專利名稱：一種與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療腫瘤的多肽，特別是一種與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，本發(fā)明還涉及制備該多肽的方法，以及該多肽在制備治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移藥物、制備用于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移早期診斷試劑盒上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤。全球乳腺癌患病率和死亡率均居女性惡性腫瘤首位，占所有女性癌癥病例數(shù)的23%和癌癥死亡數(shù)的14%。乳腺癌發(fā)展到晚期的典型表現(xiàn)是遠(yuǎn)處擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，主要轉(zhuǎn)移到骨骼和腦等部位。其中，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率占轉(zhuǎn)移病例的10%-16%。近年來，隨著患者生存期的延長和影像診斷技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的檢出率逐年提高。但是，現(xiàn)有的藥物不能有效控制和治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移。近年來，抗體藥物治療腫瘤受到廣泛的關(guān)注，在治療乳腺癌方面，單克隆抗體類藥物一赫賽汀，對Her-2陽性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌有較好的療效。對于Her-2陽性的乳腺癌患者，放療聯(lián)合赫賽汀治療是標(biāo)準(zhǔn)治療方法。但是，在診斷出遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶前使用赫賽汀非但不能有效抑制腦轉(zhuǎn)移發(fā)生，還 會(huì)使腦轉(zhuǎn)移的相對危險(xiǎn)度提高1.57倍。據(jù)報(bào)道，在診斷出乳腺癌腦轉(zhuǎn)移之后，50%的患者對化療敏感，轉(zhuǎn)移癥狀穩(wěn)定，但是有一半患者死于進(jìn)行性腦轉(zhuǎn)移。赫賽汀在腦部有效性較差可能由于赫賽汀對血腦屏障滲透性較低。在腦脊液中赫賽汀的水平僅是注射劑量的1/420，放療后濃度增加到1/49-1/76，但仍然不能達(dá)到有效治療水平。多肽藥物分子量小、活性高、穿透力強(qiáng)、親和力高、特異性高、毒性低，可以克服上述抗體治療中存在的問題，目前還沒有靶向治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的多肽類藥物。因此，發(fā)現(xiàn)能與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的早期診斷和有效治療具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。專利CN101068935A公開了新的人基因B1194，A2282V1，A2282V2和A2282V3，它們的表達(dá)在乳腺癌中顯著增加，這些基因及其編碼的多肽可用于例如診斷乳腺癌，并作為開發(fā)抗乳腺癌藥物的靶分子。專利CN101334411A公開了作用于治療CXCR4受體介導(dǎo)的乳腺癌的多肽藥物的篩選、修飾方法、標(biāo)記及其應(yīng)用。兩篇專利文獻(xiàn)雖然都是與治療乳腺癌有關(guān)的多肽，但都未提及能和乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:背景技術(shù)中提到雖然有專利文獻(xiàn)涉及與治療乳腺癌有關(guān)的多肽，但未提及能和乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，本發(fā)明的目的在于提供一種能與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合，還具有良好的腫瘤靶向性、可內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞的多肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供制備與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述多肽在制備用于治療乳腺癌藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述多肽在制備用于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移早期診斷的試劑盒的應(yīng)用。
技術(shù)方案:本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明制備與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，利用噬菌體展示技術(shù)，以乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR作為正篩細(xì)胞，以乳腺癌親代細(xì)胞系MDA-231P作為負(fù)篩細(xì)胞，進(jìn)行多輪全細(xì)胞消減篩選，篩選出與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體克隆。