專利名稱：含原花色素作為活性成分的adp－核糖基化抑制劑和治療腸毒素型細菌感染性疾病的組合物的制作方法
治療腸毒素型細菌感染性疾病的組合物霍亂是一種死亡率很高的感染性疾病，它由霍亂弧菌引起，特征是以大量水樣腹瀉為主要癥狀?；魜y發(fā)生于全世界，特別是亞洲和非洲?；魜y的發(fā)病機理是霍亂弧菌經(jīng)口進入體內(nèi)，引起小腸內(nèi)腔粘膜感染并繁殖以產(chǎn)生霍亂毒素。霍亂毒素的結(jié)構由兩種蛋白亞基組成，它們已知是A和B亞基，正如痢疾桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、小腸出血性大腸桿菌等產(chǎn)生的毒素中具有的。B亞基與腸腔上皮細胞的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1受體位點結(jié)合。已知具有ADP-核糖基化酶活性的霍亂毒素的A亞基催化ADP-核糖基化作用，該作用活化腺苷酰環(huán)化酶系統(tǒng)中刺激性GTP-結(jié)合蛋白，已知稱為GSα，增高腸道上皮細胞中的cAMP水平，大量分泌水和電解質(zhì)，導致水性腹瀉(Med.Immunol.，21，359-365(1994)；Masatoshi Noda，SHONI-NAIKA(Children InternalMedicine)，28(9)，1186-1193(1996))。
目前霍亂通過輸液進行治療，輸液是一種系統(tǒng)性療法。實際上，至今未發(fā)現(xiàn)霍亂的基本治療方法和藥物。經(jīng)過廣泛的研究，本發(fā)明者之一Masatoshi Noda已經(jīng)開發(fā)出一種抑制引起腸道感染的細菌，如霍亂弧菌等產(chǎn)生的毒素的藥物，所述藥物使毒素不產(chǎn)生危害，參見“治療腸毒素型細菌感染的藥物”(日本專利申請?zhí)?-505177，Masatoshi Noda，Hajime Nishiya和Morimichi Yamaguchi)和“沒食子酸酯衍生物和含有它們作為活性成分的藥物”(日本專利申請公開10-273495，Masamichi Ueno，Izumi Takai，Hiroshi Ohi，Masakazu Adachi和Masatoshi Noda)。但是，前者由于使用草藥作為主要成分涉及生產(chǎn)成本等問題。后者需要進一步的研究，如安全性試驗(由于有效成分是合成化合物)。因此，后者要付諸實際使用將花費至少數(shù)年的時間。本領域目前的狀況是，仍沒有低價格的具有高度安全性的從天然存在的物質(zhì)衍生的藥物可用于治療腸毒素型細菌感染性疾病。因此，非常需要提供一種滿足上述要求的藥物。
本發(fā)明者對天然存在的物質(zhì)，尤其是由食用植物得到的具有下列性質(zhì)的那些物質(zhì)進行了廣泛的研究能抑制體內(nèi)毒素，如霍亂毒素催化的ADP-核糖基化作用，能抑制水性腹瀉，但對人體沒有副作用。結(jié)果，在食用植物提取物，如蘋果提取物、葡萄提取物等中發(fā)現(xiàn)了對ADP-核糖基化作用具有特別有效的抑制作用和對腸毒素型細菌感染性疾病具有治療活性的物質(zhì)。由此完成了本發(fā)明。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明中使用的有效成分之一的蘋果提取物基本上由多酚組成。本發(fā)明者已對這些多酚進行了組成特性、安全性、制備方法進行了廣泛的研究，以證實它們的功能和實用性，這些研究記載于日本專利申請?zhí)?-285876中。由其申請者制備的這些多酚已作為食品原料、食品添加劑、化妝品原料等在市場上銷售。實際上，這些市售產(chǎn)品被應用于各種食品、加工食品、化妝品等。作為進一步廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)這些多酚物質(zhì)顯示出ADP-核糖基化抑制作用，可有效地治療腸毒素型細菌感染性疾病；本發(fā)明者已鑒別出該物質(zhì)是一種多酚——原花色素。
