專利名稱：一種誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是利用PDX-1基因在胰腺生長發(fā)育過程中的重要作用，構(gòu)建含該基因的病毒載體，用來感染干細胞；或構(gòu)建表達載體、純化PDX-1蛋白，添加于誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化，并將獲得的細胞植入糖尿病患者體內(nèi)用于糖尿病的治療。
背景技術(shù)：
近幾年，胰島細胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細胞來源不足、嚴重的免疫排斥反應(yīng)等困難卻極大的限制了這種療法的應(yīng)用。干細胞作為一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞，已經(jīng)逐漸成為人們尋找胰島細胞的新資源，如骨髓中的間充質(zhì)干細胞(MSCs)易于分離培養(yǎng)擴增，遺傳背景穩(wěn)定，體內(nèi)植入反應(yīng)較弱，在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細胞，是修復(fù)骨、軟骨等組織或細胞損傷的首選種子細胞，也是基因治療的理想靶細胞。
對干細胞進行適當(dāng)?shù)幕蛐揎棧怪蔀槟芊置谝葝u素的細胞，是治療I型糖尿病的策略之一，而引入PDX-1基因，即胰腺十二指腸同源框蛋白1，有可能獲得能分泌胰島素的細胞。PDX-1基因在胰腺生長發(fā)育過程中扮演了很重要的角色，它不但可以調(diào)控胰島素的表達，還可以調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運子(Glut-2)、葡萄糖激酶(GK)等基因的表達。
由于干細胞是相對靜止的一群細胞，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低，選用病毒載體則可獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。腺病毒載體不整合到染色體中，攜帶的外源基因表達水平高，表達時間短，是轉(zhuǎn)染PDX-1最合適的載體。因為PDX-1是一個調(diào)控基因，它可以啟動自身基因及下游基因的表達，瞬時表達就足以發(fā)揮功能。
利用PDX-1具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特點，構(gòu)建表達載體、純化PDX-1蛋白，添加于誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，可以克服基因治療的不安全因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細胞團以用于糖尿病細胞治療的方法。采用以下技術(shù)方案1)構(gòu)建含PDX-1基因的原核表達載體表達、純化PDX-1蛋白。
2)構(gòu)建含PDX-1基因的病毒載體，以腺病毒載體為例用電穿孔法使穿梭質(zhì)粒pAdtrack-CMV-PDX-1與病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染293細胞，包裝并擴增腺病毒。
3)誘導(dǎo)干細胞分化通過直接添加PDX-1蛋白，或轉(zhuǎn)染含PDX-1基因的病毒載體，可以誘導(dǎo)干細胞分化為胰島樣細胞。
4)將獲得的胰島樣細胞以一定數(shù)量植入糖尿病患者體內(nèi)，腹腔或經(jīng)肝門脈移植，可以發(fā)揮降血糖作用。
本發(fā)明的內(nèi)容未公開發(fā)表，本領(lǐng)域的技術(shù)人員如不花費創(chuàng)造性勞動根本不能根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)推斷得到本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法。
具體實施例方式
實施例1、PDX-1蛋白的表達、純化設(shè)計含有NdeI、XhoI位點的PDX-1基因上、下游引物，PCR擴增全長片段，電泳回收，連入pGEM-T easy載體(Promega公司產(chǎn)品)，測序正確后，NdeI、XhoI雙酶切目的片段及pET-24a(+)，回收、連接。IPTG誘導(dǎo)表達，并純化該蛋白。
實施例2、pAdv-PDX-1腺病毒載體的構(gòu)建攜帶PDX-1基因的質(zhì)粒由美國Hui HongXiang博士饋贈。PDX-1是通過smaI位點插入PBluscriptII KS載體中的。在smaI位點兩端選擇BamHI及XhoI酶切。BamHI、BglII是同尾酶，故選擇BglII及XhoI酶切腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv。將酶切產(chǎn)物電泳回收，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂卡那霉素抗性平板篩選，取1μl菌液進行PCR鑒定。提取PCR鑒定為陽性的菌液質(zhì)粒，行雙酶切鑒定。選擇BglII及XhoI位點進行酶切鑒定，切出了400bp的小片段及9.7kb的大片段。
選用PmeI酶切1μg穿梭質(zhì)粒pAdtrack-cmv-PDX-1，70％乙醇沉淀質(zhì)粒，加5μlH2O。線性化的穿梭質(zhì)粒與100ng超螺旋質(zhì)粒pAdEasy-1電穿孔共轉(zhuǎn)化至BJ5183感受態(tài)菌中，菌液涂卡那霉素抗性平板篩選。選擇20個小克隆，分別接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液，37℃搖菌過夜。提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒均大于40kb，經(jīng)0.7％瓊脂糖電泳可初步鑒定。根據(jù)電泳結(jié)果，選取質(zhì)粒作PacI限制性酶切鑒定。重組質(zhì)粒可被酶切出4.5kb的小片段及38.6kb的大片段。
取鑒定好的重組病毒質(zhì)粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000(Invitrogen公司產(chǎn)品)包裹線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，轉(zhuǎn)染12h后去掉轉(zhuǎn)染液，加含5％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7～10天，當(dāng)細胞出現(xiàn)CPE時，收集細胞，-70℃和37℃反復(fù)凍融三次，離心取上清。用病毒上清再次感染293細胞，收集上清。用TCID50法測定病毒滴度(參考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度為6.3×107PFU/mL。
