34)。生物活性文庫內的化 合物以1yM和0. 1yM檢測。其它文庫的化合物以10yM和1yM檢測。在第二種基 于候選物的篩選方法中，包含了靶向胰發(fā)育所涉及的主要信號傳導途徑的小分子。
[0117]NKX6. 1/PDX1 篩詵 文庫化合物在用于制備PE的基于bFGF的培養(yǎng)基配方（Ameri等2010) (RPMI1640Gibco#61870U2%K0SRGibco#10828,0. 1%PESTGibco#15140,64ng/mLbFGFPeprotech #100_18B)中進行篩選。
[0118] 文庫PE篩選方法分為前期和后期（圖1)。
[0119] 在前期，在PE培養(yǎng)基中檢測化合物，持續(xù)PE分化的第一個7天，然后使用無化合 物的PE培養(yǎng)基繼續(xù)分化另外6天。
[0120] 在后期，將DE細胞在PE培養(yǎng)基中分化，持續(xù)第一個7天。隨后的6天，在PE培養(yǎng) 基中檢測化合物。每個96孔板中包含12個陽性對照孔（PE培養(yǎng)基）和12個陰性對照孔 (無bFGF的PE培養(yǎng)基）。每天進行培養(yǎng)基更換。前期篩選中鑒定的命中在圖2中說明并 在表1中列出。后期篩選中鑒定的命中在圖3中說明并在表2中列出。
[0121] 候選物方法的化合物在未添加bFGF的基礎培養(yǎng)基（RPMI1640Gibco#61870、 12%K0SRGibco#10828、0. 1%PESTGibco#15140)中篩選。該候選物方法篩選分為兩部分 (圖4)。在第一部分，PE分化的第一個8天，化合物以2天增量的時間間隔進行檢測（暴 露于化合物中2天接著6天基礎培養(yǎng)基或暴露于化合物中4天接著4天基礎培養(yǎng)基或暴露 于化合物中6天隨后2天基礎培養(yǎng)基或暴露于化合物中8天）。
[0122] 這8天后將一個板固定并分析roxi和NKX6. 1表達。第二個板使用已發(fā)表的PE 方案（Ameri等（2010))進一步分化另外6天。
[0123] 在第二部分，DE細胞根據第一部分的命中化合物分化，接下來的6-10天在基礎培 養(yǎng)基中檢測化合物。
[0124] 基準方案（Ameri等（2010))用作對照。
[0125] 第一和第二部分實驗中均每天進行培養(yǎng)基更換。
[0126] 候選物篩選方法中鑒定的命中在圖5中說明，并且也包含在表1和2中。
[0127] 實施例2 -組合誘導NKX6. 1 /H)X1共表達的小分子命中 將候詵物篩詵方法的命中與f庫方法的命中組合 將DE細胞暴露于 50nMLDN-193189 中 4 天，接著AM580 (AHDiagnostics,BMLGF104 0025)、JNK抑制劑II(Calbiochem, 420119)、50nMLDN-193189 和 64ng/mlFGF2,或 AM580、JNK抑制劑II、50nMLDN-193189、64ng/mlFGF2 和IWP2,或AM580、JNK抑制劑II、 50nMLDN-193189、64ng/mlFGF2和環(huán)巴胺中8天（圖6)。每天進行培養(yǎng)基更換。
[0128] 實施例3 -在人誘導多能干細胞中誘導NKX6. 1/H)X1共表達的小分子的確認 命中化合物（表1和2)在用于制備PE的基于bFGF的培養(yǎng)基配方（Ameri等2010) (RPMI1640Gibco#61870、12%K0SRGibco#10828、0.1%PESTGibco#15140、64ng/mLbFGF Peprotech#100_18B)中進行篩選。
[0129] 篩選分為前期和后期（圖1)。在前期，在PE培養(yǎng)基中檢測化合物，持續(xù)PE分化的 第一個7天，然后使用無化合物的PE培養(yǎng)基繼續(xù)額外的6天。在后期，將DE細胞在PE培 養(yǎng)基中分化，持續(xù)第一個7天。隨后的6天，化合物在PE培養(yǎng)基中檢測。每個96孔板中包 含12個陽性對照孔（PE培養(yǎng)基）和12個陰性對照孔（無bFGF的PE培養(yǎng)基）。每天進行 培養(yǎng)基更換。
[0130] 超過200%效果的值歸類為命中（圖2和圖3)。
[0131] 表1顯示前期命中化合物 與PE培養(yǎng)基相比，提高NKX6. 1/H)X1雙陽性細胞分數超過200%的化合物。列出了文 庫、化合物在文庫內的位置、靶標、化學結構、命中濃度和TOX1/NKX6. 1雙陽性細胞的百分 數。
[0132] 表1前期命中
表2顯示后期命中化合物。與PE培養(yǎng)基相比，提高NKX6. 1/roXl雙陽性細胞分數超過200%的化合物。列出了文庫、化合物在文庫內的位置、靶標、化學結構、命中濃度和roxi/ NKX6. 1雙陽性細胞的百分數。
[0133]表2.后期命中
表2(續(xù)）后期命中
佟営不友明的呆些特祉已經在不又中說明和描還，但現在不領項晉通扠木人員將想到許多修飾、取代、變更和等價物。因此，應理解的是，所附權利要求書意在涵蓋落在本發(fā)明真 實精神內的所有這些修飾和變更。