原花色素是一種至少為二聚物物質(zhì)，它由具有類黃酮骨架的黃烷-3-醇或黃烷-3，4-二醇縮合或聚合而成(Hemingway，R.W.等人，Chemistry and Significance of Condensed Tannins，83-107)。已經(jīng)證實，例如蘋果提取物含有2-至15-聚原花色素(Ohnishi-Kameyana M.等人，Rapid Comm.Mass Spectrom.，11，31-36(1997))。
任何提取物均可用作本發(fā)明的活性成分，只要植物提取物含有2-至15-聚原花色素?？墒褂萌魏螣o關的植物原料，只要可以從植物原料獲得含有足量2-至15-聚原花色素的提取物。這些植物提取物可以是粗提物，但需含有至少一定量的2-至15-聚原花色素。提取物也可在分離為2-至15-聚原花色素或者進一步純化為4-至15-聚原花色素，更優(yōu)選分離為至少6聚體的原花色素(6-聚體)后使用。這些2-至15-聚原花色素，優(yōu)選4-至15-聚原花色素，更優(yōu)選至少6-聚的原花色素可按照日本專利10-184143中描述的方法進行分離和提取，該文獻引入本文以供參考。
含原花色素的食用植物的實例除蘋果外，還包括薔薇科植物草莓和覆盆子。除薔薇科以外的食用植物的實例是葡萄科的葡萄、獼猴桃屬的獼猴桃、杜鵑花科的烏飯樹和越橘、豆科的赤豆和羅望子、柿科的柿子樹、芭蕉科的香蕉、漆樹科的腰果、梧桐科的可可、日本橡樹、常綠橡樹、崖椒屬的栗子和pasanias以及大麻科的啤酒花。鑒于資源的有效利用和提取體積量大，其中，尤其可使用由于過剩而篩除的小蘋果和壓榨葡萄的殘渣中包含的葡萄籽。
本發(fā)明提供了一種ADP-核糖基化抑制劑，它含有由食用植物得到的原花色素作為有效成分；以及一種用于治療腸毒素型細菌性感染疾病的含有所述抑制劑的組合物。除原花色素外，本發(fā)明的抑制劑和組合物可進一步含有其它多酚、與有機酸或糖結(jié)合的原花色素及其溶劑化物，如水合物。本發(fā)明的抑制劑和組合物中也可含有從同種原料中獲得的其它成分。
含有從食用植物得到的原花色素作為有效成分的本發(fā)明藥物組合物可用于治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病，如由霍亂或肉毒桿菌引起的旅行者腹瀉。此外，由于本發(fā)明的藥物組合物具有特別有效的ADP-核糖基化抑制劑作用，因此也可有效地治療和/或預防其它感染性疾病，如白喉、百日咳、破傷風、機遇性感染等，據(jù)知這些疾病的暴發(fā)與ADP-核糖基酶密切相關。
含有從食用植物得到原花色素作為有效成分的本發(fā)明藥物組合物可使用制備藥物制劑常用的載體、賦形劑和其它添加劑制備。固體或液體載體和賦形劑都可用于制備藥物制劑。這類載體和賦形劑的實例包括乳糖、蔗糖、脂肪酸酯、糊精、硬脂酸鎂、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、橄欖油、芝麻油、可可脂、乙二醇等。
本發(fā)明的藥物組合物一般以片劑、丸劑、膠囊、顆粒、粉末、液體等形式口服給藥。對于每個具體病例，口服劑量可根據(jù)患者的適應癥、年齡、性別等適當決定，然而對于成年人，當以原花色素計算時，本發(fā)明組合物的日劑量一般為100mg-10g，優(yōu)選200mg-1g。該組合物可以大丸劑形式給藥，或者口服日劑量可分次給藥。當然，日劑量可根據(jù)各種情況進行改變，在某些情況下，小于上面給出的劑量就足夠了。
