專利名稱：脂肪細(xì)胞,脂肪細(xì)胞系及其應(yīng)用的制作方法
描述本發(fā)明涉及含脂肪或脂并產(chǎn)生皮脂的皮膚和粘膜細(xì)胞，亦稱脂肪細(xì)胞。本發(fā)明特別涉及皮脂腺細(xì)胞和一個(gè)能通過大規(guī)模的傳代培養(yǎng)而連續(xù)培養(yǎng)的皮脂腺細(xì)胞系。脂肪細(xì)胞尤其適合有價(jià)值的應(yīng)用，如人和動(dòng)物的皮脂腺的生理和病理研究，研究痤瘡、皮脂溢或其他疾病的發(fā)生，測(cè)定不同的物質(zhì)和藥物的有效性，開發(fā)基于二維或三維的細(xì)胞裝配和器官樣結(jié)構(gòu)構(gòu)建的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，及來自于這些細(xì)胞的產(chǎn)物的生產(chǎn)。
依靠Xia等培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)，最近幾年脂肪細(xì)胞的體外培養(yǎng)的可重復(fù)性已經(jīng)有提高。因此，Ziyboulis等(《皮膚藥理學(xué)》1991；474-83)在培養(yǎng)基中省略了皮質(zhì)醇，加入了人血清。Lee(上皮細(xì)胞生理學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)展；C.J.Jones，編輯Kluwer，Dordrecht，1990；333-350)在有豐富添加物的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)皮脂腺之前利用膠原酶處理它們。還有，原代脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物通過去掉作為粘附基質(zhì)層的3T3成纖維細(xì)胞層而獲得(Akamatsu等。《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》1992；99509-511)。傳代培養(yǎng)物維持在添加無脂血清的培養(yǎng)基中(Zouboulis等，《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》。1993；101628-633)，及在無血清的含角質(zhì)形成細(xì)胞但沒有添加物的基本培養(yǎng)基中(Akamazu等。《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》1992；99509-511)。并且，研究表明角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子明顯增加人脂肪細(xì)胞的產(chǎn)量和增殖(Chen等。《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》1998；11084-89)。
盡管有這些技術(shù)的進(jìn)步，未來的進(jìn)展非常受限于一個(gè)狀況來自于分離的人皮脂腺的脂肪細(xì)胞的大量培養(yǎng)非常困難。尤其是在培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)期保存細(xì)胞材料非常困難?；谝陨系脑?，可以設(shè)想脂肪細(xì)胞通過細(xì)胞膜破裂趨于分化并且死亡，隨后釋放內(nèi)容物。最好的結(jié)果是Fujie等獲得的(《皮膚病研究檔案》1996；288703-708)，他以Xia等(1989)的技術(shù)為基礎(chǔ)分離了皮脂腺，利用分散細(xì)胞培養(yǎng)的方法，在無血清無細(xì)胞粘附層的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基中通過六次傳代培養(yǎng)培養(yǎng)了脂肪細(xì)胞。
發(fā)明摘要本發(fā)明的目的是提供可通過較高代次的傳代培養(yǎng)而穩(wěn)定培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞。也就是說，從形態(tài)學(xué)、表型和功能特征的表象上來說，提供的脂肪細(xì)胞應(yīng)接近活的正常的人脂肪細(xì)胞，至少是在這種程度上即它們適合作為用于生理、病理生理和制藥評(píng)價(jià)和研究的細(xì)胞材料或含脂、產(chǎn)皮脂的細(xì)胞，尤其脂肪細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)模型。
本發(fā)明目的通過提供永生化的脂肪細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。合適地，本發(fā)明的細(xì)胞來自于人，因?yàn)檫@是實(shí)際應(yīng)用最感興趣的。這種脂肪細(xì)胞存在于人皮脂腺細(xì)胞系SZ95中，其在德意志微生物保藏中心保藏，保藏號(hào)為DSM ACC2383。
優(yōu)選的實(shí)施方案描述本發(fā)明以下參考附圖進(jìn)行詳細(xì)描述。

圖1和圖2表明本發(fā)明提供的永生化的SZ95脂肪細(xì)胞保持了正常的原代脂肪細(xì)胞(本例中來自于人)的表皮的、多態(tài)的表觀。而且，提供的永生化的脂肪細(xì)胞和其克隆(一個(gè)克隆意味著來自于單個(gè)細(xì)胞)表達(dá)典型的94kD大小的SV-40大T抗原，其用編碼DNA序列進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，在傳代培養(yǎng)物中也是如此。圖1表明(a)正常，第二次傳代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞，本發(fā)明提供的永生化的脂肪細(xì)胞來源于此，(b)由初次傳代培養(yǎng)來源的永生化的脂肪細(xì)胞提供的粘附脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物，(c)提供的永生化的脂肪細(xì)胞(克隆的第50代傳代培養(yǎng)物)。所有的細(xì)胞表現(xiàn)了相似的表皮的多態(tài)結(jié)構(gòu)。圖2顯示了下述細(xì)胞的細(xì)胞離心樣品，(a)提供的永生化的脂肪細(xì)胞，(b)作為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞HMEC-1，兩者均用SV-40大T抗原的單克隆抗體標(biāo)記。兩種樣品均被陽(yáng)性標(biāo)記，且顯示人SV-40大T抗原尤為集中在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，部分在細(xì)胞漿中表達(dá)。在(c)中，Western印跡分析說明了人SV-40大T抗原在提供的永生化的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)。盡管人SV-40大T抗原在未轉(zhuǎn)染的、正常的人脂肪細(xì)胞(第1道)和正常的人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(第2道)中位檢測(cè)到，但是特征性94kD大的蛋白質(zhì)在第34代傳代培養(yǎng)的永生化的脂肪細(xì)胞的蛋白提取物中檢測(cè)到(第3道)，在三個(gè)分離的克隆中也檢測(cè)到(第4、5、6道)。