噬菌體單克隆化后通過細(xì)胞ELISA初步鑒定120個(gè)噬菌體克隆與細(xì)胞結(jié)合特性，選取P/N值大于3的強(qiáng)陽性克隆進(jìn)行測序，成功測序的22個(gè)噬菌體克隆共發(fā)現(xiàn)3種序列，將其中占有絕對優(yōu)勢的噬菌體克隆的氨基酸序列命名為BrBPl，經(jīng)測序，其基因序列如SEQIDNO:1所示，將所測的BrBPl序列經(jīng)過人工合成方法得到與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的BrBPl多肽。本發(fā)明通過ELISA鑒定噬菌體克隆與多種細(xì)胞系的結(jié)合，證實(shí)了噬菌體克隆與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞結(jié)合的特異性，通過競爭抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步鑒定噬菌體克隆與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞結(jié)合的特異性。本發(fā)明還分別從體外細(xì)胞水平和體內(nèi)水平鑒定了噬菌體克隆與靶細(xì)胞結(jié)合的特異性。本發(fā)明還進(jìn)一步證實(shí)了所述多肽可內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，且呈現(xiàn)孵育時(shí)間依賴性。本發(fā)明所述的多肽可內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，偶聯(lián)抗腫瘤藥物后可進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)殺傷靶細(xì)胞，大大增強(qiáng)抗腫瘤效果，可用于制備治療乳腺癌藥物。本發(fā)明所述的多肽通過與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合，可制備試劑盒用于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移早期診斷。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果有，1、本發(fā)明篩選得到了一種與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，填補(bǔ)了目前缺乏與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞結(jié)合的多肽的空白；2、本發(fā)明篩選得到多肽為可通過人工方法合成的小分子多肽，分子量小、活性高、穿透力強(qiáng)、親和力高、特異性高、毒性低，適合作為靶向治療的載體；3、本發(fā)明篩選得到的多肽在體外和體外均具有良好的腫瘤靶向性，為該多肽的臨床前深入研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；4、本發(fā)明篩選得到的多肽可內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，偶聯(lián)抗腫瘤藥物后可進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)殺傷靶細(xì)胞，大大增強(qiáng)抗腫瘤效果。


圖1是細(xì)胞ELISA檢測的120個(gè)噬菌體單克隆的P/N比值圖；圖2是ELISA檢測Phage89、VCSMl3噬菌體克隆與不同腫瘤及正常細(xì)胞系親和力對比柱狀圖；圖3是BrBPl特異肽、Control對照肽競爭抑制Phage89與MDA-231BR結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
圖4 是熒光標(biāo)記肽 BrBPl-K(5-TAMRA)、Control-K(5-TAMRA)與細(xì)胞系 MDA-231BR、HL-7702結(jié)合情況的細(xì)胞免疫熒光圖(放大倍數(shù)400X );圖5A是不同濃度BrBPl-K (5-TAMRA)與MDA-231BR結(jié)合的流式結(jié)果圖；圖5B是不同濃度Control-K (5-TAMRA)與MDA-231BR結(jié)合的流式結(jié)果圖5C 是定量分析圖 5A 和 5B 不同濃度 fcBPl-K (5-TAMRA)、Control_K (5-TAMRA)與MDA-231BR結(jié)合的陽性細(xì)胞百分含量圖；圖6是BrBPl競爭抑制BrBPl-K (5-TAMRA)與MDA-231BR結(jié)合的共聚焦顯微鏡結(jié)果圖(放大倍數(shù)400X);圖7是體內(nèi)回輸實(shí)驗(yàn)中噬菌體克隆Phage89及VCSM13在腫瘤及正常組織器官回收噬菌體滴度比值圖；圖8是近紅外熒光標(biāo)記肽fcBPl-K (Cy5.5)、Control_K (Cy5.5)不同時(shí)間點(diǎn)的近紅外活體成像圖；圖9 是熒光標(biāo) 記肽 fcBPl-K (5-TAMRA)、Contro 1-K (5-TAMRA)與 MDA-231BR 孵育不同時(shí)間的內(nèi)化情況圖(放大倍數(shù)400 X )。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料、主要試劑及配方如下:主要實(shí)驗(yàn)材料:1、細(xì)胞株:乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR和乳腺癌親代細(xì)胞系MDA-231P由美國國家癌癥研究所惠贈(zèng)。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、卵巢癌細(xì)胞系SK-0V-3、胰腺癌細(xì)胞系PANC-1、胃癌細(xì)胞系BGC-823、結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、前列腺癌細(xì)胞系PC-3、肝癌細(xì)胞系SMMC7721、人胚胎肝細(xì)胞系HL-7702、人胃粘膜永生化細(xì)胞系GES-1、人胚胎腎細(xì)胞系293T均購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；2、噬菌體展示 12 肽庫 Ph.D.