專利名稱：高效表達(dá)山羊生長激素gh的乳腺特異性表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)山羊生長激素GH的乳腺特異性表達(dá)載體，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域，具體地講涉及促進(jìn)乳腺導(dǎo)管發(fā)育、提高奶產(chǎn)量的生長激素GH。
背景技術(shù)：
羊奶是我國奶業(yè)的重要組成部分，羊奶脂肪顆粒體積小，蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素 和生物活性物質(zhì)含量豐富。羊奶和牛奶相比，脂肪顆粒大小只有牛奶中的1/3，羊奶中脂肪 顆粒大小均勻，不飽和脂肪酸含量高，且呈良好的乳化狀態(tài)，羊奶乳蛋白中含量高，蛋白質(zhì) 結(jié)構(gòu)與母乳相同，蛋白凝塊細(xì)而軟，更利于人體吸收，我國雖是奶山羊飼養(yǎng)大國，但奶產(chǎn)量 低，難以滿足市場需求。研究表明，羊奶產(chǎn)量和泌乳期的乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量和泌乳能力密切相關(guān)。生長 激素是一種由垂體前葉腺分泌產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)激素，能夠直接或間接刺激細(xì)胞分裂，促 進(jìn)細(xì)胞增殖。對乳腺組織來說，生長激素最明顯的作用就是促進(jìn)乳腺導(dǎo)管形成，與乳腺基質(zhì) 細(xì)胞上的生長激素受體結(jié)合促進(jìn)山羊的乳腺上皮細(xì)胞的增殖，維持乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量，延 長泌乳期。Knight CH等發(fā)現(xiàn)在泌乳的奶山羊乳腺中，生長激素表現(xiàn)出維持乳腺上皮細(xì)胞數(shù) 量的功能。Capuco等研究也發(fā)現(xiàn)，生長激素能夠通過乳腺導(dǎo)管促進(jìn)乳腺細(xì)胞的增殖，進(jìn)而 延長泌乳維持期。皮下或肌肉注射生長激素可以延長泌乳期，增加奶產(chǎn)量，且奶成分基本沒 有變化。近年來，分子細(xì)胞生物學(xué)的研究表明生長激素是主要通過細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 影響細(xì)胞的增殖和分化的。Thomas MJ研究表明，在體外生長激素能夠激活Statl、Stat3、 Stat5的表達(dá)，Bromberg J等研究等激素的信號通路發(fā)現(xiàn)，Stat蛋白對乳腺的增殖和分化 中具有重要的作用，Iavni lovitch E等進(jìn)一步證實(shí)，妊娠期和泌乳期乳腺細(xì)胞的增殖和發(fā) 育和Stat5密切相關(guān)，MarionBoutinaud等對泌乳期的薩能奶山羊研究發(fā)現(xiàn)，GH能夠增加 轉(zhuǎn)錄激活因子Statl、Stat5影響乳腺細(xì)胞的增殖。這些研究表明，GH在增加奶產(chǎn)量方面具 有重要的作用，是增加奶產(chǎn)量的候選基因之一。通過常規(guī)育種方法費(fèi)時費(fèi)力，利用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)，將生長激素在泌乳期持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)乳的分泌、維持泌乳期乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量，延長 泌乳期，可以很快增加羊奶產(chǎn)量，適應(yīng)市場需要。本研究從薩能奶山羊中克隆得到一個與乳腺導(dǎo)管發(fā)育和乳腺上皮細(xì)胞增殖相關(guān) 的基因gh，通過構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pcGH，研究gh基因在體外人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37 上的表達(dá)情況，為進(jìn)一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)gh基因奶山羊提供試驗材料。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于公開一個山羊生長激素基因gh促進(jìn)泌乳功能的基因工程應(yīng) 用，構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pcGH，山羊乳腺細(xì)胞通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，檢測轉(zhuǎn)染后GH 的表達(dá)量，證實(shí)載體的有效性，為后期生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶山羊提供了理論依據(jù)，打下了堅實(shí)的基 石出。
技術(shù)方案高效表達(dá)山羊生長激素(GH)的乳腺特異性表達(dá)載體pcGH的構(gòu)建，其特征是gh基 因具有如SEQ ID NO. 1所示的序列，其構(gòu)建方法包括1)薩能奶山羊生長激素gh的克隆參照Genbank登陸號Y00767山羊生長激素gh基因的cDNA序列設(shè)計一對擴(kuò)增生 長激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoR I限制性酶切位點(diǎn)，下游引物上引入SalI 限制性酶切位點(diǎn)上游引物ZP3 5，-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3，下游引物ZP4 5，-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3，以薩能奶山羊肝臟組織的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min，95°C 30sec，65°C 30sec, 72°C 40sec, 30個循環(huán)，72°C IOmin, 4°C IOmin ；將PCR產(chǎn)物連接到pMD19_T載體上，送交上 海生工測序。