專利名稱：一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡及制備方法和應(yīng)用的制作方法
一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡及制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米超分子材料制備，特別是一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
刺激響應(yīng)囊泡因其在化學(xué)、生物和材料科學(xué)等領(lǐng)域有著諸多重要的應(yīng)用價(jià)值而在近年受到廣泛的關(guān)注，參見1) G. Fuks, R. M. Talom, F. Gauffre. Chem. Soc.Rev. 2011, 40, 2475-2493 ； 2 ) D. M. Vriezema, M. C. Aragones, J. A. A. ff. Elemans,J. J. L. M. Cornelissen, A. E. Rowan, R. J. M. Nolte. Chem. Rev. 2005, 105,1445 - 1489 ；3)X. Guo, F. C. SzokaJr. Acc. Chem. Res. 2003，36，335 - 341。利用刺激響應(yīng)囊泡對(duì)藥物進(jìn)行負(fù)載而后將負(fù)載的藥物在特定信號(hào)響應(yīng)的位點(diǎn)靶向地進(jìn)行釋放成為其中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，這是因?yàn)榘邢蛩幬飩鬟f在提高負(fù)載藥物藥效的同時(shí)還可以降低藥物的毒副作用。目前報(bào)道的刺激響應(yīng)囊泡大多是對(duì)外界光、電、熱和PH等刺激信號(hào)進(jìn)行響應(yīng)的體系，參見1)C. Wang, Q. Chen, H. Xu, Z. Wang, X. Zhang. Adv. Mater. 2010, 22, 2553-2555 ；2) A. Napoli,M. Valentini,N. Tirelli,M. Muller, J. A. HubbelI. Nat. Mater. 2004，3，183-189 ；3)K. Wang,D. -S. Guo, Y. Liu. Chem. Eur. J. 2010, 16, 8006-8011 ；4)M. Lee, S. -J. Lee, L. -H. Jiang. J. Am.Chem. Soc. 2004, 126，12724-12725，而對(duì)于生物體內(nèi)存在的酶進(jìn)行響應(yīng)的囊泡體系還并不多見，參見D. -S. Guo, K. Wang, Y. -X. Wang, Y. Liu. J. Am. Chem. Soc. 2012，134，10244-10250。酶響應(yīng)信號(hào)不但是生物相容的，而且具有高的靈敏度和選擇性，此外許多疾病都與酶的非正常表達(dá)有關(guān)，例如，在病變的胰腺組織中胰蛋白酶就會(huì)過表達(dá)從而導(dǎo)致其含量高于正常值，參見1) P. K. Buamah, A. ff. Skillen. Clin. Chem. 1985，31，876-877 ；2) A. F. Paszcuk,N. L. M. Quintao, E. S. Fernandes, L. Juliano, K. Chapman, P. Andrade-Gordon, Μ. Μ. Campos,N. Vergnolle, J. B. Calixto. Eur. J. Pharmacol. 2008, 581, 204-215 ；3) Z. Lu, F. Wu, X. Miao,ff. Yu. Clin. J. Med. Offic. 2008, 36，488-490，因而設(shè)計(jì)包括胰蛋白酶在內(nèi)的酶響應(yīng)囊泡對(duì)相關(guān)藥物進(jìn)行負(fù)載并將其在特定酶位點(diǎn)靶向地進(jìn)行釋放具有重大的理論意義和在生物醫(yī)藥領(lǐng)域廣闊的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用前景。然而，將酶響應(yīng)位點(diǎn)引入到囊泡體系中通常需要復(fù)雜和耗時(shí)的共價(jià)鍵合成，這不 但提高了制備成本，而且還會(huì)將有機(jī)溶劑和毒性試劑在合成過程中引入到囊泡體系中從而降低了其生物兼容性和酶反應(yīng)的活性。除共價(jià)鍵合成的方法外，利用非共價(jià)鍵相互作用的超分子手段也可以智能地構(gòu)筑刺激響應(yīng)囊泡，參見l)Y.Wang，H. Xu, X. Zhang. Adv.Mater. 2009, 21，2849 - 2864 ；2) X. Zhang, C. Wang. Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 94 - 101 ；3)C. Wang, Z. Wang, X. Zhang. Acc. Chem. Res. 2012, 45, 608-618。刺激響應(yīng)基團(tuán)可以通過非共價(jià)鍵相互作用的方式引入到囊泡體系中來，從而避免了共價(jià)鍵的合成。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)分析，提供一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡及制備方法和應(yīng)用，該超分子囊泡系基于磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白二元超分子組裝的胰蛋白酶調(diào)控的囊泡，魚精蛋白的存在可以誘導(dǎo)磺化杯[4]芳烴發(fā)生兩親聚集；該超分子囊泡是生物相容的且在室溫下具有很好的穩(wěn)定性，此外該超分子囊泡對(duì)胰蛋白酶具有良好的選擇響應(yīng)性；該超分子囊泡可以負(fù)載親水的廣譜抗癌藥物分子阿霉素，負(fù)載后的阿霉素可以高選擇性的釋放于胰蛋白酶的靶向位點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案
一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡，其構(gòu)筑單元以磺化杯[4]芳烴(SC4A)為主體，以魚精蛋白(Protamine)為客體，通過主-客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子組裝體。
—種所述胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的制備方法，將磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白溶解于水中，均勻混合后得到超分子囊泡溶液目標(biāo)物，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚。
所述超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白的濃度分別為O. 02mmol/L和 50 μ g/mL0
所述胰蛋白酶在超分子囊泡溶液中的濃度為O. 2mg/mL。
