針，對待測樣本提取DNA后進行實時熒光定量PCR，根據(jù)所獲得的標準曲線，計算得到待檢樣本中CHO細胞DNA的量。本發(fā)明還進一步公開了基于該方法的試劑盒。本發(fā)明可以精確定量檢測來源于CHO細胞的治療蛋白質藥物、重組疫苗及單克隆抗體等產品中CHO細胞殘留DNA含量，本方法還為分析CHO細胞中特定基因的拷貝數(shù)提供內參。
文檔編號C12Q1/68GK102154503SQ20111009920
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權日2011年4月20日
發(fā)明者劉世高, 周雙宬, 姜偉東, 張二輝, 郎國竣, 郭新軍, 馬辰 申請人:上海復宏漢霖生物技術有限公司