測序后獲得具有完整編碼區(qū)的薩能奶山羊生長激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；2)薩能奶山羊β-乳球蛋白5端和3端的克隆參照已發(fā)表的山羊的β -乳球蛋白序列Genbank登陸號Ζ33881，設(shè)計一對擴(kuò)增 β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位點(diǎn)，在下游引物上引入 EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，引物序列如下上游引物ZP1 5，-ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3，下游引物ΖΡ2 :5，-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3’設(shè)計一對擴(kuò)增乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分別引入SalI限 制性酶切位點(diǎn)，引物序列如下上游引物ΖΡ5 :5，-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3’下游引物ΖΡ6 5，-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3，以薩能奶山羊肝臟組織提取的DNA為模板，用合成的ΖΡ1、ΖΡ2引物PCR擴(kuò)增β-乳 球蛋白5端，PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min，95°C 30sec，61°C 30sec， 72°C 150sec，30個循環(huán)，72°C 10min，4°C IOmin ；將PCR產(chǎn)物連接到pMD19_T載體上，測序后 獲得具有薩能奶山羊β “乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO. 2 ；用合成的ZP5、ZP6引物擴(kuò)增β -乳球蛋白3端，PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反 應(yīng)條件95°C 預(yù)變性 5min ；95 °C 30sec,67°C 30sec,72°C 40sec,30 個循環(huán)；72°C IOmin, 4 °C lOmin，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，測序后獲得具有薩能奶山羊β-乳球蛋白3 端的 DNA 序列 SEQ ID Ν0. 3 ；3)乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建將SEQ ID NO. 1序列、SEQ ID N0. 2和序列SEQ ID N0. 3序列克隆至骨架載體 pIRES2-EGFP上，獲得乳腺特異性表達(dá)載體pcGH。有益效果生長激素基因可以提高哺乳動物的泌乳持續(xù)性。體外轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37 結(jié)果顯示，從48小時到第72小時，轉(zhuǎn)染組(只轉(zhuǎn)染乳腺特異性表達(dá)載體pcGH) GH表達(dá)量均 高于對照組(正常培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37未轉(zhuǎn)染載體pcGH)。其中在第48小時轉(zhuǎn)染組的GH表達(dá)量136. 48ng/mL極顯著高于對照組的GH表達(dá)量29. 33ng/mL。轉(zhuǎn)染組GH的表 達(dá)增加量約是對照組的4. 5倍。本發(fā)明的gh可作為目的基因?qū)氩溉閯游?，促進(jìn)哺乳動物的乳腺發(fā)育，提高泌乳 性能，以進(jìn)行動物品種改良，所編碼的蛋白質(zhì)具有促進(jìn)泌乳功能。攜帶有本發(fā)明gh的乳腺特異性表達(dá)載體可通過使用脂質(zhì)體、電轉(zhuǎn)等常規(guī)生物學(xué) 方法轉(zhuǎn)化薩能奶山羊細(xì)胞，并將成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)gh基因奶山羊。下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
四

圖1 乳腺特異性表達(dá)載體pcGH的質(zhì)粒圖譜圖2 :GH基因的克隆圖片圖3 β _乳球蛋白5端基因的克隆圖片圖4 β _乳球蛋白3端基因的克隆圖片圖5:pcGH質(zhì)粒Xho I, EcoRI, Sal I酶切驗證圖片圖6 人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcGH后ELISA測定GH表達(dá)量
五具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先擴(kuò)增目的基因山羊的gh和山羊的β -乳球蛋白5端及3端基因，然后 以乳腺特異性表達(dá)載體pIRES2-EGFP為基礎(chǔ)構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pcGH，最后通過脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37，并且提取蛋白通過ELISA方法，檢測轉(zhuǎn)染后的 表達(dá)效果。具體涉及的材料和試劑如下羊腦垂體，來自于無感染病史的薩能奶山羊，將組織于液氮中保存(購自南京溧 水種山羊養(yǎng)殖基地)，pIRES2-EGFP載體(購自Clontech)；人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37 (南京凱 基生物公司；貨號KG035 ；名稱人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37)，載體pMD19_T，JM109菌株(購自 大連寶生物，Takara)。試劑Trizol、MLV-反轉(zhuǎn)錄酶購自 promega 公司，rTaq 酶、pMD19_T 載體、Agarose Gel DNA Purification Kit、內(nèi)切酶 Xho I、EcoRI、Sal I 等均購自 TAKARA 公司；無內(nèi)毒 素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，質(zhì)粒純化試劑盒Wizard PureFection Plasmid DNA Purification system 購自 Promega 公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000,胎牛血清購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)基(貨 號C12430)購自Gibco公司；青鏈雙抗(購自碧云天)；胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松(購 自南京生興生物有限公司)；鼠抗羊生長激素ELISA試劑盒(購自R&D)，其他試劑均為國產(chǎn) 或進(jìn)口分析純級。