一種用于診斷和預(yù)示乳腺癌的生物標(biāo)志物和檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤診斷領(lǐng)域，具體涉及乳腺癌檢測(cè)診斷標(biāo)志物和生物檢測(cè)試劑盒， 用于輔助診斷和預(yù)示乳腺癌。
【背景技術(shù)】
[0002] 2012年，Cell Research雜志在線(xiàn)發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院健康科學(xué)研究所胡國(guó)宏研究 組與上海交通大學(xué)Med-X中心徐學(xué)敏、胡曉芳研究組合作的最新研究成果Differential secretome analysis reveals CST6as a suppressor of breast cancer bone metastasis。該研究成果掲示了CST6在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。
[0003] 乳腺癌是對(duì)女性健康構(gòu)成最大威脅的一種惡性疾病，涉及多種基因異常，包括癌 基因的激活、抑癌基因的失活等，其發(fā)展是一個(gè)多因素多階段的過(guò)程。轉(zhuǎn)移不僅是惡性腫瘤 最重要的生物學(xué)特征之一，更是影響乳腺癌患者治療效果和導(dǎo)致死亡的主要原因，骨是乳 腺癌最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一。分泌蛋白質(zhì)組學(xué)不僅可以篩查參與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的 相關(guān)分子，也可以為臨床早期診斷和預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移預(yù)后提供有效的生物標(biāo)志物。該項(xiàng)研究利用 來(lái)源于乳腺癌MDA-MB-231不同轉(zhuǎn)移能力的各種亞系SCPs細(xì)胞，通過(guò)分泌蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)， 結(jié)果得到128種差異蛋白。其中調(diào)節(jié)酶活性的蛋白中，半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatins) 家族可能參與了乳腺癌細(xì)胞不同傾向轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控。結(jié)合全基因組表達(dá)芯片結(jié)果和甲 基化芯片結(jié)果分析，認(rèn)為cystatins家族成員CST6可能在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中起重要的調(diào)節(jié) 作用。該研究在低骨轉(zhuǎn)移的SCP4構(gòu)建shRNA后knock-downCST6,結(jié)果證明促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng) 增殖、克隆形成、侵襲和迀移。相反，高骨轉(zhuǎn)移能力的SCP2過(guò)表達(dá)CST6,結(jié)果證明發(fā)揮抑制 作用。此外，不同條件培養(yǎng)液中CST6蛋白水平的改變也可以影響細(xì)胞的侵襲和迀移，說(shuō)明 CST6是通過(guò)癌細(xì)胞的分泌作用從而發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明 CST6在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。
[0004] 迄今尚未見(jiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族中Cystatin SN和Cystatin S與乳腺癌 相關(guān)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供Cystatin SNmRNA和Cystatin SmRNA在診斷和預(yù) 示乳腺癌方面的聯(lián)合應(yīng)用，通過(guò)Cystatin SNmRNA和Cystatin SmRNA聯(lián)合檢測(cè)，提高診 斷和預(yù)示乳腺癌的特異性；本發(fā)明的第二目的在于提供Cystatin SNmRNA和Cystatin S mRNA聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，該試劑盒具有特異性高、靈敏度高和使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種診斷和預(yù)示乳腺癌的試劑，該試劑中含有能夠用于檢測(cè)標(biāo)志物Cystatin SN mRNA和Cystatin SmRNA濃度的試劑；所述Cystatin SNmRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Cystatin SmRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
[0008] 進(jìn)一步地，所述診斷和預(yù)示具體為診斷、療效評(píng)估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0009] 上述試劑在診斷和預(yù)示乳腺癌方面的應(yīng)用，用該試劑檢測(cè)出標(biāo)志物CystatinSN mRNA和CystatinSmRNA的濃度后，聯(lián)合CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的濃度對(duì) 乳腺癌進(jìn)行診斷和預(yù)示，聯(lián)合公式為： " cxpi-2.332 +Ο.ΟΟΒ?/ + 0.014?:>)
[0010] ρ=----* i+cxp(-2.332 + 0.0086- + 0.0i4b)
[0011] 其中，a=CystatinSNmRNA濃度，b=CystatinSmRNA濃度。
[0012] 進(jìn)一步地，所述診斷和預(yù)示具體為診斷、療效評(píng)估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
