本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株、抗體及其應用，具體涉及用于檢測人CTRP9的雜交瘤細胞株、抗體及其應用。
背景技術(shù)：
：C1qandtumornecrosisfactorrelatedprotein9(CTRP9)是主要由脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子，作用于肌肉和肝臟，調(diào)節(jié)全身葡萄糖和脂質(zhì)代謝等。在腎臟、小腸、肺臟及成纖維細胞等器官、組織細胞中也有所表達。CTRP9由分泌信號肽、短N端可變區(qū)域、膠原區(qū)域及C端球狀結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，成熟蛋白不含其N端信號肽(19個氨基酸殘基)。C端球狀結(jié)構(gòu)域與C1q結(jié)構(gòu)類似，與脂聯(lián)素高度相似，可以與其他蛋白或者受體相互作用，因此被認為是其功能結(jié)構(gòu)域。CTRP9是具有諸多生理功能的新型脂肪因子，具有降低血糖、舒張血管及心肌保護等諸多生理作用。骨骼肌細胞中，CTRP9可以長期激活AMPK通路，增加線粒體的含量和上調(diào)脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達，從而降低了脂肪組織的形成。在股動脈損傷模型中，CTRP9過量表達可以激活cAMP/PKA/ERK通路，抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移，大幅度降低新生內(nèi)膜的形成。人臍靜脈內(nèi)皮細胞和新分離血管環(huán)中，重組CTRP9蛋白可以通過AMPK/eNOS通路提高一氧化氮產(chǎn)量使血管擴張。同時，CTRP9具有顯著的缺血心肌及血管保護作用，尤其是在心肌及血管組織表達分泌量是脂聯(lián)素的100倍以上，而心肌缺血損傷時其心肌分泌及血漿含量均顯著降低，具有很高的特異性，CTRPs是潛在的肥胖相關(guān)心臟病病情評估的生物標記物及干預靶點，有望在治療代謝綜合征和心力衰竭等方面發(fā)揮重要作用。目前用于人CTRP9定量檢測的方法只有ELISA法，較為可靠的產(chǎn)品只有BioVendor的產(chǎn)品，但是也存在偏差較高、價格昂貴、操作時間長、不利于大規(guī)模檢測人CTRP9含量等缺點。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷或不足，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生抗人CTRP9單克隆抗體的雜交瘤細胞株XA272-919，該雜交瘤細胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCCNO：C2016111，地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏時間：2016年6月16日。本發(fā)明的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的抗體的序列為：重鏈可變區(qū)：QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS；CDR1序列：TYNIH；CDR2序列：AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT；CDR3序列：GGNAMDY；輕鏈可變區(qū)：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK；CDR1序列：KSSRTLLYSSNQKNYLA；CDR2序列：WASTRES；CDR3序列：LQYYSYVT。本發(fā)明雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生的抗人CTRP9單克隆抗體。本發(fā)明抗體用于檢測人CTRP9的應用。本發(fā)明抗體用于制備人CTRP9檢測試劑盒的應用。本發(fā)明還提供了人CTRP9檢測試劑盒。所提供的人CTRP9檢測試劑盒包括上述抗體。本發(fā)明的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：樣品稀釋液、底物稀釋液、底物、洗滌液、標準品和非離子活性劑。