使用小分子從多能干細(xì)胞產(chǎn)生胰內(nèi)胚層的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從多能干（PS)細(xì)胞例如人定形內(nèi)胚層產(chǎn)生胰內(nèi)胚層的方法。
[0002] 發(fā)明背景 0細(xì)胞移植潛在地提供了I型糖尿病的最終治療。然而，供體0細(xì)胞有限的可用性制 約了該治療作為臨床治療的用途。多能干細(xì)胞可無(wú)限增殖和分化為多種細(xì)胞類型；因此，PS 細(xì)胞為有希望的0細(xì)胞來(lái)源。然而，在PS細(xì)胞可用于治療糖尿病前，其需要有效和可再生 地分化為胰細(xì)胞。
[0003] 在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育期間，多能細(xì)胞產(chǎn)生三個(gè)胚層：外胚層、中胚層和內(nèi)胚層。對(duì) 于形成內(nèi)胚層衍生組織，定形內(nèi)胚層（DE)的誘導(dǎo)是第一步；從DE細(xì)胞產(chǎn)生胰內(nèi)胚層（PE) 為產(chǎn)生產(chǎn)胰島素的0細(xì)胞所必需的。具有成為內(nèi)分泌祖細(xì)胞（EP)潛能的PE細(xì)胞特征在 于兩個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子H)X1和NKX6. 1的共表達(dá)。
[0004] 對(duì)于從PS細(xì)胞產(chǎn)生胰細(xì)胞已經(jīng)建立了分步體外分化方案。這些方案一般模擬胰 發(fā)育的主要事件，其包括幾個(gè)階段例如共表達(dá)SOX17和FOXA2的DE、原腸、后前腸、PE、EP 和最后成熟0細(xì)胞的形成。迄今為止，hES細(xì)胞的有效DE分化已通過(guò)激活蛋白A處理實(shí) 現(xiàn)。產(chǎn)生胰0細(xì)胞的下一個(gè)主要步驟為產(chǎn)生共表達(dá)H)X1和NKX6. 1的PE。已開(kāi)發(fā)出幾組 可將PS細(xì)胞分化為DE和PE的體外方案，然而其僅能產(chǎn)生中等分?jǐn)?shù)的NKX6. 1/H)X1雙陽(yáng)性 (db+ve)細(xì)胞，而且重要的是其中無(wú)一能夠體外產(chǎn)生完全成熟的0細(xì)胞（Cai等（2010); D'Amour等（2006);Kunisada等（2012);Schulz等（2012);Zhang等（2009);Ameri等 (2010))〇
[0005] 概述 本發(fā)明涉及產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共表達(dá)roxi和NKX6.1，包括將定形內(nèi)胚層（DE)細(xì)胞暴露于有效量的由以下組成的組中的至少一種化合 物： a.BMP抑制劑LDN-193189 (在表1中列出） b?激酶抑制劑（在表1和表2中列出） c.視黃酸受體激動(dòng)劑（在表2中列出）， 以使人DE細(xì)胞分化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共 表達(dá)roxi和NKX6. 1，包括將DE細(xì)胞暴露于有效量的由以下組成的組中的至少一種化合 物： a. BMP抑制劑LDN-193189 (在表1中列出） b. 具有或不具有N-烷基化的1，9-吡唑并蒽酮的異構(gòu)體（在表1和2中列出） c. 視黃酸受體激動(dòng)劑（在表2中列出）， 以使人DE細(xì)胞分化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體（pancreaticorpancreaticcell precursors)〇
[0007] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共 表達(dá)roxi和NKX6. 1，包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效量的由以下組成的組中的至少一 種化合物： a. BMP抑制劑LDN-193189 b. JNK抑制劑II c.AM580， 以使人DE細(xì)胞分化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共 表達(dá)H)X1和NKX6. 1，包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189,以使 人DE細(xì)胞分化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共 表達(dá)H)X1和NKX6. 