[0013] -種診斷和預(yù)示乳腺癌的試劑盒，包含CystatinSNmRNA定量檢測(cè)試劑和 CystatinSmRNA定量檢測(cè)試劑；所述CystatinSNmRNA定量檢測(cè)試劑包括如SEQIDN0. 7 和SEQIDNO. 8所示的檢測(cè)引物和核苷酸序列如SEQIDNO. 20所示的TaqMAN探針；所述 CystatinSmRNA定量檢測(cè)試劑包括如SEQIDNO. 9和SEQIDNO. 10所示的檢測(cè)引物和核 苷酸序列如SEQIDNO. 22所示的TaqMAN探針。
[0014] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括RPN1mRNA定量檢測(cè)試劑，RPN1mRNA的核苷酸序列 如SEQIDN0. 3所示；所述RPN1mRNA定量檢測(cè)試劑包括如SEQIDN0. 11和SEQIDN0. 12 所示的檢測(cè)引物和核苷酸序列如SEQIDNO. 24所示的TaqMAN探針。
[0015] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括特異捕獲CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和 RPN1mRNA的磁珠，所述特異捕獲CystatinSNmRNA的磁珠上結(jié)合有SEQIDNO. 4所示探 針，所述特異捕獲CystatinSmRNA的磁珠上結(jié)合有SEQIDNO. 5所示探針，所述特異捕獲 RPN1mRNA的磁珠上結(jié)合有SEQIDN0. 6所示探針。
[0016] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括 10XBuffer、dNTP、MgCl2、DMS0、DTT、Taq酶、UDG、逆 轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1 :特異性探針和非特異性探針富集CystatinSNmRNA比較結(jié)果；
[0018] 圖2 :特異性探針和非特異性探針富集CystatinSmRNA比較結(jié)果；
[0019] 圖3 :特異性探針和非特異性探針富集RPN1mRNA比較結(jié)果；
[0020] 圖4 :乳腺癌組織與癌旁組織中CystatinSNmRNA濃度的比值結(jié)果圖（C/T表示 乳腺癌組織/癌旁組織）；
[0021] 圖5 :乳腺癌組織與癌旁組織中CystatinSmRNA濃度的比值結(jié)果圖（C/T表示乳 腺癌組織/癌旁組織）。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以 對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。實(shí) 施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版， J.薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。
[0023] 實(shí)施例1 :磁珠法特異性富集尿液中CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1 mRNA
[0024] 根據(jù)CystatinSN、CystatinS和RPN1 (核糖體結(jié)合蛋白1)的mRNA序列設(shè)計(jì)捕獲 CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的特異探針（CystatinSNmRNA的核苷 酸序列如SEQIDNO. 1，CystatinSmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO. 2,RPN1mRNA的核苷 酸序列如SEQIDNO. 3):捕獲CystatinSNmRNA的探針為 5'-aaagagcacaactgtttcttctg ca(dA)30-3'（SEQIDN0·4)，捕獲CystatinSmRNA的探針為5'-taccaggtctattagaagca( dA)30-3'（SEQIDNO. 5)，捕獲內(nèi)參基因RPN1mRNA的探針為 5'-gatgagcttctcattctcaatg tacg(dA)30-3'（SEQIDNO. 6)。上述特異探針能夠與磁珠（GE，貨號(hào)為 3815-2103-010150) 的olig(dT)互補(bǔ)結(jié)合，得結(jié)合特異探針的磁珠。
[0025] 富集步驟如下：將新鮮尿液與樣本運(yùn)輸保存液按照體積比為2 :1的比例混合，得 處理后的尿液樣本，該處理后的尿液樣本4°C條件下可保存一周，_20°C條件下可保存1年； 然后分別將200μL含有磁珠的靶序列捕獲液加入到200μL處理后的尿液中，于75°C條件 下處理5分鐘；渦旋混勻后，室溫靜置15分鐘；然后將樣品置于磁性分離器上，5分鐘后， 吸棄上清，加入lmL漂洗液，渦旋混勻，上磁性分離器，5分鐘后，吸棄上清；最后室溫（18~ 25°C)靜置5分鐘，加入洗脫液20μL，槍頭吹打混勻，上磁力架5分鐘，將上清轉(zhuǎn)至新的EP 管中。
[0026] 富集過(guò)程中，樣品運(yùn)輸保存液中各組分濃度如下LiDS(十二烷基硫酸 鋰），10mMNaH2P04,10mMNa2HP04,5mMEDTA，7mMEGTA，ρΗ7· 5 ;靶序列捕獲液中各組分濃度 如下：135mMHEPES，1.25MLiCl，110mMLi0H，10mMEDTA，卩!17.0,50(^8/11^磁珠，2 4]\1捕 獲探針；漂洗液中各組分濃度如下：100mMHEPES，350mMNaCl，10mMNa0H，2mMEDTA，3% 乙醇，0. 2%羥基甲酯，0. 1%羥基丙酯，0. 1%SDS，pH7. 5 ;洗脫液中各組分濃度如下：20mM Tris-HCl，ρΗ7·5,ImMEDTA。
[0027] 同時(shí)以非特異性探針oligo(dT)以上述相同的方法非特異性富集mRNA。
[0028] 將上述富集獲得的mRNA通過(guò)定量PCR分別檢測(cè)CystatinSNmRNA、CystatinS mRNA和RPN1mRNA的相對(duì)含量，檢測(cè)所使用的引物如下：
[0029]CystatinSNmRNA檢測(cè)引物：上游引物：5' -agagccaggcaacagacc-3'（SEQID NO. 7)
[0030]下游引物：5' -gttcatggaaggcacagg-3'（SEQIDΝ0·8