附圖說明圖1為重組人CTRP9蛋白的電泳圖，1、Marker；2、破碎上清；3、鎳柱流穿液；4、500mM咪唑洗脫液；5、重組人CTRP9蛋白。具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明做進一步的闡述。實施例是對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明并不受這些的任何限定。以下實施例中使用的辣根過氧化物酶(HRP)購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；基因序列優(yōu)化、合成克隆由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；抗體測序由北京安必奇生物科技有限公司完成；Ni-NTA純化柱購自GE公司；內(nèi)毒素去除柱購自賽默飛世爾(中國)有限公司；DMEM高塘培養(yǎng)基、胎牛血清為Hycolon公司產(chǎn)品。實施例1:本發(fā)明雜交瘤細胞株的制備根據(jù)人CTRP9序列(GenBankACCESSIONNM_030945)開放閱讀框序列，進行針對大腸桿菌偏好性進行密碼子優(yōu)化，人CTRP9全基因合成(序列為：ATGCAGGATACCTGCAGACAGGGTCACCCAGGTATTCCAGGTAACCCTGGTCATAATGGTCTGCCAGGTAGAGATGGTCGTGATGGTGCCAAAGGTGACAAAGGTGATGCTGGAGAGCCAGGTAGACCAGGTTCACCTGGTAAGGATGGAACCTCTGGTGAGAAGGGAGAACGTGGTGCCGACGGTAAAGTGGAAGCCAAGGGTATCAAGGGTGACCAGGGTTCTCGTGGTTCTCCAGGTAAACACGGTCCTAAAGGTTTGGCCGGTCCTATGGGAGAAAAGGGTCTGAGAGGTGAGACTGGTCCACAGGGACAGAAAGGTAACAAGGGTGACGTTGGTCCTACTGGTCCTGAGGGTCCTCGTGGTAATATTGGTCCACTGGGTCCTACCGGTCTGCCAGGTCCAATGGGTCCAATTGGTAAGCCAGGTCCAAAGGGTGAAGCTGGTCCTACCGGACCACAGGGAGAACCAGGTGTGCGTGGTATTAGAGGTTGGAAGGGTGATCGTGGAGAGAAGGGTAAAATCGGTGAGACCCTGGTGCTGCCAAAATCTGCCTTTACCGTTGGTCTGACCGTGCTGTCTAAGTTTCCTTCTTCTGATATGCCAATTAAATTTGACAAAATTCTGTACAACGAGTTCAACCATTATGACACTGCCGCCGGTAAGTTCACCTGCCATATCGCCGGTGTTTACTACTTTACCTATCATATTACCGTGTTCTCTCGTAACGTTCAGGTGTCTCTGGTGAAGAACGGTGTGAAGATCCTGCACACCAAGGACGCCTACATGTCTTCTGAGGACCAGGCTTCTGGTGGTATCGTGCTGCAGCTGAAACTGGGTGATGAGGTGTGGCTGCAGGTTACTGGTGGTGAACGTTTCAACGGTCTGTTTGCCGACGAAGATGACGACACCACCTTCACTGGATTCCTGCTGTTCTCATCTCCTTAA)，將合成的基因連接于pET30a(+)，采用IPTG(終濃度1mM)進行25℃，200rpm過夜誘導表達，4000g離心收獲菌體。超聲破碎后，12000g離心取上清。上清經(jīng)過鎳柱親和純化，采用咪唑濃度梯度洗脫后，通過透析更換為PBS緩沖液，采用MilliporeUtral-15濃縮，除去內(nèi)毒素后，即為重組人CTRP9蛋白(參見圖1)。選取6-8周齡Balb/C雌性小鼠，前述CTRP9蛋白作為抗原，為獲得高親和力抗體，采用小劑量(約1μg)、長時程，多次免疫的方法，選擇免疫10天后，采用間接ELISA方法檢測血清效價(包被抗原為酶切并純化的蛋白)，效價達到1∶5萬以上準備融合。取經(jīng)加強免疫的小鼠脾臟，研磨破碎，過濾洗滌之后，制成細胞懸液并計數(shù)；骨髓瘤SP2/0細胞生長至對數(shù)期，離心收集并洗滌，與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合，室溫下采用PEG進行促融合，將融合后的細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞的96孔板，置37℃，5％CO2，相對飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合24小時后，依次采用5×HAT選擇培養(yǎng)液、1×HAT/HT選擇培養(yǎng)液和1×HT培養(yǎng)液進行融合骨髓瘤細胞篩選。