-12 及宿主菌 ER2738:購自 New England Biolabs ；3、裸鼠:購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。主要試劑及配方:主要試劑:1、細(xì)胞培養(yǎng)試劑:胎牛血清(GIBC0)、DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO)、DMS (Sigma)；2、卩遼菌體展示肽庫篩選主要試劑:X_gal、DMF、NaN3> Tween-20、BSA、甘氨酸、四環(huán)素均購自Amresco ;蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)XOID ；3、特異性鑒定主要試劑:HRP標(biāo)記鼠抗M13抗體(GE Healthcare)、Alexa Fluor555標(biāo)記羊抗鼠抗體(Invitrogen)。主要試劑配方:1、LB 培養(yǎng)基:每升含 IOg Bacto-Tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl。高壓滅菌，室溫貯存；2、LB/IPTG/Xgal平板:LB培養(yǎng)基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低于70°C時(shí)，加入Iml IPTG/Xgal，混勻倒平板。平板4°C避光貯存；3、頂層瓊脂:每升含 IOg Bacto-Tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, IgMgCl2.6H20, 7g瓊脂粉。高壓滅菌，分成50ml等份。固體培養(yǎng)基室溫貯存，用時(shí)微波爐融化；4、四環(huán)素貯液:以20mg/ml的濃度溶于50%乙醇中，_20°C避光貯存，用前搖勻；5、LB-Tet平板:LB培養(yǎng)基+15g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低于70°C時(shí)，加入Iml四環(huán)素貯液，混勻倒平板，平板4°C避光貯存；
6、封阻緩沖液:0.1M NaHCO3 (pH 8.6)，5mg/ml BSA, 0.02% NaN3,過濾除菌，4°C存；7、TBS:50mM Tris-HCl (pH 7.5)，150mM NaCl，高壓滅菌，室溫貯存；8、PBS:每升含 NaCl 8.00g, KCl 0.20g, Na2HPO4.12H20 3.58g, KH2PO4 0.24g,PH=7.2，高壓滅菌，室溫存儲(chǔ)；9, PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5M NaCl，高壓滅菌，室溫貯存；10、碘化物緩沖液:10mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA, 4M NaI。室溫避光貯存；11、IPTG/X-gal 配方:將 1.25g IPTG (isopropyl β - D-thiogalactoside)和 IgX-gal溶于25ml 二甲基甲酰胺中。溶液_20°C避光貯存；12、TMB 顯色液:A 液:每升含 18.41g Na2HPO4.12H20，5.1Og 檸檬酸，0.60g 過氧化氫尿素，ΡΗ=5.0 ；B液:EDTA.2Na 0.146g，檸檬酸0.15g溶于800ml蒸餾水，逐滴加入TMBC(0.1gTMB+1Oml無水乙醇)，定容至IL ；工作液:A液和B液1:1混勻，避光操作，現(xiàn)用現(xiàn)配。實(shí)施例1BrBPl多肽的篩選和制備本發(fā)明通過下述方法和步驟篩選和制備BrBPl多肽。1、與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系結(jié)合的噬菌體克隆的初步篩選采用噬菌體展示技術(shù)，進(jìn)行多輪全細(xì)胞消減篩選，初步篩選出與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR結(jié)合的噬菌體克隆，具體步驟如下:第一輪篩選，僅以乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR進(jìn)行正篩。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR細(xì)胞用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5X 105/ml，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿(60X 15mm3)，待細(xì)胞生長至80%_90%融合度時(shí)，進(jìn)行篩選。篩選具體步驟如下:(I)封閉:用移液器吸出上述MDA-231BR細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用IXTBS洗滌細(xì)胞3次后，加入無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)2h。再去除無血清DMEM，加入0.5%[m/v]BSA/TBS的封閉液，37°C封閉Ih ；(2)孵育:去除封閉液，加入IX IO11Pfu噬菌體12肽庫，37°C溫和搖動(dòng)Ih ；(3)洗滌:去除上清，用 TBST (TBS+0.l%[v/v]Tween-20)緩沖液洗滌 6 次；(4)洗脫:用非特異性洗脫緩沖液0.2M Glycine-HCl (PH 2.2)，lmg/ml BSA室溫下溫和搖動(dòng)lOmin，洗脫液收集后加入150ullM Tris-HCl (PH 9.1)中和;(5)擴(kuò)增:洗脫液測定度后剩余洗脫液加入處于對數(shù)生長前期的20ml ER2738培養(yǎng)物中進(jìn)行擴(kuò)增，用于下一輪篩選。