本發(fā)明涉及組織細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種人表皮細(xì)胞的差別消化方法。

背景技術(shù)：

表皮細(xì)胞是皮膚表層的上皮細(xì)胞，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞和樹枝狀細(xì)胞組成。人表皮細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中起至關(guān)重要的作用，尤其是嚴(yán)重?zé)齻颊弑砥そ琴|(zhì)形成細(xì)胞的匱乏與患者病程長短、并發(fā)癥的發(fā)生及后期瘢痕的形成均有密切關(guān)系，因此應(yīng)用組織工程技術(shù)在體外進(jìn)行表皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與保存并應(yīng)用于臨床始終都是醫(yī)療工作者的一個研究熱點。

目前關(guān)于表皮細(xì)胞分離的方法主要包括兩大類：組織塊法和酶消法。組織塊法是將皮膚組織經(jīng)消毒殺菌后直接分離表皮組織，將表皮組織切成小塊，基底面向下培養(yǎng)于預(yù)鋪明膠的培養(yǎng)皿中，在37℃下培養(yǎng)，待組織塊周圍細(xì)胞生長直徑達(dá)到1~2cm時，用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，最終獲得表皮細(xì)胞。酶效法主要是利用酶解作用，將表皮和真皮分開，并得到表皮細(xì)胞。近年來，酶解法被不斷地改進(jìn)，從最初的利用胰蛋白酶消化，到如今被廣泛使用的中性蛋白酶和胰蛋白酶聯(lián)合使用的兩步酶法，還有人將dispaseⅱ和collagenaseⅰ混合酶、胰酶分步消化皮膚表皮得到表皮細(xì)胞。

專利申請?zhí)枮?01410342022.6的發(fā)明報道了一種體外分離培養(yǎng)人的表皮細(xì)胞的新方法，體外分離人的表皮細(xì)胞方法為：采集人的正常皮膚組織樣本約0.5~5cm2，后放入f12培養(yǎng)基中冷藏保存；稱取一定量的組織在200u/ml青鏈霉素的pbs里浸泡5分鐘，重復(fù)上述操作一次，后將組織切碎成勻漿每1g組織加入含有20ml消化液的離心管中，混勻；37℃水浴震蕩消化90~120min；然后加入終濃度為0.05％的胰蛋白酶繼續(xù)消化30min，最后再加100μl10mg/ml的脫氧核糖核酸酶消化5min，組織消化好后加相同體積的含有10％fbs的dmem中和消化液，反復(fù)吸打50~100次；組織懸液用過濾器過濾，過濾上清；細(xì)胞沉淀用dmem洗一次，然后離心棄上清；細(xì)胞沉淀用表皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，鋪在coatingmatrix預(yù)處理過的培養(yǎng)瓶或皿里面37℃、5%co2培養(yǎng)。上述方法雖節(jié)省了時間，細(xì)胞純度低，且經(jīng)過2周的培養(yǎng)，獲得表皮數(shù)量為107。

專利申請?zhí)枮椋?01510653684.6的發(fā)明報道了一種從自體皮膚獲取表皮細(xì)胞的方法，該方法是：取人0.1~2cm2皮膚，用1×pbs5ml浸潤15分鐘，重復(fù)上述操作，洗滌后用分散劑ii消化，后置4℃冰箱過夜，第二天取出用鑷子將表皮和真皮撕開，表皮剪碎至1mm3左右，用1×pbs洗滌后加入15ml離心管中，1000rpm/min離心5分鐘后棄上清，加入3ml0.25%（質(zhì)量體積比）胰酶消化1~60分鐘，其中胰酶含質(zhì)量體積比0.01%edta；消化后過40μm細(xì)胞篩，后經(jīng)離心處理，pbs和生理鹽水重懸后，獲得107~108表皮細(xì)胞。該法雖然獲得表皮細(xì)胞數(shù)多，但消化時間整體較長，需過夜進(jìn)行處理。因此，建立一種快速，細(xì)胞得率高，細(xì)胞純度高的人表皮細(xì)胞分離方法具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種人表皮細(xì)胞的差別消化方法，該方法簡單，快速，獲取細(xì)胞數(shù)量多且純度高，可建立活力較高的人表皮細(xì)胞庫，供臨床移植和體外重建人體皮膚模型所需。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明實施例采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種人表皮細(xì)胞的差別消化方法，人表皮細(xì)胞的差別消化方法包括如下幾個步驟：