1，包括將DE細(xì)胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189,并隨后暴露 于下列分子之一， a. Wnt抑制劑IWP2 b. Hedgehog抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine,Cyc) 以使人DE細(xì)胞分化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共 表達(dá)roxi和NKX6. 1，包括將DE細(xì)胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189,并隨后暴露 于JNK抑制劑II、視黃酸或視黃酸衍生物、bFGF和下列分子之一的組合： a. Wnt抑制劑IWP2 b.Hedgehog抑制劑環(huán)巴胺 以使人DE細(xì)胞分化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于產(chǎn)生胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的方法，其中至少5%的細(xì)胞共 表達(dá)roxi和NKX6. 1，包括將DE細(xì)胞暴露于有效量的BMP抑制劑LDN-193189,并隨后暴露 于JNK抑制劑II與視黃酸或視黃酸衍生物、bFGF和LDN-193189的組合，以使DE干細(xì)胞分 化為胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，視黃酸受體激動(dòng)劑或激酶抑制劑的任一個(gè)可與bFGF 組合。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0014] 本發(fā)明涉及通過(guò)將人多能干細(xì)胞暴露于至少一種表1和2所列化合物而產(chǎn)生的胰 細(xì)胞或胰細(xì)胞前體。
[0015] 本發(fā)明涉及表1和2的任何一種化合物從干細(xì)胞誘導(dǎo)胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的用 途。
[0016] 本發(fā)明涉及LDN-193189從干細(xì)胞誘導(dǎo)胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的用途。
[0017] 本發(fā)明涉及LDN-193189隨后環(huán)巴胺或IWP2從干細(xì)胞誘導(dǎo)胰細(xì)胞或胰細(xì)胞前體的 用途。
[0018] 本發(fā)明采用一種替代方法以改進(jìn)人PS細(xì)胞向成熟0細(xì)胞分化的效率，即通過(guò)提 供增加NKX6. 1/H)X1雙陽(yáng)性細(xì)胞（PE細(xì)胞定型為內(nèi)分泌細(xì)胞命運(yùn)的標(biāo)志）分?jǐn)?shù)的方法。
[0019] 在一方面，本發(fā)明提供改進(jìn)的胰細(xì)胞群，即NKX6. 1/H)X1雙陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)增加的 PE〇
[0020] 此外，本發(fā)明提供更均質(zhì)的胰細(xì)胞群，這對(duì)于這些細(xì)胞向內(nèi)分泌譜系進(jìn)一步發(fā)育 是重要的。
[0021] 本發(fā)明還提供更同步的胰群，以到達(dá)下一階段。
[0022] 本發(fā)明還可解決將從示例性實(shí)施方案的公開(kāi)內(nèi)容中顯而易見(jiàn)的其它問(wèn)題。
[0023] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示使用小分子文庫(kù)的PE篩選方法一也稱為文庫(kù)篩選方法。多能干（PS)細(xì)胞根 據(jù)DE方案（見(jiàn)通用方法）分化為定形內(nèi)胚層（DE)并接種在96孔板中用于篩選。胰內(nèi)胚 層（PE)篩選分為前期和后期。在前期在已發(fā)表的基于bFGF的方案（Ameri等，2010，亦 參照W0/2010/136583)中添加化合物進(jìn)行第一個(gè)7天的PE分化，然后無(wú)化合物繼續(xù)另一個(gè) 6天。在后期在基于bFGF的方案中，僅在最后6天添加化合物。
[0024] 圖2顯示文庫(kù)篩選方法的前期命中（hit)。將來(lái)自人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（hiPSC) (黑色）或hESC(白色）的定形內(nèi)胚層細(xì)胞接種在96孔光學(xué)板中并使用14天的基于bFGF 的方案分化為胰內(nèi)胚層。在基于bFGF的方案中，添加化合物持續(xù)14天中的第一個(gè)7天并 使用InCell分析儀2000(GEHealthcare)分析NKX6. 1/H)X1雙陽(yáng)性細(xì)胞。該圖顯示與基 準(zhǔn)方案相比NKX6.i/roxi雙陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù)的％效果。