采用間接ELISA方法陽性克隆(包被抗原為酶切并純化的蛋白)并進行連續(xù)克隆化。最終篩選得到能夠穩(wěn)定分泌抗CTRP9單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為XA272-907和XA272-919，均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏編號分別為：CCTCCNO:C2016110和CCTCCNO:C2016111。實施例2：人CTRP9單克隆抗體XA272-919的制備編號為CCTCCNO:C2016111的雜交瘤細胞以106個/只的量，腹腔注射預先致敏8-10周齡BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測單抗的效價。腹水4℃、12000rpm離心15min，與2倍體積的醋酸緩沖液(0.06M，pH4.8)混合，逐滴加入正辛酸，室溫攪拌30min，4℃靜置其充分沉淀。離心后取上清過濾，加入1/10體積的磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.4)，并用2MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。采用硫酸銨沉淀將抗體沉淀，離心后取沉淀，用含有0.2mMEDTA磷酸鹽緩沖液溶解，并透析過夜。采用離子交換層析進行純化，所用緩沖液：平衡緩沖液為20mMpH7.5的Tris-HCl緩沖液、洗脫緩沖液為含1.0MNaCl的20mMpH7.5的Tris-HCl緩沖液。NaCl濃度梯度洗脫結(jié)合的抗體蛋白，檢測A280，收集洗脫的抗體蛋白?？贵w的測序由北京安必奇生物科技有限公司完成，其步驟為：雜交瘤細胞采用RPMI1640加20％血清培養(yǎng)24h，離心，棄去上清，采用TriZol重懸細胞，106個細胞/mL。提取DNA后，采用RT-PCR擴增重鏈和輕鏈基因，克隆至T載體后進行DNA測序。該抗體命名為：單克隆抗體XA272-919，抗體序列為：重鏈可變區(qū)：QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS；CDR1序列：TYNIH；CDR2序列：AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT；CDR3序列：GGNAMDY；輕鏈可變區(qū)：DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK；CDR1序列：KSSRTLLYSSNQKNYLA；CDR2序列：WASTRES；CDR3序列：LQYYSYVT。實施例3：人CTRP9單克隆抗體XA272-907的制備保藏號為：CCTCCNO：C2016110(保藏地址：武漢市武昌珞珈山武漢大學，保藏時間：2016年6月16日)雜交瘤細胞以106個/只的量，腹腔注射預先致敏8-10周齡BABL/C雌性小鼠，7-10天后，采集小鼠腹水，用間接ELISA方法檢測單抗的效價。腹水4℃、12000rpm離心15min，與2倍體積的醋酸緩沖液(0.06M，pH4.8)混合，逐滴加入正辛酸，室溫攪拌30min，4℃靜置其充分沉淀。離心后取上清過濾，加入1/10體積的磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH7.4)，并用2MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。采用硫酸銨沉淀將抗體沉淀，離心后取沉淀，用含有0.2mMEDTA磷酸鹽緩沖液溶解，并透析過夜。采用離子交換層析進行純化，所用緩沖液：平衡緩沖液為20mMpH7.5的Tris-HCl緩沖液、洗脫緩沖液為含1.0MNaCl的20mMpH7.5的Tris-HCl緩沖液。NaCl濃度梯度洗脫結(jié)合的抗體蛋白，檢測A280，收集洗脫的抗體蛋白?？贵w的測序由北京安必奇生物科技有限公司完成，其步驟大致為：雜交瘤細胞采用RPMI1640加20％血清培養(yǎng)24h，離心，棄去上清，采用TriZol重懸細胞，106個細胞/mL。提取DNA后，采用RT-PCR擴增重鏈和輕鏈基因，克隆至T載體后進行DNA測序。