對于本發(fā)明組合物的口服給藥，可利用如片劑、粉末或顆粒形式的固體組合物。在這類固體組合物中，將由食用植物得到的原花色素與至少一種對活性成分惰性的稀釋劑混合。稀釋劑的實例包括乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、正硅酸和鋁酸鎂。如果需要，組合物還可含有除惰性稀釋劑外的其它添加劑。這類添加劑的實例包括潤滑劑，如硬脂酸鎂；崩解劑，如乙醇酸纖維素鈣；穩(wěn)定劑，如乳糖；且溶劑，如谷氨酸或天門冬氨酸。如果需要，片劑或丸劑可用蔗糖、明膠-羥丙基纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、還原palatinose、玉米醇溶蛋白等腸溶或胃溶涂膜包衣。
含由食用植物得到的原花色素作為有效成分的可用于口服的液體組合物呈可藥用乳液、溶液、懸浮液、糖漿、酏劑等形式。這些口服液體制劑還可含有常用的惰性稀釋劑，如純水或乙醇。除上述惰性稀釋劑外，該液體制劑還可含有潤濕劑、懸浮劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑(如乳糖)、輔助劑，如溶解助劑(如谷氨酸或天門冬氨酸)、甜味劑、著色劑、賦形劑和防腐劑。
本發(fā)明的由食用植物得到的原花色素還可用作食品添加劑。在這種情況下，原花色素可作為抗菌劑使用。當所應用的食品是液體，如牛奶、飲料、果汁等時，可在鄰飲用前將原花色素直接加到這些液體食品中。原花色素的用量為約50mg-1000mg/100ml液體。當將原花色素摻入主食，如意大利面、面包或稻米中時，在烹制或加工主食時，原花色素可以50mg-500mg/100g食品的量加到主食中。
即，將1μg霍亂毒素和一定量的表1所示的樣品與下列組成的反應混合物混合50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，5mM MgCl2，100μMGTP，100μM[腺嘌呤-14C]NAD(6000cpm)，20mM DTT，20mM胍丁胺和0.1mg/ml卵清蛋白(總計300μl)。使該混合物在30℃反應3小時。使50μl反應混合物通過Dowex AG1-X2填充柱(Φ5×20mm，Bio Rad，Inc.制造)。除去未反應的[腺嘌呤-14C]NAD，測定霍亂毒素的ADP-核糖基化作用產(chǎn)生的[腺嘌呤-14C]ADP-核糖基化胍丁胺的放射活性。測定用作該[腺嘌呤-14C]ADP-核糖基化胍丁胺形成指示的每份樣品中霍亂毒素的ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性的抑制。結(jié)果示于表1。附

圖1還給出了蘋果提取物的濃度與ADP-核糖基化抑制活性之間的關系。
表1霍亂毒素抑制率(％)
*1蘋果提取物IC 50＜10μg/ml*2對霍亂毒素具有陽性反應的患者日本專利申請?zhí)?-505177。
在該試驗中，當按照Porter方法以原花色素B2計算時，蘋果提取物和葡萄提取物分別含51％和63％原花色素。試驗實施例2通過結(jié)扎兔小腸回路方法的分析據(jù)知霍亂毒素ADP-核糖基化物Gsα(也稱為胞內(nèi)蛋白質(zhì)G)致使腸袢上皮細胞中腺苷?；h(huán)化酶持續(xù)活化、cAMP水平增高以及水和電解質(zhì)的大量分泌，導致水樣腹瀉。為測定抑制由霍亂毒素引起的腹瀉的活性，通過De等人報道的結(jié)扎兔回路的方法(De S.N.和D.N.Chatterje，J.Pathol.Bacteriol.，66，559(1953))測定水樣腹瀉中，蘋果提取物的體液累積活性。即，每隔15cm結(jié)扎兔的回腸以形成數(shù)個封閉的腸系統(tǒng)回路。在給予每個回路1μg霍亂毒素和一定量的樣品后，將小腸回路放入兔體內(nèi)。使兔保持盡可能的舒適，18小時后，測定霍亂毒素引起的體液積累。
結(jié)果表明蘋果提取物在50μg/回路劑量下幾乎完全抑制由1μg霍亂毒素引起的體液積累。這些結(jié)果證實了本發(fā)明描述的食用植物提取物及其有效成分原花色素作用于霍亂毒素，抑制ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶活性，因此與草藥“大黃”的提取物一樣，表現(xiàn)出抗霍亂毒素的活性。