1載體pcGH的構(gòu)建1. 1山羊生長激素(GH)的克隆參照已發(fā)表的山羊生長激素gh基因的cDNA序列(Genbank登陸號Y00767)設(shè)計 一對擴(kuò)增生長激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，下游引物上引入SalI限制性酶切位點(diǎn)上游引物ZP3 5，-TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA-3，下游引物ZP4 5，-TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG-3，以上引物由上海生工公司合成。PCR 反應(yīng)體系為 25uL, PCR 反應(yīng)條件95°C預(yù)變性 5min,95°C 30sec，65°C 30sec, 72 °C 40sec，30 個循環(huán)，72°C 10min,4°C IOmin ；反應(yīng)結(jié)束后，取 20uL，在 1.0% 瓊脂糖 中電泳，切取目的條帶，經(jīng)DNA純化試劑盒回收后，連接到PMD19-T載體上，獲得質(zhì)粒 PMD19-T-GH，經(jīng)菌落PCR及酶切驗證后，送去測序。所獲得的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與 Genbank上已發(fā)表的序列比對。所克隆的生長激素序列與已經(jīng)在Genebank上發(fā)表的序列的 同源性為99%，僅在301處有一個堿基T突變成C，進(jìn)一步分析表明這個點(diǎn)突變并不引起氨 基酸的突變，和Genebank上已發(fā)表的山羊序列表達(dá)相同的生長激素蛋白。1. 2山羊β -乳球蛋白5端及3端的克隆山羊的乳球蛋白是山羊的主要乳清蛋白，該蛋白僅在乳腺中特異性表達(dá)，通 過對綿羊的乳球蛋白基因研究發(fā)現(xiàn)，乳球蛋白上游_406bp的表達(dá)載體就可啟動 外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺組織特異性表達(dá)，用綿羊的乳球蛋白5端作為調(diào)控元 件構(gòu)建的表達(dá)載體，已經(jīng)將人的α -1-抗胰蛋白酶、凝血酶III等在山羊乳腺中特異性表 達(dá)。山羊的β-乳球蛋白和綿羊的β-乳球蛋白的5’端調(diào)控區(qū)同源性高達(dá)99%，利用山 羊的乳球蛋白為調(diào)控元件也可以指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)，成勇等利用山羊 的乳球蛋白5端為調(diào)控元件，成功在小鼠的乳腺中表達(dá)了人乳鐵蛋白。因此，山羊的 β-乳球蛋白可以作為啟動外源基因表達(dá)在山羊乳腺中特異性表達(dá)的啟動元件。本試驗以薩能奶山羊的肝臟為材料，用液氮研磨山羊的肝臟組織，根據(jù)天根基因 組提取試劑盒提取基因組。參照已發(fā)表的山羊的β -乳球蛋白序列Genbank登陸號Ζ33881，設(shè)計一對擴(kuò)增 β-乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位點(diǎn)，在下游引物上引入 EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。引物序列如下上游引物ZP 1:5’ -ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG-3’下游引物ΖΡ2 5，-TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG-3，設(shè)計一對擴(kuò)增乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分別引入SalI限 制性酶切位點(diǎn)。引物序列如下上游引物ΖΡ5 5，-TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT-3，下游引物ΖΡ6 5，-ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT-3，以上引物由上海生工公司合成。以薩能奶山羊肝臟組織提取的DNA為模板，用合成的ΖΡ1、ΖΡ2引物PCR擴(kuò)增β-乳 球蛋白5端，PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性5min，95°C 30sec，61°C 30sec， 72°C 150sec，30個循環(huán)，72°C 10min,4°C IOmin ；將PCR產(chǎn)物連接到pMD19_T載體上，獲得質(zhì) 粒pMD19-T-BLG5，經(jīng)菌落PCR及酶切驗證后，送交上海生工測序。用合成的ZP5、ZP6引物擴(kuò)增β -乳球蛋白3端，PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反 應(yīng)條件95°C 預(yù)變性 5min ；95 °C 30sec,67°C 30sec,72°C 40sec,30 個循環(huán)；72°C IOmin, 4°C IOmin,將PCR產(chǎn)物連接到pMD19_T載體上，獲得質(zhì)粒pMD19_T_BLG3，經(jīng)菌落PCR及酶切驗證后，送交上海生工測序。所獲得的序列經(jīng)BLAST及DNAstar與Genbank上已發(fā)表的序列比對。結(jié)果表明 該序列與已發(fā)表的山羊β _乳球蛋白序列的5端和3端調(diào)控區(qū)的同源性為99 %，通過棚. gene-regulation, com/pub/programs, html在線分析表明，該序列包含β -乳球蛋白的外 顯子1及信號肽序列，在序列的420bp處存在乳腺因子(MGF)，在1946bp處存在有GR (糖皮 質(zhì)結(jié)合受體)，在678bp及2050bp處存在MPBF (乳蛋白結(jié)合因子)等乳腺特異性表達(dá)調(diào)控 元件；Whitelaw等(2000)發(fā)現(xiàn)在β -乳球蛋白3端polyA加尾信號前(-95bp—985bp)存 在MAR序列，該序列的存在能夠提高外源基因的基礎(chǔ)表達(dá)水平。