本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞是人來源的，術(shù)語(yǔ)“脂肪細(xì)胞”的含義具有很廣泛的意義，即，涉及所有的或多或少含有脂肪或脂質(zhì)以及產(chǎn)生皮脂的細(xì)胞。皮脂純粹由不同的脂肪或脂質(zhì)物質(zhì)組成。由此，細(xì)胞的脂肪或脂質(zhì)含量可在脂質(zhì)物質(zhì)成分和脂質(zhì)物質(zhì)成分的含量方面有所變化。通常但非必需地，細(xì)胞的脂肪或脂質(zhì)物質(zhì)含量包括游離的脂肪酸、甘油三酯、蠟、鯊烯、游離膽固醇、膽固醇酯、二羥基膽固醇和其他的類固醇及烴。那些來源于人皮脂腺細(xì)胞的永生化的脂肪細(xì)胞是特別優(yōu)選的。假如脂肪細(xì)胞來自于人面部皮脂腺，就非常的適合醫(yī)學(xué)用途。
本發(fā)明的脂肪細(xì)胞的基本特征是它們的永生化。本發(fā)明的永生化基本上意味著在多次傳代培養(yǎng)中保持了細(xì)胞的重要特征。本發(fā)明的永生化脂肪細(xì)胞SZ95可保持培養(yǎng)4.5年、超過50次傳代，而正常的人脂肪細(xì)胞僅生長(zhǎng)3-6代便死亡。
本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞可利用與增殖抑制基因形成穩(wěn)定的非活性復(fù)合物的DNA，轉(zhuǎn)染人源的尤其是人皮脂腺的正常脂肪細(xì)胞而獲得。本發(fā)明的一個(gè)非常成功的永生化是通過用包含編碼SV-40大T抗原的DNA序列的DNA轉(zhuǎn)染正常人脂肪細(xì)胞、特別是衍生自面部皮脂腺的脂肪細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。SV-40大T抗原(蛋白)的永生化效果和DNA編碼序列轉(zhuǎn)染人細(xì)胞的相應(yīng)應(yīng)用是已知的。這樣，通過用編碼大T抗原的DNA轉(zhuǎn)染例如表皮來源的其它細(xì)胞(見Tohyama等，《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1997；18275-82；Bae等，《前列腺》1998；34275-282)，及內(nèi)皮來源的細(xì)胞(見Ades等，《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》)從而獲得永生化的細(xì)胞系。
利用陽(yáng)離子脂(Lipofectin試劑，其是含陽(yáng)離子脂DOTMA(1.2-二油酰氧基丙基-3-三甲基氯化銨)和DOPE[二油基磷脂酰乙醇胺]于膜過濾的水中[1mg/ml]的1∶1(w/w)脂質(zhì)體配制品)，通過細(xì)胞的胞吞作用經(jīng)陽(yáng)離子/DNA復(fù)合物攝入外源DNA(見Wang等，《體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)》1991；27A63-74；Staedel等，《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》，1994；102768-772)的基因轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，永生化得到了很好的結(jié)果，而轉(zhuǎn)染混合物中優(yōu)選含另外0.25到2.0％(體積)、尤其是2.0％(體積)的Lipofectin試劑及0.05-0.5％(重量)、特別是0.5％(重量)的于合適的轉(zhuǎn)染緩沖液中的外源DNA。外源DNA，如編碼SV-40大T抗原蛋白的DNA，典型地插入一個(gè)合適的表達(dá)載體中，由此優(yōu)選通過啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列而使蛋白質(zhì)的表達(dá)水平增強(qiáng)。如果在優(yōu)選的實(shí)施方案中，正常的人脂肪細(xì)胞用編碼SV-40的大T抗原的DNA轉(zhuǎn)染，則可以設(shè)預(yù)期脂肪細(xì)胞在成功的轉(zhuǎn)染和永生化后會(huì)表達(dá)SV-40的大T抗原。利用針對(duì)SV-40大T抗原的單克隆抗體進(jìn)行的免疫細(xì)胞化學(xué)和Western印跡分析確證了本發(fā)明提供的永生化脂肪細(xì)胞中大T抗原的表達(dá)。
這樣得到的永生化的脂肪細(xì)胞優(yōu)選地以細(xì)胞系的狀態(tài)存在，這樣可達(dá)到理想的應(yīng)用目的。
本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞在適應(yīng)無血清培養(yǎng)基后，其生長(zhǎng)比未轉(zhuǎn)染的、正常人脂肪細(xì)胞狀態(tài)好，它們保持合成皮脂腺細(xì)胞特征性脂質(zhì)的能力，這與在無血清培養(yǎng)中的未轉(zhuǎn)染的正常的人脂肪細(xì)胞相反。根據(jù)本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞可作為持續(xù)更新和繁殖的細(xì)胞系并可在一定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞的特殊價(jià)值是它們具有未轉(zhuǎn)染的、正常的和分化的脂肪細(xì)胞的形態(tài)、表型和功能方面的特征。這樣，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞可作為生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)研究的優(yōu)秀模型。同時(shí)，人源的常規(guī)培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞的有限的生存能力的不利因素也消除。因此，本發(fā)明提供的永生化的脂肪細(xì)胞能基本保持正常脂肪細(xì)胞的表型，在功能方面與未轉(zhuǎn)染的正常人面部脂肪細(xì)胞相似。