[0025] 圖3顯示文庫(kù)篩選方法的后期命中。將來(lái)自hiPSC(黑色）或hESC(白色）的定 形內(nèi)胚層細(xì)胞接種在96孔光學(xué)板中并使用14天的基于bFGF的方案分化為胰內(nèi)胚層。在基 于bFGF的方案中，添加化合物持續(xù)最后的6天并使用InCell分析儀2000(GEHealthcare) 分析nkx6. i/roxi雙陽(yáng)性細(xì)胞。該圖顯示與基準(zhǔn)方案相比nkx6. i/roxi雙陽(yáng)性細(xì)胞分?jǐn)?shù) 的％效果。
[0026] 圖4顯示第二種基于候選物的PE篩選方法。多能干（PS)細(xì)胞根據(jù)DE方案（見(jiàn)通 用方法）分化為定形內(nèi)胚層并接種在96孔板中用于篩選。胰內(nèi)胚層篩選分為兩部分。在篩 選1中，在PE分化的第一個(gè)8天將化合物加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基（RPMI1640+0. 1%PEST+12%K0SR)。 在具有2天增量的4個(gè)不同的時(shí)間窗口中檢測(cè)化合物，然后在基于bFGF的已發(fā)表方案 (Ameri等，2010)中將細(xì)胞繼續(xù)分化另一個(gè)6天。在篩選2中，細(xì)胞首先用篩選1的命中 化合物分化4天，然后最后的10天將篩選化合物加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
[0027] 圖5顯示與根據(jù)Ameri等，2010 (其用作基準(zhǔn)方案，與各篩選平行運(yùn)行）分化的 細(xì)胞相比，候選物篩選1和2的命中。在篩選1中，鑒定了一種命中化合物（LDN-193189) 并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)谝粋€(gè)4天將其加入接著4天基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)其最有效。對(duì)于篩選2,當(dāng)細(xì)胞首先 在篩選1的命中化合物中暴露4天然后在分化的最后10天加入篩選2的命中化合物時(shí)鑒 定了兩種命中化合物（環(huán)巴胺和IWP-2)。該圖顯示與基準(zhǔn)方案相比NKX6. 1/H)X1雙陽(yáng)性細(xì) 胞分?jǐn)?shù)的％效果（hiPSC的條為黑色，hESC的條為白色）。
[0028] 圖6顯示與基準(zhǔn)方案（Ameri等（2010))相比，兩種單獨(dú)的篩選（小分子文庫(kù)和候 選物方法）中存在的命中化合物組合對(duì)TOX1/NKX6.1雙陽(yáng)性細(xì)胞的量的有利作用。hiPSC 的條為黑色，hESC的條為白色。
[0029]縮略詞表 +ve:陽(yáng)性 bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)(也稱作FGF2) Cyc:環(huán)巴胺 db:雙陽(yáng)性 DE:定形內(nèi)胚層 hBS:人胚泡衍生的干 hBSC:人胚泡衍生的干細(xì)胞 hES:人胚胎干 hESC:人胚胎干細(xì)胞 hiPSC:人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 hPSC:人多能干細(xì)胞 KOSR:敲除血清替代物 NKX6. 1 :NK6同源異型框1 PDX1:胰和十二指腸同源異型框1 PEST:青霉素鏈霉素 PS:多能干 Rockout;Rho激酶抑制劑III RT:室溫 發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及從干細(xì)胞，例如人定形內(nèi)胚層細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞產(chǎn)生胰內(nèi)胚層的方 法。
[0030] 本發(fā)明采用一種替代方法以改進(jìn)人PS細(xì)胞向成熟e細(xì)胞分化的效率，即通過(guò)提 供提高NKX6.l/roxi雙陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（達(dá)到內(nèi)分泌細(xì)胞群所需的細(xì)胞階段之一，PE細(xì)胞 群的標(biāo)志）的方法。
[0031] 此外，本發(fā)明提供更均質(zhì)和同步的胰細(xì)胞群，這對(duì)于這