本試驗的克隆β-乳球蛋 白3端的序列與已發(fā)表的山羊的乳球蛋白3端的同源性高達(dá)99%，可以減少插入位點(diǎn) 對生長激素表達(dá)水平的影響?；谝陨戏治霰砻鞒晒?gòu)建生長激素表達(dá)載體構(gòu)建成功，為 下一步生產(chǎn)高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶羊奠定了基礎(chǔ)。1. 3乳腺特異性表達(dá)載體pcGH的構(gòu)建1. 3. 1 載體 pIRES2-BLG5 的構(gòu)建將質(zhì)粒pIRES2_EGFP和步驟1. 2中獲得到pMD19_T_BLG5載體，同時用限制性核酸 內(nèi)切酶Xho I、EcoRI，分別回收5. 3kb和2. 2kb左右的片段，連接，獲得質(zhì)粒pIRES2_BLG5， 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株，菌落PCR篩選驗證陽性克隆，獲得2284bp的片段，目的條帶大小和 預(yù)期一致，說明乳球蛋白5端已連接到骨架載體上。1. 3. 2 載體 pIRES2-BLG5-GH 的構(gòu)建將上一步1. 3. 1獲得的質(zhì)粒pIRES2-BLG5和步驟1. 1中獲得到pMD19-T_GH，用限 制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Sal I酶切雙酶切，分別回收7. 5kb和654bp左右的片段。連接， 獲得質(zhì)粒pIRES2-BLG5-GH，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株，菌落PCR篩選驗證陽性克隆，目的條帶 大小和預(yù)期一致，說明生長激素已連接上。1. 3. 3載體pcGH的構(gòu)建將上一步1. 3. 2獲得的質(zhì)粒和步驟1. 2中獲得到pMD19_T_BLG3載體，分別用Sal I單酶切。酶切后，分別回收8. Okb和1. 8bp左右片段，連接獲得乳腺特異性表達(dá)載體pcGH， 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)菌株，菌落PCR篩選驗證陽性克隆，和限制性核酸內(nèi)切酶鑒定，目的條帶 大小和預(yù)期一致，表明成功構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pcGH。2乳腺特異性表達(dá)載體pcGH的提取及純化將乳腺特異性表達(dá)載體pcGH用OMIGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化質(zhì)粒， 具體操作步驟見說明書，提取的質(zhì)粒保存于_20°C，準(zhǔn)備細(xì)胞轉(zhuǎn)染。3人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37的培養(yǎng)從液氮中取出人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37，立即投入37 40°C溫水中快速晃動，直至 凍存液完全溶解。將細(xì)胞凍存液移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入約4mL培養(yǎng)液，放入37°C，5%的C02 培養(yǎng)。用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、鏈霉素lOOug/mL，青霉素100U/mL的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培 養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前l(fā)d，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底的70% 80%時，改用無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng) 基洗滌細(xì)胞2次，饑餓24小時后轉(zhuǎn)染。4轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37外源基因通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，通常48h后才能表達(dá)，選取48h、60h、72h測 定外源基因的表達(dá)情況，具體試驗方案如下
待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底的70% 80%時，將其接種到六個12孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪 滿皿底80 90%時，改用無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，換用無血無抗的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，24小時后用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前用無血無抗的培養(yǎng)基洗劑一次，轉(zhuǎn)染步驟按 Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)6h后棄去混合液，用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血 清、鏈霉素100ug/mL，青霉素100U/mL、氫化可的松5ug/mL，胰島素10ug/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白5ug/ mL的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后分別測定48h、60h、72h的表達(dá)量。5轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37后GH的檢測分別于48h、60h、72h收集細(xì)胞上清液，用鼠抗羊生長激素ELISA試劑盒檢測細(xì)胞 上清液中生長激素GH的含量，操作步驟按說明書進(jìn)行。結(jié)果顯示，從48小時到第72小時， 轉(zhuǎn)染組(只轉(zhuǎn)染乳腺特異性表達(dá)載體pcGH) GH表達(dá)量均高于對照組(正常培養(yǎng)的人乳腺癌 細(xì)胞Bcap-37未轉(zhuǎn)染載體pcGH)。其中在第48小時轉(zhuǎn)染組的GH表達(dá)量136. 48ng/mL極顯 著高于對照組的GH表達(dá)量29.33ng/mL。轉(zhuǎn)染組GH的表達(dá)增加量約是對照組的4. 5倍。以 上結(jié)果表明本專利構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體PcGH可以在乳腺上皮細(xì)胞上高效的表達(dá) 生長激素基因。