工業(yè)實用性含原花色素作為活性成分的本發(fā)明ADP-核糖基化抑制劑可有效地治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病。上述的這類食用植物提取物中含有的原花色素作為活性成分的安全性已經(jīng)得到肯定，因為在長期的人類歷史中，產(chǎn)生原花色素的植物都被用作食用植物。即便如此，在原花色素被用作食品添加劑前，通過急性毒性試驗等也再次證實了原花色素的安全性。原花色素已經(jīng)以試驗植物的提取物、抗氧劑或食品原料形式被廣泛地使用。未見對人類具有任何副作用的報道。因此，原花色素極其安全，可非常有效地治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病。因此原花色素是一種特別有用的藥物。
權利要求
1.一種腺苷-5’-二磷酸(ADP)-核糖基化抑制劑，含有原花色素作為有效成分。
2.權利要求1的ADP-核糖基化抑制劑，其中的原花色素由食用植物或由食用植物得到的物質(zhì)獲得。
3.權利要求2的ADP-核糖基化抑制劑，其中所述的食用植物或用食用植物得到的物質(zhì)是蘋果或葡萄提取物。
4.權利要求1-3任一項的ADP-核糖基化抑制劑，其中的原花色素是用至少一種選自下列的溶劑萃取得到的原花色素水、醇、酯和酮。
5.權利要求1-4任一項的ADP-核糖基化抑制劑，其中的原花色素是采用下列方法純化得到的原花色素苯乙烯型吸附樹脂、陰離子交換樹脂、十八烷基-化學結(jié)合型硅膠、辛基-化學結(jié)合型硅膠、苯基-化學結(jié)合型硅膠和硅膠。
6.一種治療和/或預防白喉、百日咳、破傷風和機遇性感染的組合物，含有權利要求1-5中任一項的ADP-核糖基化抑制劑作為有效成分。
7.一種治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病的組合物，含有原花色素作為有效成分。
8.權利要求7的治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病的組合物，用于治療和/或預防霍亂、肉毒桿菌和旅行者腹瀉。
9.權利要求7或8的治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病的組合物，其中所述的食用植物或由食用植物得到的物質(zhì)是蘋果或葡萄的提取物。
10.權利要求7-9任一項的治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病的組合物，其中的原花色素是用至少一種選自下列的溶劑萃取得到的原花色素水、醇、酯和酮。
11.權利要求7-10任一項的治療和/或預防腸毒素型細菌感染性疾病的組合物，其中的原花色素是采用下列方法純化得到的原花色素苯乙烯型吸附樹脂、陰離子交換樹脂、十八烷基-化學結(jié)合型硅膠、辛基-化學結(jié)合型硅膠、苯基-化學結(jié)合型硅膠和硅膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于腸毒素型細菌感染性疾病的藥物,它含有由天然存在的物質(zhì)得到的含原花色素的物質(zhì)如蘋果或葡萄提取物作為活性成分,該藥物可抑制由腸毒素型腸道感染病原菌,如病原性弧菌(霍亂弧菌、副溶血弧菌)產(chǎn)生的毒素,因此該藥物對于感染的治療與預防是基本有效的;基于原花色素的ADP－核糖基化抑制活性的治療和/或預防白喉等的藥物組合物;用于預防和治療上述疾病的食品添加劑;以及含有這些添加劑的食品。
文檔編號A61K31/35GK1348368SQ99816554
公開日2002年5月8日 申請日期1999年2月15日 優(yōu)先權日1999年2月15日
發(fā)明者野田公俊, 神田智正, 柳田顯郎, 稗田一男 申請人:日加威士己株式會社, 野田公俊