第二輪篩選，先以乳 腺癌親代細(xì)胞系MDA-231P進(jìn)行負(fù)篩，再用乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR進(jìn)行正篩。在孵育環(huán)節(jié)，先將第一輪篩選的次級庫與MDA-231P孵育Ih后，洗滌2次后，上清及洗滌液加入MDA-231BR進(jìn)行孵育lh。同時(shí)，在本輪篩選中，負(fù)篩洗滌液TBST中Tween-20濃度為0.5%，正篩篩洗滌液TBST中Tween-20濃度為0.3%，正篩洗滌8次。第三輪篩選，先以乳腺癌親代細(xì)胞系MDA-231P進(jìn)行負(fù)篩，再用乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR進(jìn)行正篩。在孵育環(huán)節(jié)，先將第二輪篩選的次級庫與MDA-231P孵育Ih后，洗滌I次后，上清及洗滌液加入MDA-231BR進(jìn)行孵育lh。同時(shí)，在本輪篩選中，負(fù)篩洗滌液TBST中Tween-20濃度為0.3%，正篩篩洗滌液TBST中Tween-20濃度為0.5%，正篩洗滌10次。第四輪篩選，先以乳腺癌親代細(xì)胞系MDA-231P進(jìn)行負(fù)篩，再用乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-231BR進(jìn)行正篩。在孵育環(huán)節(jié)，先將第三輪篩選的次級庫與MDA-231P孵育Ih后，上清加入MDA-231BR中孵育lh。同時(shí)，在本輪篩選中，負(fù)篩洗滌液TBST中Tween-20濃度為
0.1%，正篩篩洗滌液TBST中Tween-20濃度為0.5%，正篩洗滌10次。在LB/IPTG/Xgal平板上測定第四輪淘選所得洗脫物滴度。從第四輪篩選所得洗脫物滴度板上用滅菌牙簽或吸頭挑取120個(gè)藍(lán)色噬菌斑到至Iml對數(shù)生長前期的ER2738培養(yǎng)管中，擴(kuò)增單克隆噬菌體。根據(jù)每輪篩選噬菌體洗脫液的滴度，計(jì)算得率及富集度。得率=回收噬菌體數(shù)/投入噬菌體數(shù)。富集度=第η輪篩選得率/第η-1輪篩選得率(η >2)。整個(gè)篩選過程的選擇壓及富集情況如表I所示，四輪篩選，每一輪的得率較上一輪都有不同程度提高，四輪篩選后，與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系結(jié)合的噬菌體克隆合計(jì)富集了43.9 倍。表I與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系結(jié)合的多肽篩選的選擇壓控制及噬菌體克隆的富集情況
權(quán)利要求
1.一種與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，命名為BrBPl，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行: (1)采用噬菌體展示技術(shù)，進(jìn)行多輪全細(xì)胞消減篩選，初步篩選出與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系結(jié)合的嗤囷體克隆； (2)隨機(jī)挑出若干個(gè)噬菌體克隆，通過細(xì)胞ELISA方法初步鑒定挑選出的噬菌體克隆與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的結(jié)合水平，并選擇強(qiáng)陽性噬菌體克隆進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)； (3)將上述強(qiáng)陽性噬菌體克隆擴(kuò)增處理后進(jìn)行測序，其中一種噬菌體克隆的氨基酸序列為權(quán)利要求1所述的BrBPl多肽； (4)將上述BrBPl多肽通過人工方式合成。
3.權(quán)利要求1所述的與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽在制備用于治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移藥物的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽在制備用于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移早期診斷的試劑盒的 應(yīng)用 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞特異性結(jié)合的BrBP1多肽，本發(fā)明還涉及制備該多肽的方法，包括采用噬菌體展示技術(shù)，進(jìn)行多輪全細(xì)胞消減篩選，篩選出與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系結(jié)合的噬菌體克??；隨機(jī)挑出若干個(gè)噬菌體克隆，通過細(xì)胞ELISA方法選擇強(qiáng)陽性噬菌體克隆；將強(qiáng)陽性噬菌體克隆擴(kuò)增后進(jìn)行測序，將測得的BrBP1多肽通過人工方式合成。本發(fā)明還涉及該多肽在制備用于治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移藥物、用于乳腺癌腦轉(zhuǎn)移早期診斷的試劑盒上的應(yīng)用。該多肽可通過人工方法合成，分子量小、活性高、穿透力強(qiáng)、親和力高、特異性高、毒性低，在體內(nèi)體外都具有良好的腫瘤靶向性，還可內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，適合作為靶向治療的載體。
文檔編號A61P35/04GK103145803SQ20121053867
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者張建瓊, 付波, 張瑩 申請人:東南大學(xué)