根據(jù)本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系表現(xiàn)出多態(tài)、表皮表觀，與未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞相似。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞大小與細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)多樣，后者表明了細(xì)胞成熟的不同階段。因此，觀察到不同大小的細(xì)胞，是融合生長(zhǎng)的平均5-6倍，這與未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞在體外的程序性分化(平均4-5.5倍大小差異)相符合。而且，根據(jù)本發(fā)明，永生化的脂肪細(xì)胞在細(xì)胞漿中富含脂肪物質(zhì)或脂質(zhì)顆粒，與未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞相似。特征性皮脂腺的脂質(zhì)鯊烯和蠟酯(正常的人脂肪細(xì)胞產(chǎn)生)的合成在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)。而且，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞合成游離脂肪酸，同樣與未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞的體外發(fā)現(xiàn)相符合，即使多次傳代培養(yǎng)也是如此。
而且，確證脂肪細(xì)胞來源，提示能存活的分化的表達(dá)標(biāo)記也被證實(shí)是本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞及細(xì)胞系的脂肪細(xì)胞的典型標(biāo)記。因此，永生化的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系表達(dá)人多形態(tài)表皮粘液蛋白團(tuán)，如皮脂腺抗原、人奶脂球蛋白1和2、人表皮唾液粘蛋白、Thomsen-Friedenreich抗原、粘蛋白樣致癌物相關(guān)抗原和表皮膜抗原。以上在本發(fā)明過程中利用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western印跡的方法得到了確證。另外，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系表達(dá)角蛋白抗原，它在未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞如亞類7、13和19很典型。該抗原表型說明了脂肪細(xì)胞來源和脂肪細(xì)胞的分化。
在功能方面，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系與未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞相似。這樣，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞對(duì)雄激素如5α-雙氫睪丸酮產(chǎn)生應(yīng)答，體外增殖加強(qiáng)。而且，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系能通過類維生素A尤其是非芳香族類型的類維生素A(如13-順式視黃酸、全反式視黃酸)改變它們的增殖。
本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案是永生化的優(yōu)選地為人的脂肪細(xì)胞得到克隆。這是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橛郎闹炯?xì)胞或由此產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞系通過其獨(dú)特的基因組基礎(chǔ)很好地定義并特異地表征?？寺〉挠郎酥炯?xì)胞系可通過在足夠長(zhǎng)的培養(yǎng)管中逐漸稀釋永生化的脂肪細(xì)胞直到每個(gè)培養(yǎng)管中僅從一個(gè)細(xì)胞重新開始細(xì)胞分裂而得到?？赏ㄟ^顯微鏡來觀察和控制這一過程。
相應(yīng)地，本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染的正常人脂肪細(xì)胞相比，本發(fā)明得到的永生化的人脂肪細(xì)胞或因此產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞系基本保留了脂肪細(xì)胞的特征。這一點(diǎn)從特征鑒定和功能測(cè)定中證實(shí)。
具有本發(fā)明以上闡述的優(yōu)點(diǎn)的一個(gè)脂肪細(xì)胞系，命名為SZ95，是皮脂腺細(xì)胞系，其保藏于DSMZ，保藏號(hào)為ACC2383。
因此，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系提供了有價(jià)值應(yīng)用的非常好的可能性。一般地，本發(fā)明的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系可用于診斷、治療和化妝品應(yīng)用。特別是，上述的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系可以用于開發(fā)和研究含脂質(zhì)的產(chǎn)生皮脂的細(xì)胞，尤其是人或動(dòng)物皮脂腺細(xì)胞的生理學(xué)或病理生理學(xué)，和它們?cè)谄つw的病理生理過程和皮膚病如痤瘡疾病中的作用。在本發(fā)明的幫助下，可以研究痤瘡和/或皮脂溢和/或其他疾病，尤其是在皮脂腺功能起作用或可能起作用的皮膚疾病的產(chǎn)生。本發(fā)明的產(chǎn)品將來可作為檢測(cè)和評(píng)價(jià)抗痤瘡化合物和/或抗皮脂溢化合物或治療劑的優(yōu)異模型，還可作為抗病、特別是皮脂腺功能相關(guān)的皮膚病的治療劑。尤其是臨床研究，如體外研究藥物的藥理特性研究中發(fā)揮作用。