該抗體命名為：抗體XA272-907，該抗體的序列為：重鏈可變區(qū)：DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSNFSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCACFDYWGQGTSLTVSS；CDR1序列：NFSWH；CDR2序列：YIHYSGGTNYNPSLKSRIS；CDR3序列：FDY；輕鏈可變區(qū)：DVLMTQTPLSLPVILGAQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK；CDR1序列：RSSQTIVHSNGNTYLE；CDR2序列：KVSNRFS；CDR3序列：FQGSHVPFT。實施例4:人CTRP9ELISA試劑盒試劑盒組成：人CTRP9單克隆抗體XA272-919包被的酶標板，標準品(純化的CTRP9蛋白，凍干粉)，檢測抗體：抗體XA272-907，酶標親和素HRP-鏈霉素，樣品稀釋液，TMB酶底物顯色液，洗滌液及反應終止液。TMB酶底物顯色液：0.03％過硼酸鈉，用之前10min加入TMB鹽酸鹽，終濃度0.01％；反應終止液：1mol/L硫酸溶液；樣品稀釋液：含0.1％BSA及0.1％Tween-20的PBS緩沖液；洗滌液:含有0.1％Tween-20的PBS緩沖液。(1)酶標板包被：(1.1)雜交瘤細胞株XA272-919所產(chǎn)生單克隆抗體XA272-919作包被用抗體，用50mM、pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至2μg/mL加至96孔板，100μL/孔，4℃包被過夜；(1.2)洗滌：用300μL含0.1％吐溫的磷酸鹽緩沖液洗板3次，甩干；(1.3)干燥保存：存于加干燥劑的密封袋中，4℃保存?zhèn)溆谩?2)檢測抗體酶標辣根過氧化物酶(HRP)5mg/1mL加入0.2mL0.1M過碘酸鈉，室溫下避光攪拌20min。將上述溶液對1mMpH4.4醋酸鈉緩沖液4℃透析過夜。20μL0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH到9.0-9.5加入10mg抗體XA272-907(由雜交瘤細胞株XA272-907產(chǎn)生)，室溫避光輕輕攪拌2h。加0.1mL硼氫化鈉溶液(4mg/mL)，混勻靜置2小時，4℃透析過夜。逐滴加入等體積飽和硫酸銨溶液4℃靜置1小時，離心30min，棄去上清。沉淀物少量0.15MpH7.4的磷酸鹽緩沖液并透析，上清即為酶標抗體XA272907-HRP(3)樣品加入：將標準品(待測樣本)加入包被孔內(nèi)，室溫振蕩反應1h。(4)酶聯(lián)反應：洗滌4次后加入辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體XA272907-HRP100μl/孔，反應1h。(5)顯色反應：洗滌4次后再加入底物液(含0.03％過硼酸鈉和0.01％鹽酸TMB)100μl，振蕩顯色10分鐘。(6)終止反應：以1mol/L硫酸終止反應。(7)擬合曲線與讀值：在酶標儀上讀波長為405nm的OD值得出標準曲線和濃度。利用標準品測定本試劑盒相關(guān)指標：1.線性范圍：該試劑盒檢測CTRP9含量的線性范圍為8.0pg/ml～15ng/ml。2.回收率：采用1ng/ml，10ng/ml，15ng/ml的CTRP9溶液(溶劑為樣品稀釋液)，測的平均回收率為98.87％(n＝9)。3.批內(nèi)差異：平均為4％。4.批間差異：平均為8％。實施例5：用本發(fā)明試劑盒檢測急性心肌梗死患者及正常對照組血清中CTRP9含量采用本發(fā)明所述試劑盒，檢測50例正常人和50例急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量，其結(jié)果如表1所示。表1血清中CTRP9的檢測結(jié)果(x±s，ng/ml)血清中CTRP9含量正常組急性心肌梗死患者ng/mL7.04±1.563.04±2.31P<0.001急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量明顯低于正常人，差異顯著(p＜0.01)。以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明試劑盒能定量檢測出體液標本中CTRP9的含量，對臨床檢測具有較高的敏感性和特異性，對診斷該病具有重要參考價值，為及早防治該病提供了一個有效途徑。當前第1頁1 2 3