[0134] 參考文獻 Ameri等（2010)StemCells, 28:45-56 CaiJ?等（2010).JMolCellBiol.，Feb;2(l):50-60 ChungY?等（2006).Nature,Jan12;439(7073):216-9 D，AmourK.A?等（2006).NatBiotechnol, 24: 1392-401 HeinsN?等（2004).StemCells, 22 (3):367-76 JiangJ?等（2007).StemCells, 25:1940-53 KroonE?等（2008).NatBiotechnol, 26:443-452 KlimanskayaI?等（2006).Nature,Nov23;444(7118):481_5 KunisadaY?等（2012).StemCellRes, 8(2):274-84 SchulzTC?寧（2012).PLoSOne, 7(5):e37004 TakahashiK?等（2007).Cell, 131:861-72 TakahashiK?和YamanakaS. (2006).Cell, 126(4):663-76 ThomsonJA?等（1998).Science,Nov6;282(5391):1145-7 Wernig,M?等（2007).Nature, 448:318-24 ZhangD?等（2009).CellResearch, 19:429 - 438
【主權項】
1. 產生表達至少5%PDX1/NKX6. 1雙陽性的胰細胞或胰細胞前體的方法，包括將定形 內胚層細胞暴露于有效量的下列各組化合物的至少一種： a. BMP抑制劑，和 b. 激酶抑制劑，和 c. 視黃酸受體激動劑， 以使定形內胚層細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。2. 權利要求1的方法，其中所述BMP抑制劑為LDN-193189。3. 權利要求1的方法，其中所述視黃酸受體激動劑為AM580。4. 權利要求1的方法，其中所述視黃酸受體激動劑為視黃酸衍生物。5. 權利要求1的方法，其中所述激酶抑制劑為具有或不具有N-烷基化的1，9-吡唑并 蒽酮的異構體。6. 權利要求1的方法，其中所述激酶抑制劑為JNK抑制劑II并且與AM580組合。7. 權利要求1的方法，其中所述激酶抑制劑和視黃酸受體激動劑與bFGF組合。8. 權利要求1的方法，其中所述激酶抑制劑和視黃酸受體激動劑與FGF7或FGFlO組 合。9. 權利要求1-3的方法，包括將定形內胚層細胞暴露于有效量的無bFGF的 LDN-193189的第一步驟，和在bFGF存在下暴露于JNK抑制劑II與AM580組合的第二步驟。10. 權利要求1-3的方法，包括將定形內胚層細胞暴露于有效量的LDN-193189,隨后 暴露于由以下組成的組中的至少一種化合物： wnt抑制劑，例如IWP2,和/或hedgehog抑制劑，例如環(huán)巴胺。11. 權利要求1-10中任一項的方法，其中所述胰細胞或胰細胞前體為至少5%、至少 10%、10-30%、10-40%、5-70%、10-80%或5-100%?0父1/^?6.1雙陽性。12. 胰細胞或胰細胞前體，其可通過體外使用權利要求1-11的方法獲得。13. 胰細胞或胰細胞前體，其通過將定形內胚層細胞體外暴露于靶向JNK1、2或3、或 Syc或Src或GSK-3或P38MAPK或P38激酶或Rho激酶或MEK或Chk2或VEGFRl、2或3或 I3DGFRb或KDR/Flk-1的激酶抑制劑而產生。14. 通過權利要求13的方法產生的胰細胞或胰細胞前體，其中激酶抑制劑為JNK抑制 劑II，且其中定形內胚層細胞還暴露于下列化合物的至少一種： LDN-193189， Wnt抑制劑，hedgehog抑制劑， 視黃酸受體激動劑。15. 權利要求13的胰細胞或胰細胞前體，其中將定形內胚層細胞暴露于JNK抑制劑II 與表2中所列視黃酸受體激動劑的組合。16. 表1或2的激酶抑制劑化合物從胰內胚層前體誘導胰細胞或胰細胞前體的用途。 17. JNK抑制劑II和LDN-193189組合從胰內胚層前體誘導胰細胞或胰細胞前體的用 途。 18. JNK抑制劑II與視黃酸受體激動劑組合從胰內胚層前體誘導胰細胞或胰細胞前
【專利摘要】產生表達至少5%PDX1/NKX6.1雙陽性的胰細胞或胰細胞前體的方法，包括將定形內胚層細胞暴露于有效量的一種或多種小分子，以使人定形內胚層細胞分化為胰細胞或胰細胞前體。本發(fā)明還涉及通過所述方法產生的胰內胚層細胞和所述胰內胚層細胞的用途。
【IPC分類】C12N5/074
【公開號】CN104903440
【申請?zhí)枴緾N201380045948
【發(fā)明人】J.埃克伯格, M.漢斯森, U.多恩, K.赫斯, N.富納
【申請人】諾和諾德股份有限公司, 寶生物工程歐洲股份公司
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2013年9月3日
【公告號】EP2893000A1, US20150247123, WO2014033322A1