本發(fā)明的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)還包括可建立進(jìn)一步的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。這包括開發(fā)簡(jiǎn)單或復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。簡(jiǎn)單的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是二維單層或多層粘附培養(yǎng)物或非粘附培養(yǎng)物，其例如通過將前述的脂肪細(xì)胞加入到其他細(xì)胞中，或通過半透膜或非透膜培養(yǎng)而形成(Schartz等，《外科研究雜志》1998；7679-85；Nackman等，《外科》1998；124353-361)。復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是三維的單層或多層培養(yǎng)物，其例如通過培養(yǎng)細(xì)胞形成球狀體，在球狀體上，在膠原或其他的膠狀物材料或人工皮膚樣結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)細(xì)胞(Korff和Augustin，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》1998；1431341-1352；Hamamoto等；《生物化學(xué)雜志》(東京)1998；24972-979；Desoize等，《抗癌研究》1998；184147-4158；Hamilton《癌癥通訊》1998；13129-34；Niemann等，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》1998；143533-545；Awata等，《胃腸病學(xué)肝病學(xué)雜志》1998；13增刊S55-61)；Voura等，《顯微研究技術(shù)》1998；43265-275；Pipili-Synetos等，《不列顛藥理雜志》1998；1251252-1257；Vasile等，《組化和細(xì)胞化學(xué)雜志》1999；47159-168；Michalopoulos等?！陡闻K病學(xué)》1999；2990-100；Trent和Kirsner，《國(guó)際臨床醫(yī)師雜志》1998；52408-413；Fransson等《不列顛皮膚病學(xué)雜志》1998；139598-604；Konstantinova等，《皮膚病學(xué)研究檔案》1998；290610-614；Black等，F(xiàn)ASEB雜志，1998；121331-1340；Zhao等，《生物化學(xué)與生物物理研究通訊》1999；25449-53)。
一個(gè)特別有利的應(yīng)用涉及三維細(xì)胞集群的產(chǎn)生或者基于本發(fā)明脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系的器官樣結(jié)構(gòu)的建立或重建。為此，單獨(dú)使用脂肪細(xì)胞，但優(yōu)選地也加入其它產(chǎn)生皮膚的細(xì)胞，尤其是角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、朗罕氏細(xì)胞和/或來自毛囊的細(xì)胞。為產(chǎn)生三維細(xì)胞集群或器官樣結(jié)構(gòu)的建立或重建，首先提供一個(gè)含有膠原或其它膠狀材料和/或部分非活性組織的支架，然后前面提到的細(xì)胞填充或敷于支架上。這個(gè)方法對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是基本知識(shí)(Trent和Kirsner，《國(guó)際臨床醫(yī)師雜志》1998；52408-413；Fransson等《不列顛皮膚病學(xué)雜志》1998；139598-604；Konstantinova等，《皮膚病學(xué)研究檔案》1998；290610-614；Black等，F(xiàn)ASEB雜志，1998；121331-1340；Zhao等，《生物化學(xué)與生物物理研究通訊》1999；25449-53)。由此產(chǎn)生一種“人工皮膚”或皮膚替代物，其為移植醫(yī)學(xué)、對(duì)于受損傷皮膚如燒傷的重建或皮膚病損的治療提供了很好的可能。借助于本發(fā)明，當(dāng)本發(fā)明的脂肪細(xì)胞摻入其中時(shí)，這樣的“人工皮膚”可合成足量的脂質(zhì)/皮脂。
更進(jìn)一步的應(yīng)用領(lǐng)域涉及生產(chǎn)來自于本發(fā)明的脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞系的產(chǎn)品。這包括細(xì)胞物質(zhì)如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和/或RNA的分離和純化。由于細(xì)胞是永生化的，它們可以不斷提供這些細(xì)胞物質(zhì)。可從這些細(xì)胞中獲得的特別合適的例子包括，局部藥用的皮膚脂質(zhì)、下面實(shí)施例3提到的與脂肪細(xì)胞表型特征關(guān)聯(lián)的抗原蛋白、更進(jìn)一步的質(zhì)粒DNA或載體DNA的產(chǎn)生。質(zhì)粒DNA或載體DNA是通過遺傳工程產(chǎn)生的，這對(duì)于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員是知道的。因此，可以得到誘導(dǎo)脂質(zhì)產(chǎn)生的基因。尤其是用這樣合適的質(zhì)粒和載體，也包括病毒載體，其他的細(xì)胞或生物體可被改變或轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明參考如下非限制的實(shí)施例更詳盡地解釋。
實(shí)施例如下描述的實(shí)施例，可應(yīng)用如下具體的材料和方法。實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被理解為是限制性的。
細(xì)胞培養(yǎng)如不另外說明，所有的細(xì)胞均于由改良的DMEM/HAM F12培養(yǎng)基(1∶1)(Biochrom公司，柏林，德國(guó))組成的培養(yǎng)基中粘附培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含2mM的N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酸，并加入10％熱滅活的胎牛血清(FCS；Biochrom)和50μm/ml慶大霉素(Gibco公司，卡爾斯魯厄，德國(guó))。在含5％CO2的濕度氣氛下于37℃培養(yǎng)。每2-3天換液。