一種所述胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的應(yīng)用，將親水的廣譜抗癌藥物分子阿霉素負(fù)載到超分子囊泡的空腔內(nèi)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是基于磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白二元超分子組裝構(gòu)筑的納米超分子囊泡，制備方法簡便，主、客體原料用量少；該納米超分子囊泡生物相容且具有很好的穩(wěn)定性；該納米超分子囊泡對(duì)胰蛋白酶具有良好的選擇響應(yīng)性；該超分子囊泡可以負(fù)載親水的廣譜抗癌藥物分子阿霉素，負(fù)載后的阿霉素可以高選擇性的釋放于胰蛋白酶的靶向位點(diǎn)，其在靶向藥物傳遞治療胰腺癌領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖I為通過主-客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子組裝體示意圖。
圖2為魚精蛋白存在下磺化杯[4]芳烴的臨界聚集濃度圖。
圖3為磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡的動(dòng)態(tài)光散射圖。
圖4為磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡的高分辨透射電子顯微鏡圖像。
圖5為構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系450nm波長處透光率隨時(shí)間變化的曲線圖。
圖6為磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和NIT-I細(xì)胞 (小鼠胰島β細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的和空白對(duì)照組對(duì)比的活細(xì)胞數(shù)量圖。
圖7為磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和NIT-I細(xì)胞 (小鼠胰島β細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的和空白對(duì)照組對(duì)比的活細(xì)胞形態(tài)圖。
圖8為往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系中加入胰蛋白酶五小時(shí)后導(dǎo)致體系透光率的變化圖。
圖9為往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系中加入胰蛋白酶五小時(shí)后的高分辨透射電子顯微鏡圖像。
圖10為往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系中加入O. 5U/ mL堿性磷酸酯酶導(dǎo)致體系450nm波長處透光率隨時(shí)間變化的曲線圖。
圖11為往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系中加入O. 5U/ mL核酸外切酶I導(dǎo)致體系450nm波長處透光率隨時(shí)間變化的曲線圖。
圖12為往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系中加入O. 5U/ mL葡萄糖氧化酶導(dǎo)致體系450nm波長處透光率隨時(shí)間變化的曲線圖。
圖13為阿霉素以及負(fù)載阿霉素的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和ifepG-2細(xì)胞(人的肝癌細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的和空白對(duì)照組對(duì)比的活細(xì)胞數(shù)量圖。
圖14為阿霉素以及負(fù)載阿霉素的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和ifepG-2細(xì)胞(人的肝癌細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的和空白對(duì)照組對(duì)比的活細(xì)胞形態(tài)圖。
圖15為阿霉素以及負(fù)載阿霉素的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和PANC-1細(xì)胞(人的胰腺癌細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的和空白對(duì)照組對(duì)比的活細(xì)胞數(shù)量圖。
圖16為阿霉素以及負(fù)載阿霉素的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和PANC-1細(xì)胞(人的胰腺癌細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的和空白對(duì)照組對(duì)比的活細(xì)胞形態(tài)圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的制備方法，將磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白溶解于水中并均勻混合即可制得超分子囊泡溶液目標(biāo)物，所述磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白的濃度分別為O. 02mmol/L和50 μ g/mL，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚，所述胰蛋白酶在超分子囊泡溶液中的濃度為O. 2mg/mL。圖I為通過主-客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子組裝體示意圖。
在沒有魚精蛋白存在下橫化杯[4]芳經(jīng)在水溶液中不能自聚集，參見M. Rehm, M. Frank, J. Schatz. Tetrahedron Lett. 2009, 50, 93-96 ;如圖 2 所不，魚精蛋白的存在可以誘導(dǎo)磺化杯[4]芳烴在水溶液中進(jìn)行兩親聚集，固定魚精蛋白的濃度為50yg/mL時(shí),磺化杯[4]芳烴的臨界聚集濃度為.O. 012mmol/Lo
1)該超分子囊泡的粒徑和形貌
分別通過動(dòng)態(tài)光散射和高分辨透射電子顯微鏡所表征，圖3為磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡的動(dòng)態(tài)光散射圖；圖4為磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡的高分辨透射電子顯微鏡圖像。圖5為構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系450nm波長處透光率隨時(shí)間變化的曲線圖，圖中顯示該超分子囊泡在450nm波長處的透光率隨時(shí)間不發(fā)生變化，表明該超分子囊泡具有很好的穩(wěn)定性。
