專利名稱：miR-200a抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法。
背景技術：
現(xiàn)有的科學研究中，經(jīng)常需要進行抑制胰腺癌干細胞干性特征，但現(xiàn)有的方法在操作方便性、成本、效果等方面存在不理想之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作方便，效果好的miR_200a抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法。本發(fā)明的技術解決方案是:一種miR-200a抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法，其特征是:包括下列步驟:A)人胰腺癌細胞系PANC-1培養(yǎng)以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)人胰腺癌細胞系PANC-1，每2-3天傳代一次，每傳代一次用0.25%胰蛋白酶消化；B)流式細胞儀檢測和分選胰腺癌干細胞( I)將PANC-1癌細胞消化成單細胞懸液細胞生長達對數(shù)生長期后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗I遍，加入0.25%胰蛋白酶，37°C消化5min ;待細胞變圓，加入含血清的完全培養(yǎng)基(即含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，吸管吹打數(shù)次；移入無菌離心管，IOOOr / min離心5min，PBS液重懸細胞，血球計數(shù)板計數(shù)；(2)抗體孵育每IXlO6個細胞分別加入20 μ I PE標記的抗人CD24 (anti_CD24phycoerythrin)> APC 標記的抗人 CD44 (ant1-CD44al1phycocyanin)和 FITC 標記的抗人ESA (ant1-ESA-FITC)，稀釋度均為1:40，冰浴30min，PBS清洗2次；對照組不加抗體；應用流式細胞儀進行流式檢測及分選(步驟按流式細胞儀說明書操作)，分選得到CD24+CD44+ESA+ 細胞亞群；C)無血清懸浮培養(yǎng)PANC-1干細胞球細胞(1)干細胞球的培養(yǎng)將分選得到的CD24+CD44+ESA+細胞亞群用DMEM-F12培養(yǎng)基(含有B2750 X、N2100X，表皮生長因子(EGF) 1Ong / ml、成纖維生長因子(FGF) 20ng / ml、血小板衍生因子(PDGF)20ng/ml、青霉素100U / ml、鏈霉素IOOug / ml)重懸，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，當培養(yǎng)至第5-7天時，形成球狀；(2)干細胞球的傳代當干細胞球長至第10天左右，1000r/min離心5min,去上清,用0.25%胰蛋白酶消化3min，加入胰酶抑制劑中和后吹打成單細胞懸液，接種于DMEM-F12無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，為第二代PANC-1干細胞球，體外連續(xù)培養(yǎng)并傳代；
D)過表達 miR_200a(I)合成miR_200a的前體片段和陰性對照；(2)取對數(shù)生長期細胞進行細胞轉染，按照InvitrogenLipofectamine2000說明書分別轉染到胰腺癌干細胞中。本發(fā)明操作方便，效果好，成本低。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。圖1、圖2、圖3分別是流式細胞儀檢測胰腺癌細胞表面標記物⑶24、⑶44和ESA表達結果圖；圖4是胰腺癌細胞株PANC-1和流式細胞分選出的⑶24+⑶44+ESA+細胞亞群在培養(yǎng)基中的表型觀察圖。圖5是實時熒 光定量PCR儀檢測胰腺癌細胞PANC-1和⑶24+CD44+ESA+細胞亞群中miR-200a的表達量示意圖。圖6是⑶24+⑶44+ESA+細胞亞群中過表達miR_200a mimic后細胞表型變化圖(圖中A為未處理組，B為陰性對照組，C為miR-200a過表達組)。圖7、圖8分別是CD24+CD44+ESA+細胞亞群中過表達miR-200amimic后實時熒光定量PCR儀檢測miR-200a和胚胎干性基因0ct_4和Nanog基因的表達量示意圖。
具體實施例方式一種miR-200a抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法，包括下列步驟:A)人胰腺癌細胞系PANC-1培養(yǎng)以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，在37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)人胰腺癌細胞系PANC-1，每2-3天傳代一次，每傳代一次用0.25%胰蛋白酶消化；B)流式細胞儀檢測和分選胰腺癌干細胞(I)將PANC-1癌細胞消化成單細胞懸液細胞生長達對數(shù)生長期后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗I遍，加入0.25%胰蛋白酶，37°C消化5min ;待細胞變圓，加入含血清的完全培養(yǎng)基(即含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)，吸管吹打數(shù)次；移入無菌離心管，IOOOr / min離心5min，PBS液重懸細胞，血球計數(shù)板計數(shù)；(2)抗體孵育每IXlO6個細胞分別加入20 μ I PE標記的抗人CD24 (anti_CD24phycoerythrin)> APC 標記的抗人 CD44 (ant1-CD44al1phycocyanin)和 FITC 標記的抗人ESA (ant1-ESA-FITC)，稀釋度均為1:40，冰浴30min，PBS清洗2次；對照組不加抗體；應用流式細胞儀進行流式檢測及分選(步驟按流式細胞儀說明書操作)，分選得到CD24+CD44+ESA+ 