正常人脂肪細(xì)胞的分離和培養(yǎng)正常的脂肪細(xì)胞是從一個(gè)87歲的外科手術(shù)女性病人面部皮膚上分離的，Xia曾報(bào)道(皮膚病學(xué)觀察雜志1989；93315-321)。分離的皮脂腺在無滋養(yǎng)層的補(bǔ)加9ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子，9ng/ml的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(均得自Boehringer Mannheim，德國(guó))，0.4μg/ml氫化可的松(得自Sigma，Deisenhofen，德國(guó))，10-9M霍亂毒素(得自Calbiochem，Bad Soden，德國(guó))的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。原代正常脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物作為皮脂腺小葉周圍的生長(zhǎng)暈而獲得。
免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定次融合的正常脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物的分散細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞離心吸附到玻璃片上。樣品在空氣中晾干后冰丙酮固定10分鐘。樣品隨后在室溫與相應(yīng)的單克隆抗體或?qū)φ湛贵w孵育30分鐘。加入1∶100稀釋的兔抗鼠IgG(重鏈+輕鏈)和堿性磷酸酶/抗堿性磷酸酶復(fù)合物(Dianova，漢堡，德國(guó))室溫30分鐘，檢測(cè)結(jié)合的抗體。一抗和二抗在含10％RPMI-1640和10％胎牛血清(pH7.4)的溶液中稀釋。用不含鈣離子和鎂離子的PBS緩沖液(得自Biochrom)洗滌三次。樣品用Neufuchsin作為粘附試劑，萘酚鹽作為偶聯(lián)試劑，在緩沖液中染色30分鐘，用Mayer’s Haemalum(Merck，達(dá)姆施塔特，德國(guó))復(fù)染，覆蓋并用光顯微鏡觀察。
分離和定量蛋白細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS洗兩次，在培養(yǎng)瓶中用冰冷的溶液(50mMHEPES，1％Nonidet P-40(ICN，Aurora，美國(guó))，150mM NaCl，蛋白酶抑制劑(CompleteTMMini，寶靈曼公司))裂解，隨后刮下并收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管分離細(xì)胞蛋白。得到的材料利用超聲破碎攪均，離心后收集上清置于冰上。加入雙辛可寧酸(BCA-蛋白分析，Pierce，Rochford，伊利諾伊斯州，美國(guó))可見總蛋白，蛋白濃度通過測(cè)定550nm的吸收值來定量。
Western印跡分析分離的蛋白等份(20μg)加熱至95℃15分鐘。一維SDS-PAGE電泳，使用7.4％濃度的膠。然后，利用標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(伯樂公司，Munchen，德國(guó))將蛋白轉(zhuǎn)印到膜(PVDF Immobilon-P，Millipore公司，Eschborn，德國(guó))上。印跡與第一抗體在室溫孵育60分鐘，然后分別和0.2μg/ml稀釋的辣根過氧化酶綴合的羊抗鼠單抗和羊抗兔單抗(Oncogene Science)在室溫孵育60分鐘。徹底洗滌后，信號(hào)通過化學(xué)發(fā)光法用標(biāo)準(zhǔn)分析(ECL，Amersham公司，Braunschweig)顯影在X光片(XAR5，柯達(dá)公司，Rochester，紐約州，美國(guó))上，其中不同的發(fā)光間隔可調(diào)。
油紅和尼羅紅染色細(xì)胞生長(zhǎng)在鉗片中與0.6％的油紅或60％的異丙醇孵育15-120分鐘，或用1μg/ml的尼羅紅(柯達(dá)公司)在室溫染色15分鐘，如Xia報(bào)道(1989)。培養(yǎng)物隨后在光學(xué)顯微鏡下觀察(油紅染色后)或利用450-500nm波段發(fā)光＞580nm的激發(fā)濾光片在熒光顯微鏡下觀察。
流式細(xì)胞方法分散的未標(biāo)記的細(xì)胞利用常規(guī)的分選儀依據(jù)細(xì)胞大小判斷，而標(biāo)記尼羅紅染料(柯達(dá)公司)的細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光來判斷脂質(zhì)含量。每個(gè)樣品約測(cè)定10.000個(gè)細(xì)胞。
標(biāo)記和脂質(zhì)提取細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，然后通過[2-14C]醋酸鈉(45-60 mCi/mmol；杜邦公司，波士頓，美國(guó))進(jìn)行放射性脈沖，其在PRMI-1640中的濃度是0.5μCi/ml，培養(yǎng)基中含2mM的L-谷氨酸，10％熱滅活的胎牛血清和100IU/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。孵育進(jìn)一步持續(xù)24小時(shí)，脂質(zhì)從培養(yǎng)的細(xì)胞和培養(yǎng)上清中分離，并分為中性脂質(zhì)、脂肪酸和磷脂(見Seifert等，《皮膚病學(xué)調(diào)查雜志》1997；108375)。
中性脂質(zhì)和脂肪酸的大小分離組分可通過在20×10cm2硅膠覆蓋的玻璃板(Merck公司，達(dá)姆施塔特，德國(guó))上進(jìn)行的高效薄層層析法(HPTLC)觀察。玻璃板用正己烷預(yù)處理，晾干24小時(shí)。樣品利用自動(dòng)的脂質(zhì)加樣器(Linomat IV；Camag，柏林，德國(guó))加樣。中性脂質(zhì)層析譜在正己烷-二乙醚溶液(9∶1)中顯色在9厘米，晾干，在氯仿/二乙醚，乙酸乙酯(80∶4∶16)的溶液中顯色后在4.5厘米。利用發(fā)光片(TR 2040S，富士公司，東京，日本)發(fā)光，用圖象分析儀(BAS 1000生物成像分析儀，富士)掃描。脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)作為對(duì)照樣品。
生長(zhǎng)行為測(cè)定細(xì)胞接種到96孔板，濃度為0.5-4×103/孔。細(xì)胞增殖利用4-甲基umbelliferyl庚酸酯熒光分析自動(dòng)測(cè)定(Zouboulis等，《黑素瘤研究》1991；191-95)。