權(quán)利要求
一種高效表達(dá)山羊生長激素GH的乳腺特異性表達(dá)載體，其gh基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列，其構(gòu)建方法包括1)薩能奶山羊生長激素gh的克隆參照Genbank登陸號Y00767山羊生長激素gh基因的cDNA序列設(shè)計一對擴(kuò)增生長激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，下游引物上引入SalI限制性酶切位點(diǎn)上游引物ZP35’ TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA 3’下游引物ZP45’ TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG 3’以薩能奶山羊肝臟組織的總RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，95℃30sec，65℃30sec，72℃40sec，30個循環(huán)，72℃10min，4℃10min；將PCR產(chǎn)物連接到pMD19 T載體上，送交上海生工測序。測序后獲得具有完整編碼區(qū)的薩能奶山羊生長激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO.1；2)薩能奶山羊β 乳球蛋白5端和3端的克隆參照已發(fā)表的山羊的β 乳球蛋白序列Genbank登陸號Z33881，設(shè)計一對擴(kuò)增β 乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位點(diǎn)，在下游引物上引入EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，引物序列如下上游引物ZP15’ ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG 3’下游引物ZP25’ TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG 3’設(shè)計一對擴(kuò)增β 乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分別引入SalI限制性酶切位點(diǎn)，引物序列如下上游引物ZP55’ TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT 3’下游引物ZP65’ ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT 3’以薩能奶山羊肝臟組織提取的DNA為模板，用合成的ZP1、ZP2引物PCR擴(kuò)增β 乳球蛋白5端，PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min，95℃30sec，61℃30sec，72℃150sec，30個循環(huán)，72℃10min，4℃10min；將PCR產(chǎn)物連接到pMD19 T載體上，測序后獲得具有薩能奶山羊β 乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO.2；用合成的ZP5、ZP6引物擴(kuò)增β 乳球蛋白3端，PCR反應(yīng)體系為25uL，PCR反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5min；95℃30sec，67℃30sec，72℃40sec，30個循環(huán)；72℃10min，4℃10min，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19 T載體上，測序后獲得具有薩能奶山羊β 乳球蛋白3端的DNA序列SEQ ID NO.3；3)乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建將SEQID NO.1序列、SEQ ID NO.2和序列SEQ ID NO.3序列克隆至骨架載體pIRES2 EGFP上，獲得乳腺特異性表達(dá)載體pcGH。
全文摘要
本發(fā)明公開了高效表達(dá)山羊生長激素GH的乳腺特異性表達(dá)載體，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。GH的cDNA序列見SEQ ID NO.1。生長激素既可以促進(jìn)乳腺導(dǎo)管形成，也可以促進(jìn)山羊的乳腺上皮細(xì)胞的增殖，從而增加產(chǎn)奶量。將本發(fā)明構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體pcGH采用脂質(zhì)體法，導(dǎo)入體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37中，在轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；采用ELISA的方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的GH含量。結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染pcGH的空白組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcGH組細(xì)胞GH表達(dá)量顯著提高。表明pcGH載體可已在乳腺細(xì)胞上成功表達(dá)GH，為下一步生產(chǎn)轉(zhuǎn)gh基因奶山羊奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/85GK101985635SQ201010544629
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者庾慶華, 張強(qiáng), 楊倩, 林 建 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)