細胞亞群；C)無血清懸浮培養(yǎng)PANC-1干細胞球細胞(I)干細胞球的培養(yǎng)將分選得到的CD24+CD44+ESA+細胞亞群用DMEM-F12培養(yǎng)基(含有B2750 X、N2100X，表皮生長因子(EGF) IOng / ml、成纖維生長因子(FGF) 20ng / ml、血小板衍生因子(PDGF)20ng/ml、青霉素IOOU / ml、鏈霉素IOOug / ml)重懸，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，當培養(yǎng)至第5-7天時，形成球狀；(2)干細胞球的傳代當干細胞球長至第10天左右，1000r/min離心5min,去上清,用0.25%胰蛋白酶消化3min，加入胰酶抑制劑中和后吹打成單細胞懸液，接種于DMEM-F12無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，為第二代PANC-1干細胞球，體外連續(xù)培養(yǎng)并傳代；D)過表達 miR_200a(I)合成miR_200a的前體片段和陰性對照；(2)取對數(shù)生長期細胞進行細胞轉染，按照InvitrogenLipofectamine2000說明書分別轉染到胰腺癌干細胞中。E)實時熒光定量PCR檢測miR_200a和胚胎干性基因0ct_4和Nanog的表達(I)收集未轉染的細胞和轉染48h后的胰腺癌干細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，將其反轉錄成cDNA，cDNA合成過程中分別采用miR_200a的RT特異性引物和OligodT隨機引物。(2)以cDNA為模板，利用miR_200a、Oct-4和Nanog特異性引物和染料分子Sybergreen進行PCR擴增，分別以U6RNA和GAPDH作為內(nèi)參。(3)熒光定量 PCR (7500)的反應體系為 20 μ 1，其中 miR_200a、0ct_4、Nanog、U6RNA和GAPDH的上下游引物各 0.5 μ 1，I μ I cDNA模板，10 μ I Sybergreen，雙蒸水補足到20 μ I。
(4) 95°C預變性10min，95°C變性10s，60°C退火30s，擴增35個循環(huán)，操作步驟及加樣劑量嚴格按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行。(5)每組重復實驗3次。(6)結果用 7500System Software V2.0 分析。表1:PANC-1 細胞中 CD24、CD44 和 ESA 的表達
CD24+CD44+CD24+CD44+ESA+雙陽相對比例(％) P值雙陽相對比例(％) P值
7.4 土 0.5_0.04 _9±0.3_003其余分析結果見附圖。
權利要求
1.一種miR-200a抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法，其特征是:包括下列步驟: A)人胰腺癌細胞系PANC-1培養(yǎng) 以含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液為培養(yǎng)基，在37 °C>5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)人胰腺癌細胞系PANC-1，每2-3天傳代一次，每傳代一次用0.25 %胰蛋白酶消化； B)流式細胞儀檢測和分選胰腺癌干細胞 (1)將PANC-1癌細胞消化成單細胞懸液 細胞生長達對數(shù)生長期后，吸去培養(yǎng)液，PBS洗I遍，加入0.25 %胰蛋白酶，37°C消化·5 min ;待細胞變圓，加入含血清的完全培養(yǎng)基，吸管吹打數(shù)次；移入無菌離心管，1000 r /min離心5 min, PBS液重懸細胞,血球計數(shù)板計數(shù)； (2)抗體孵育 每I X IO6個細胞分別加入20 μ I PE標記的抗人⑶24、APC標記的抗人⑶44和FITC標記的抗人ESA，稀釋度均為1:40，冰浴30 min, PBS清洗2次；對照組不加抗體；應用流式細胞儀進行流式檢測及分選，分選得到CD24+CD44+ESA+細胞亞群； C)無血清懸浮培養(yǎng)PANC-1干細胞球細胞 (1)干細胞球的培養(yǎng) 將分選得到的⑶24+⑶44+ESA+細胞亞群用DMEM-F12培養(yǎng)基重懸，在37°C、5% CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，當培養(yǎng)至第5-7天時，形成球狀； (2)干細胞球的傳代 當干細胞球長至第10天左右，1000 r/min離心5 min,去上清,用0.25 %胰蛋白酶消化3 min，加入胰酶抑制劑中和后吹打成單細胞懸液，接種于DMEM-F12無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，為第二代PANC-1干細胞球，體外連續(xù)培養(yǎng)并傳代； D)過表達miR-200a (1)合成miR-200a的前體片段和陰性對照； (2)取對數(shù)生長期細胞進行細胞轉染,按照InvitrogenLipofectamine 2000說明書分別轉染到胰腺癌干細胞中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種miR-200a抑制胰腺癌干細胞干性特征的方法，包括人胰腺癌細胞系PANC-l培養(yǎng)、流式細胞儀檢測和分選胰腺癌干細胞、無血清懸浮培養(yǎng)PANC-l干細胞球細胞、過表達miR-200a。本發(fā)明操作方便，效果好，成本低。
文檔編號C12N5/095GK103074301SQ20131002787
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月24日 優(yōu)先權日2013年1月24日
發(fā)明者陸玉華, 王志偉, 朱銘巖, 陸晶晶, 李曉紅, 朱慧, 范向軍, 朱沙俊, 王雷, 鞠少卿, 吳信華 申請人:南通大學附屬醫(yī)院