至此，在測(cè)定時(shí)，倒掉培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗兩次，每孔加入100μl的稀釋于PBS的100μg/ml 4-甲基umbelliferyl庚酸酯溶液(Sigma，Deisenhofen，德國(guó))。培養(yǎng)板在37℃放置30分鐘，利用合適的熒光測(cè)量?jī)x器(Titertec-Fluoroscan II；Flow，Meckenheim，德國(guó))測(cè)定發(fā)射的熒光。在355nm激發(fā)和460nm發(fā)射濾片獲得熒光單位。
用5α-二氫睪丸酮和類維生素A處理將5α-二氫睪丸酮(Sigma)溶于二甲基亞砜，然后溶于無血清無酚的含2mM的N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酸的改良的DMED/Ham’s F12培養(yǎng)基(1∶1)(Gibco-BRL)中，該培養(yǎng)基補(bǔ)加5ng/ml的EGF，50μg/ml的牛垂體提取物，1mg/ml無脂肪酸的牛血清白蛋白(寶靈曼)和50μg/ml慶大霉素，從而5α-二氫睪丸酮終濃度為10-6M和二甲基亞砜為0.1％。用0.1％二甲基亞砜作為對(duì)照組。細(xì)胞(0.5-2.0×103/孔)用5α-二氫睪丸酮處理18天。
對(duì)于類維生素A處理，將全反式視黃酸、13-順式視黃酸和acitretin溶于DMSO，隨后置于無血清的含2nM N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酸的改良DMEM/Ham’s F12培養(yǎng)基(1∶1)中，該培養(yǎng)基補(bǔ)加5ng/ml的EGF，50μg/ml的牛垂體提取物，1mg/ml無脂肪酸的牛血清白蛋白(寶靈曼)和50μg/ml慶大霉素，從而類維生素A終濃度為10-7M和二甲基亞砜為0.1％。用0.1％二甲基亞砜作為對(duì)照組。類維生素A在暗琥珀色光下操作。細(xì)胞(0.5-1×103/孔)用類維生素A處理9天。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析生長(zhǎng)研究在96孔板上做6次重復(fù)。所有的其他實(shí)驗(yàn)做3次。
實(shí)施例1正常人脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染正常人脂肪細(xì)胞所用載體為pSVT，其是以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的，其包含編碼SV-40大T抗原的序列，蛋白表達(dá)由勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列所控制(見Dutt，《癌基因》，1990；5195-200；Wang等，《體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)》，1991；27A63-74)。第二次傳代培養(yǎng)的人脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物在35mm的培養(yǎng)皿(Becton Dickinson，Plymouth，UK)中長(zhǎng)到50％融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染以陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染法為基礎(chǔ)。為此，使用LIPOFECTIN試劑，其含有陽(yáng)離子脂質(zhì)DOTMA(1，2-二油酰氧基丙基-3-三甲基氯化銨)和DOPE[二油基磷脂酰乙醇胺]于膜過濾的水中[1mg/ml]中的1∶1(w/w)脂質(zhì)體配制品)。至此，棄掉培養(yǎng)基，培養(yǎng)的細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(Opti-MEM，來自Gibco-BRL)洗2次，在此培養(yǎng)基中孵育4小時(shí)。然后培養(yǎng)基以轉(zhuǎn)染混合物代替，所述混合物由不含抗生素量的Opti-MEM培養(yǎng)基(1.5ml)和適量的LIPOFECTIN試劑(Gibco-BRL；5-30μl，最優(yōu)選1.5％(體積))及適量的溶于0.5ml PBS的pSVT DNA(1-10μg，DNA終濃度最優(yōu)選為0.5％(wt))組成。培養(yǎng)物在含5％CO2的濕度環(huán)境于37℃孵育24小時(shí)。培養(yǎng)物用培養(yǎng)基洗2次，然后在上述的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染處理后，在4周過程中觀察到pSVT處理的脂肪細(xì)胞的存活性急劇降低。但是用最佳量的LIPOFECTIN試劑和pSVT DNA，增殖的脂肪細(xì)胞集落出現(xiàn)。這些細(xì)胞(SZ95)能夠傳代至今超過50次。它們?cè)?.5年的觀察期間始終存活。
實(shí)施例2永生化的人脂肪細(xì)胞克隆將如此的永生化的人脂肪細(xì)胞SZ95系列稀釋接種到96孔板中，細(xì)胞數(shù)由1×102為第一組，直到最后一組為0個(gè)細(xì)胞(Zouboulis等，“皮膚惡性黑素瘤”，CE Orfanos和C.Garbe編輯，Muckschwerdt，Munchen，德國(guó)，1990；158-168)。細(xì)胞在加入5mg/ml EGF和3ng/mlKGF的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，每孔由單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成的細(xì)胞認(rèn)為是克隆。這樣，得到了SZ95克隆細(xì)胞。
實(shí)施例3永生化的脂肪細(xì)胞的鑒定檢測(cè)SV-40大T抗原永生化的脂肪細(xì)胞中，利用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western印跡法，采用鼠血清來源的抗大T抗原的單克隆抗體(Oncogene Science，劍橋，美國(guó))檢測(cè)了SV-40大T抗原的表達(dá)，所述單克隆抗體1∶1000稀釋用于免疫細(xì)胞化學(xué)分析，1∶100稀釋用于Western印跡分析。人正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞和作為陽(yáng)性對(duì)照的內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1(被SV-40大T抗原永生化，見WO-A-992/175 69)作為參比。