（1）在超凈臺中預(yù)備無菌玻璃培養(yǎng)皿，一個中加入10ml75%乙醇，三個中各加入10ml無菌pbs，將新鮮人皮膚組織浸入75%乙醇溶液30s，期間將真皮面卷曲部分鋪開使其充分接觸乙醇以去除血污，減少表面污染；

（2）將無菌處理后的組織轉(zhuǎn)入pbs溶液中浸洗，1min后轉(zhuǎn)入另一pbs皿中繼續(xù)清洗至無血污，后將組織表皮面向下展于平皿中，去除皮下疏松結(jié)締組織，暴露致密結(jié)締組織，直至組織塊不再卷曲，此過程不超過10min，完成后轉(zhuǎn)入新鮮pbs中浸洗；

（3）表皮面向下，將組織切割成為0.2~2cm2的大?。?/p>

（4）將切割好的組織塊轉(zhuǎn)入25ml血清瓶中，每塊組織添加1mld-h酶消化液，消化液需完全浸沒組織塊，蓋好瓶蓋用封口膜封口后置入4℃冰箱，輕晃血清瓶使組織均勻分散于底部，消化8~10h，該消化過程避光；

（5）浸泡過后的組織連同d-h酶消化液一同傾入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，表皮面呈褐色，用鑷子將表皮撕下，收集放入預(yù)備好的50ml原代消化液中，轉(zhuǎn)至37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，消化10min，每2min震蕩一次；

（6）消化完成后，每個25ml消化瓶中加入10ml血清終止液，并吹打50次，后過200目網(wǎng)篩，濾液收集入50ml離心管中，血清瓶也加入血清終止液過濾收集至離心管，800rpm離心6min；

（7）離心后傾出上清，用pbs輕柔吹打細(xì)胞，上吸下打（6秒每次），待沉淀吹散后下吸上打6~8次（2秒每次）至細(xì)胞懸液完全混勻，再根據(jù)沉淀量補加pbs，使用彎頭吸管吹打2~3次（2秒每次），從細(xì)胞懸液的上半部分與下半部分各取適量懸液滴入不同的1.5mlep管中，加入計數(shù)板中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用臺盼藍(lán)染色，檢測細(xì)胞活力，蓋上離心管后離心，800rpm，離心6min；

（8）根據(jù)計數(shù)結(jié)果，按照3.5e6/瓶進(jìn)行接種，每瓶10ml表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶瓶口向內(nèi)水平置于37℃5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

（9）獲得的表皮細(xì)胞經(jīng)westernblotting蛋白質(zhì)檢測表皮細(xì)胞生長因子表達(dá)水平，經(jīng)灰度分析結(jié)果顯示其灰度值達(dá)到9000以上。

進(jìn)一步地，所述d-h酶消化液是由dispase酶和透明質(zhì)酸酶hyaluronidase組成，所述dispase酶的活力單位是1u/ml，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，所述透明質(zhì)酸酶hyaluronidase的濃度為0.1~0.3mg/ml。

進(jìn)一步地，所述原代消化液是胰酶消化液，每100ml的胰酶消化液中包含25mg的胰酶。

進(jìn)一步地，所述血清終止液是在dmem培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清組成的。

進(jìn)一步地，所述酶活力與皮膚組織的面積之比為5:1（u/cm2）。

本發(fā)明具有的優(yōu)勢在于：該消化方法簡單易行，容易掌握，所需組織量小，0.2cm2的皮膚組織可獲取活力較強的表皮細(xì)胞109，而且提取過程耗時短，無額外的試劑，大大降低了由于復(fù)雜操作或者外源性蛋白引起的細(xì)菌污染等事件，而且對細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)損傷小，可用于后續(xù)的細(xì)胞表面分子篩選、細(xì)胞藥物敏感試驗、細(xì)胞的分選與鑒定以及構(gòu)建人體重組皮膚模型，為表皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用上將具有廣泛的前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的人表皮細(xì)胞的差別消化方法分離的人表皮細(xì)胞。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。