如圖6所示，磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和NIT-1細(xì)胞(小鼠胰島β細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的活細(xì)胞數(shù)量和空白對(duì)照組對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖7所示，磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和NIT-I細(xì)胞(小鼠胰島β細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄的活細(xì)胞形態(tài)和空白對(duì)照組對(duì)比也無明顯變化。圖6和圖7表明該超分子囊泡是生物相容的。2)該超分子囊泡的胰蛋白酶高選擇響應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證圖8為往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白組裝的超分子囊泡體系中加入胰蛋白酶五小時(shí)后導(dǎo)致體系透光率的變化圖，圖中表明在超分子囊泡溶液中加入胰蛋白酶五小時(shí)后，導(dǎo)致其在450nm波長處透光率升高到大約95%，證明了加入胰蛋白酶(O. 2mg/mL)五小時(shí)即可使囊泡幾乎完全解聚；往構(gòu)筑的磺化杯[4]芳烴和胰蛋白酶組裝的超分子囊泡體系中加入胰蛋白酶五小時(shí)后體系光散射強(qiáng)度會(huì)劇烈下降，同樣證實(shí)了囊泡的解聚。體系加入胰蛋白酶五小時(shí)后的高分辨透射電子顯微鏡圖像，如圖9所示，也證實(shí)了囊泡的完全解聚。對(duì)比試驗(yàn)在超分子囊泡溶液中加入堿性磷酸酯酶、核酸外切酶I以及葡萄糖氧化酶，體系在450nm波長處的透光率隨時(shí)間不發(fā)生變化，如圖10、圖11、圖12所示，表明加 入其它類型的酶不能像加入胰蛋白酶一樣可以使囊泡解聚。—種上述制備的胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的應(yīng)用，將親水的廣譜抗癌藥物分子阿霉素負(fù)載到超分子囊泡的空腔內(nèi)，方法如下I)將阿霉素、磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白溶解于水中后混合均勻得到溶液，將該溶液離心和透析后即可制得阿霉素負(fù)載的超分子囊泡，所述阿霉素、磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白的濃度分別為O. 002mmol/L, O. 02mmol/L和50 μ g/mL。2)將阿霉素以及負(fù)載阿霉素的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和IfepG-2細(xì)胞(人的肝癌細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄各組活細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)并和空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，如圖13、圖14所示，圖中表明，被超分子囊泡負(fù)載的阿霉素由于囊泡的保護(hù)作用對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用較之單純的阿霉素有所下降。將阿霉素以及負(fù)載阿霉素的磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白超分子組裝的胰蛋白酶響應(yīng)囊泡和PANC-I細(xì)胞(人的胰腺癌細(xì)胞)進(jìn)行孵化二十四小時(shí)后記錄各組活細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)并和空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，如圖15、圖16所示，圖中表明，被超分子囊泡負(fù)載的阿霉素對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用較之單純的阿霉素并沒有改變，這是由于在胰腺癌細(xì)胞溶液中的胰蛋白酶將會(huì)使該超分子囊泡幾乎完全解聚從而將負(fù)載的阿霉素靶向性的完全釋放出去。
權(quán)利要求
1.一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡，其特征在于構(gòu)筑單元以磺化杯[4]芳烴(SC4A)為主體，以魚精蛋白(Protamine)為客體,通過主-客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子組裝體。
2.一種如權(quán)利要求I所述胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的制備方法，其特征在于將磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白溶解于水中，均勻混合后得到超分子囊泡溶液目標(biāo)物，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的制備方法，其特征在于超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白的濃度分別為O. 02mmol/L和50 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的制備方法，其特征在于所述胰蛋白酶在超分子囊泡溶液中的濃度為O. 2mg/mL。
5.一種如權(quán)利要求I所述胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡的應(yīng)用，其特征在于將親水的廣譜抗癌藥物分子阿霉素負(fù)載到超分子囊泡的空腔內(nèi)。
全文摘要
一種胰蛋白酶調(diào)控的納米超分子囊泡，其構(gòu)筑單元以磺化杯[4]芳烴為主體，以魚精蛋白為客體，通過主-客體包結(jié)配位相互作用構(gòu)筑超分子組裝體，其制備方法是將磺化杯[4]芳烴和魚精蛋白溶解于水中，均勻混合后得到超分子囊泡溶液目標(biāo)物，然后加入胰蛋白酶即可使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡完全解聚。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該納米超分子囊泡的制備方法簡便，主、客體原料用量少；該納米超分子囊泡生物相容且具有很好的穩(wěn)定性，對(duì)胰蛋白酶具有良好的選擇響應(yīng)性；該超分子囊泡可以負(fù)載親水的廣譜抗癌藥物分子阿霉素，負(fù)載后的阿霉素可以高選擇性的釋放于胰蛋白酶的靶向位點(diǎn)，其在靶向藥物傳遞治療胰腺癌領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/42GK102973945SQ201210538680
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者劉育, 王魁, 郭東升, 趙夢堯 申請人:南開大學(xué)