根據(jù)實(shí)施例1，利用大T抗原的單抗進(jìn)行的永生化的脂肪細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多在細(xì)胞核，部分在細(xì)胞漿有明顯的染色(見圖2a)。正常的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞一致為大T抗原陰性，HMEC-1細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照則在細(xì)胞核，部分細(xì)胞漿中有SV-40大T抗原的染色(圖2b)。
圖2c顯示了在未轉(zhuǎn)染的正常人SV-40大T抗原的Western印跡的分析結(jié)果(第1道)，及正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(第2道)和本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞(第34代傳代培養(yǎng)，第3道)，及本發(fā)明的不同克隆脂肪細(xì)胞(4、5、6道)。94kD帶被確認(rèn)是永生化的脂肪細(xì)胞和它的克隆中表達(dá)的SV-40大T抗原(見Harlow等，《病毒學(xué)雜志》，1981；39861-869)。
本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞的表型鑒定根據(jù)實(shí)施例1，永生化的脂肪細(xì)胞SZ95形態(tài)學(xué)是表皮的，表現(xiàn)出多形態(tài)性，細(xì)胞大小不同，在細(xì)胞漿中有很多小滴(見圖1b和1c)。
用相關(guān)的抗體進(jìn)行的本發(fā)明永生化脂肪細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞沒有染色相比，檢測(cè)到皮脂腺抗原的染色和表達(dá)(見圖3)。圖3顯示免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，(a)本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞，(b)正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。制備物用抗皮脂腺抗原的單克隆抗體染色。本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞顯示胞漿染色呈陽(yáng)性，正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞沒有染色。
另外，利用Western印跡檢測(cè)到永生化的脂肪細(xì)胞中，角蛋白7、13和19和人多態(tài)表皮粘蛋白組的各種蛋白的表達(dá)，而人角質(zhì)形成細(xì)胞只表達(dá)角蛋白13(見圖4)。根據(jù)圖4，在Western印跡分析中，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞(第34代培養(yǎng)物，第1道)，本發(fā)明的各種克隆的永生化的脂肪細(xì)胞(第2、3、4道)和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(第5道)的總蛋白提取物用來檢測(cè)人表皮唾液粘蛋白(＞300kD)，人乳脂球蛋白(HMFG-1)(400kD)，人乳脂球蛋白(HMFG-2)(80-400kD)，粘蛋白型癌關(guān)聯(lián)蛋白抗原(MCA)(350kD)，表皮膜蛋白(EMA)(250-400kD)，Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原)(155kD)，角蛋白7(54kD)，角蛋白13(54kD)，角蛋白19(40kD)，5α-還原酶I型(21-27kD)。本發(fā)明的永生化的細(xì)胞系和它的克隆均表達(dá)所測(cè)的蛋白，而角質(zhì)形成細(xì)胞只表達(dá)角蛋白13和5α-還原酶I型。
脂質(zhì)合成用尼羅紅染色和熒光顯微鏡觀察表明細(xì)胞漿內(nèi)有脂質(zhì)存在。本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞SZ95(圖5)用尼羅紅熒光染色，中性脂質(zhì)著色，結(jié)果單個(gè)或成團(tuán)脂質(zhì)小團(tuán)隨機(jī)分散在脂肪細(xì)胞的胞漿中，尼羅紅染色熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞的內(nèi)容物由有血清培養(yǎng)基中每細(xì)胞510熒光單位(中間值)下降至無血清培養(yǎng)中的每個(gè)細(xì)胞429個(gè)熒光單位。本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞(實(shí)施例1)合成多種中性脂質(zhì)部分，包括典型的皮脂腺脂質(zhì)鯊烯、蠟酯、甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯、甘油二酯、羊毛甾醇和游離脂肪酸。25-40傳代培養(yǎng)物均觀察到這一點(diǎn)。圖6示出了結(jié)果，其利用放射性測(cè)量成像評(píng)價(jià)永生的和克隆的脂肪細(xì)胞培養(yǎng)物(見第3、4道和5道)；放射性標(biāo)記醋酸鈉后脈沖記錄測(cè)定了HPLC分離的脂質(zhì)。第3、4、5道顯示，細(xì)胞合成多種中性脂質(zhì)部分，包括鯊烯、蠟酯、甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯、甘油二酯、羊毛甾醇和游離脂肪酸。在細(xì)胞外上清中所有的中性脂質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，但含量較少(見6道)。為進(jìn)行比較，采用1道脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，2道人皮脂、4道游離脂肪酸。作為進(jìn)一步比較，7道和8道表明角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)果。7道表明細(xì)胞中膽固醇和甘油三酯為主，而上清(8道)主要是膽甾醇。