實施例1

（1）材料和方法

組織：醫(yī)院手術(shù)廢棄的正常成人包皮組織

表皮培養(yǎng)液：kc培養(yǎng)基中添加l-谷氨酰胺和牛垂體提取物；

（2）細(xì)胞分離和培養(yǎng)

a、預(yù)備無菌玻璃培養(yǎng)皿于超凈臺中，給一個皿內(nèi)加入10ml75%酒精，再取三皿各加入10ml無菌pbs溶液；把取皮盒從包裝中取出，放入超凈臺，將彎頭鑷子和直鑷取出過火后靠在盛酒精的培養(yǎng)皿上；

b、將裝組織的瓶子在超凈臺外用75%酒精噴灑并用浸有75%的酒精紗布擦拭瓶口與瓶蓋交界處，在超凈臺內(nèi)打開瓶蓋，瓶口過火后用無菌鑷小心取出包皮組織浸入75%酒精溶液中30s，期間用彎頭鑷子拐彎部分將真皮面卷曲部分鋪開使其充分接觸酒精以祛除血污，減少表面污染；

c、將組織在pbs溶液中浸洗直至無血污，在平皿中用彎頭剪剝離去除疏松結(jié)締組織直至組織塊不再卷曲，完成后組織新鮮的pbs中，用手術(shù)刀切割組織約為3mm×9mm大?。?/p>

d、將切割好的組織塊每15塊轉(zhuǎn)入1個25ml血清瓶中，加入15mld-h酶消化液，消化液完全浸沒組織塊，蓋好瓶蓋用封口膜封口后置入4℃冰箱中8h，在加入d-h酶消化液及消化過程中應(yīng)避光；

e、預(yù)備50ml無菌血清瓶于超凈工作臺中，并加入d-h酶消化液量一半的37℃預(yù)熱的原代消化液，將浸泡組織的血清瓶從4℃中取出，將組織塊與d-h酶消化液一同傾入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，表皮面呈褐色，用無菌鑷小心將表皮撕下；

f、將表皮收集入預(yù)備好的消化液中，在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱消化10min，每2min震蕩一次，消化完成后，轉(zhuǎn)入超凈臺，每個25ml消化瓶中加入10ml血清終止液，用彎頭吸管輕柔吹打50次（每2秒1次）；

g、將無菌200目篩網(wǎng)(74μm)置入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，過濾，再給血清瓶中加入5ml血清終止液以收集瓶壁上殘留的細(xì)胞，過濾收集；濾液收集入50ml離心管中，再給培養(yǎng)皿中加入5ml血清終止液以收集培養(yǎng)皿中殘留的細(xì)胞，將液體轉(zhuǎn)入離心管，800rpm離心6min；

h、離心結(jié)束后傾出上清，加入pbs5ml，取彎頭吸管一根輕柔吹打細(xì)胞，上吸下打（6秒每次），待沉淀吹散后下吸上打6～8次（每次2秒）至細(xì)胞懸液完全混勻，再根據(jù)沉淀量補加pbs，使用彎頭吸管吹打2～3次（每次2秒），從細(xì)胞懸液的上半部分與下半部分各取適量懸液滴入不同的1.5mlep管中，分別取10μl進(jìn)行技術(shù)，并用0.4%的臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力，用westernblotting蛋白檢測表皮細(xì)胞生長因子表達(dá)水平；

i、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，按細(xì)胞的接種密度（3.5~3.75e6/瓶），計算所需要的t75一次性培養(yǎng)瓶數(shù)量，將t75一次性培養(yǎng)瓶放入超凈臺內(nèi)，底部做細(xì)胞批次標(biāo)記。向t75培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液，每瓶8ml，將細(xì)胞懸液沿培養(yǎng)瓶細(xì)胞貼壁面均分入瓶中，每個瓶中共加入培養(yǎng)液10ml，垂直搖晃培養(yǎng)瓶3~5次使全部培養(yǎng)液混勻后，將培養(yǎng)瓶水平拿起輕輕搖晃3~5次使細(xì)胞均勻分散。將培養(yǎng)瓶瓶口向內(nèi)水平置于37℃5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明實施例提供的人表皮細(xì)胞的差別消化方法分離的人表皮細(xì)胞參見圖1，可以看出，該方法簡單，快速，獲取細(xì)胞數(shù)量多且純度高，可建立活力較高的人表皮細(xì)胞庫，供臨床移植和體外重建人體皮膚模型所需。

本發(fā)明實施例提供一種人表皮細(xì)胞的差別消化方法，該方法包括如下幾個步驟：（1）在超凈臺中預(yù)備無菌玻璃培養(yǎng)皿，一個中加入10ml75%乙醇，三個中各加入10ml無菌pbs，將新鮮人皮膚組織浸入75%乙醇溶液30s，期間將真皮面卷曲部分鋪開使其充分接觸乙醇以去除血污，減少表面污染；（2）將無菌處理后的組織轉(zhuǎn)入pbs溶液中浸洗，1min后轉(zhuǎn)入另一pbs皿中繼續(xù)清洗至無血污，后將組織表皮面向下展于平皿中，去除皮下疏松結(jié)締組織，暴露致密結(jié)締組織，直至組織塊不再卷曲，此過程不超過10min，完成后轉(zhuǎn)入新鮮pbs中浸洗；（3）表皮面向下，將組織切割成為0.2~2cm2的大小；（4）將切割好的組織塊轉(zhuǎn)入25ml血清瓶中，每塊組織添加1mld-h酶消化液，消化液需完全浸沒組織塊，蓋好瓶蓋用封口膜封口后置入4℃冰箱，輕晃血清瓶使組織均勻分散于底部，消化8~10h，該消化過程避光；（5）浸泡過后的組織連同d-h酶消化液一同傾入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，表皮面呈褐色，用鑷子將表皮撕下，收集放入預(yù)備好的50ml原代消化液中，轉(zhuǎn)至37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中，消化10min，每2min震蕩一次；（6）消化完成后，每個25ml消化瓶中加入10ml血清終止液，并吹打50次，后過200目網(wǎng)篩，濾液收集入50ml離心管中，血清瓶也加入血清終止液過濾收集至離心管，800rpm離心6min；（7）離心后傾出上清，用pbs輕柔吹打細(xì)胞，上吸下打（6秒每次），待沉淀吹散后下吸上打6~8次（2秒每次）至細(xì)胞懸液完全混勻，再根據(jù)沉淀量補加pbs，使用彎頭吸管吹打2~3次（2秒每次），從細(xì)胞懸液的上半部分與下半部分各取適量懸液滴入不同的1.5mlep管中，加入計數(shù)板中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，用臺盼藍(lán)染色，檢測細(xì)胞活力，蓋上離心管后離心，800rpm，離心6min；（8）根據(jù)計數(shù)結(jié)果，按照3.5e6/瓶進(jìn)行接種，每瓶10ml表皮細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶瓶口向內(nèi)水平置于37℃5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；（9）獲得的表皮細(xì)胞經(jīng)westernblotting蛋白質(zhì)檢測表皮細(xì)胞生長因子表達(dá)水平，經(jīng)灰度分析結(jié)果顯示其灰度值達(dá)到9000以上?；谏鲜鰧嵤├拿枋觯撓椒ê唵我仔?，容易掌握，所需組織量小，0.2cm2的皮膚組織可獲取活力較強的表皮細(xì)胞109，而且提取過程耗時短，無額外的試劑，大大降低了由于復(fù)雜操作或者外源性蛋白引起的細(xì)菌污染等事件，而且對細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)損傷小，可用于后續(xù)的細(xì)胞表面分子篩選、細(xì)胞藥物敏感試驗、細(xì)胞的分選與鑒定以及構(gòu)建人體重組皮膚模型，為表皮細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用上將具有廣泛的前景。

以上所述，僅為本申請的具體實施方式，但本申請的保護(hù)范圍并不局限于此，任何在本申請揭露的技術(shù)范圍內(nèi)的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本申請的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。