增殖研究本發(fā)明的永生化的脂肪細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)曲線在正常培養(yǎng)狀態(tài)下觀察到，細(xì)胞群倍增時(shí)間是52.4±1.6，而與最初的細(xì)胞培養(yǎng)物密度無關(guān)。圖7顯示一個(gè)永生化的克隆脂肪細(xì)胞系SZ95在18天內(nèi)在脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中的增殖情況。
永生化的脂肪細(xì)胞在加入無血清培養(yǎng)基后增殖下降，但加入5α-DHT后，增殖恢復(fù)正常。圖8顯示了這樣一個(gè)脂肪細(xì)胞克隆的例子，在無血清培養(yǎng)基(對(duì)照)以及加入10-6M的5α-DHT無血清培養(yǎng)基中觀察細(xì)胞增殖(接種2000/孔)18天。在第8天后，5α-DHT明顯增加細(xì)胞增殖，所測(cè)定的細(xì)胞群倍增時(shí)間是136小時(shí)(對(duì)照)和53.7小時(shí)(5α-DHT處理的細(xì)胞，*，p＜0.05；**，p＜0.01)。
類維生素A對(duì)永生化細(xì)胞的影響顯示出增殖行為的分化應(yīng)答。盡管一些克隆表現(xiàn)為類維生素A的增殖抑制(典型的順序是13-順式視黃酸＞全反式視黃酸＞＞acitretin)，但其他的克隆增殖被促進(jìn)(如被全反式視黃酸和13-順式視黃酸促進(jìn))，與正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖應(yīng)答相應(yīng)。圖9展示了這一點(diǎn)(*，＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)。
權(quán)利要求
1.永生化的脂肪細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們來自于人。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們來自于人皮脂腺。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的脂肪細(xì)胞，其特征在于皮脂腺細(xì)胞是面部的皮脂腺細(xì)胞。
5.根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們以細(xì)胞系形式存在。
6.根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們是經(jīng)轉(zhuǎn)染DNA而永生化的。
7.根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們表達(dá)SV-40大T抗原。
8.根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們表現(xiàn)出正常的、未轉(zhuǎn)染的、分化中的脂肪細(xì)胞的特征。
9.根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們的增殖可被雄激素和/或類維生素A改變。
10.根據(jù)前述的任一項(xiàng)權(quán)利要求的脂肪細(xì)胞，其特征在于它們是克隆化的。
11.人脂肪細(xì)胞系DSM ACC2383。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在診斷、治療或化妝品制劑中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在檢查人或動(dòng)物皮脂腺的生理或病理生理學(xué)中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在檢查痤瘡和/或皮脂溢性皮炎和/或其他疾病的起因中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的脂肪細(xì)胞的應(yīng)用，其中其它要檢查的疾病是涉及或可能涉及皮脂腺功能的皮膚病。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在檢測(cè)抗痤瘡和/或抗皮脂溢的化合物或藥劑中的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在檢測(cè)抗疾病的化合物或藥劑中的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的脂肪細(xì)胞的應(yīng)用，其中所述疾病是涉及或可能涉及皮脂腺功能的皮膚病。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在開發(fā)簡(jiǎn)單的或復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在形成或用于三維細(xì)胞集群或器官型結(jié)構(gòu)的構(gòu)建中的應(yīng)用。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的脂肪細(xì)胞或權(quán)利要求11的人脂肪細(xì)胞系在制備來自所述細(xì)胞的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的應(yīng)用，所述細(xì)胞產(chǎn)品為脂質(zhì)、質(zhì)粒、載體、所述細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)和/或所述蛋白質(zhì)的DNA或RNA序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22得到的產(chǎn)品在修飾其它的細(xì)胞或修飾其他生物體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明描述了脂肪細(xì)胞。本發(fā)明尤其涉及具有可連續(xù)傳代培養(yǎng)許多代這一性質(zhì)的皮脂腺細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞系。所述脂肪細(xì)胞很適合各種應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1344314SQ99816538
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期1999年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月1日
發(fā)明者赫里斯托斯·祖布利斯 申請(qǐng)人:赫里斯托斯·祖布利斯