實施例3、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和擴增無菌條件下，擠出肋骨中的骨髓，肋骨可以由非血液系統(tǒng)疾病胸外科手術(shù)后獲得；或由非血液系統(tǒng)疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓，約5ml。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibico公司產(chǎn)品)充分混合，1500r/min離心5min，棄上清，再加入5ml完全培養(yǎng)液混勻后輕輕疊加到密度為1.073的Percoll分離液上，1500r/min離心20min，取白細胞膜層以上的部分，加入完全培養(yǎng)液洗兩遍。按1×106/ml密度接種于完全培養(yǎng)基中，置37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后更換培養(yǎng)液，以后每4d換液一次。細胞達80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3傳代繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
實施例4、PDX-1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向胰島樣細胞分化直接添加PDX-1蛋白于培養(yǎng)液中；或選擇病毒感染MSCs合適的MOI(MOI＝150)，根據(jù)細胞數(shù)，計算所需病毒量感染MSCs，孵育2h后，補加含有10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1周，誘導(dǎo)分化。
實施例5、胰島樣細胞團的鑒定利用RT-PCR鑒定巢蛋白(nestin)，神經(jīng)生成素3(ngn3)，PDX-1，GK、Glu2、胰島素，胰高血糖素基因的表達。利用primer 3軟件設(shè)計基因引物，序列如下

結(jié)果表明轉(zhuǎn)染PDX-1基因的細胞(1周)弱表達nestin、ngn3、Glut2基因，高表達PDX-1，GK、胰島素，胰高血糖素基因。
利用免疫組化鑒定胰島素、胰高血糖素抗原的表達。結(jié)果顯示誘導(dǎo)的細胞表達胰島素、胰高血糖素、生長抑素蛋白。
利用放射免疫分析法檢測胰島素水平。挑取轉(zhuǎn)染PDX-1基因1周的細胞團，置24孔板中，分3孔，每孔約90～100個細胞團，直徑約150μm。各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB緩沖液，置37℃孵箱中孵育1h。棄掉舊緩沖液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB緩沖液依次孵育1h，收集上清。收集各孔的細胞團，加入酸乙醇溶液，4℃過夜，用細胞超聲破碎儀破細胞，上清保存于-20℃。用放射免疫分析法檢測各上清中的胰島素含量。用BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)測定法檢測細胞內(nèi)總蛋白含量。結(jié)果誘導(dǎo)的胰島樣細胞團在5.6mmol/L葡萄糖濃度下胞內(nèi)胰島素含量為(54.45±9.14)ng/mg蛋白；而在16.7mmol/L葡萄糖濃度下胞內(nèi)胰島素含量為(130.14±12.24)ng/mg蛋白。具有一定的糖反應(yīng)性。
實施例6、體內(nèi)移植實驗首先制作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，體重約180-200g。按70mg/kg劑量給每只大鼠腹腔注射鏈脲霉素。鏈脲霉素粉劑用0.1M檸檬酸緩沖液(pH＝4.5)配制成液體使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。當(dāng)大鼠血糖升高(≥16.7mmol/L)且穩(wěn)定一周，表明糖尿病模型已經(jīng)建成。無菌條件下，向糖尿病大鼠腎包囊下或肝門脈小分支注入1000個胰島樣細胞團。術(shù)后，定期觀測血糖情況。結(jié)果糖尿病大鼠在植入細胞后第二周時血糖平均下降5.6mmol/L。表明誘導(dǎo)的胰島樣細胞團具有降血糖作用。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應(yīng)用，其特征在于利用轉(zhuǎn)錄因子PDX-1誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化，獲得的胰島樣細胞可在糖尿病的治療中應(yīng)用。
2.按照權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方案，其特征在于向誘導(dǎo)培養(yǎng)液中直接添加PDX-1轉(zhuǎn)錄因子，或向干細胞中轉(zhuǎn)染PDX-1基因，可以誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化。
3.按照權(quán)利要求2所述的方案，其特征在于選擇構(gòu)建含有PDX-1基因的原核表達載體，表達并純化該蛋白，按100nmol/L～1μmol/L濃度直接添加到培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化。
4.按照權(quán)利要求2所述的方案，其特征在于選擇構(gòu)建含有PDX-1基因的病毒載體，包括腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，慢病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，通過這些載體介導(dǎo)PDX-1基因在干細胞中表達，誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化。
5.按照權(quán)利要求4所述的病毒載體，腺病毒載體是轉(zhuǎn)染PDX-1基因的首選病毒載體。
6.按照權(quán)利要求1所述的干細胞，其特征在于被用來誘導(dǎo)的干細胞可以包括胚胎干細胞，胰腺干細胞，肝干細胞，造血干細胞，間充質(zhì)干細胞，神經(jīng)干細胞等。
7.按照權(quán)利要求1所述的方案，其特征在于選用無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液，并向其中添加胰高血糖素樣肽-1，尼克酰胺等營養(yǎng)素或細胞因子，可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染PDX-1基因或轉(zhuǎn)導(dǎo)PDX-1蛋白的干細胞向胰島樣細胞分化。
8.按照權(quán)利要求7所述的方案，其特征在于添加的胰高血糖素樣肽-1≤20nmol/L，尼克酰胺≤20mmol/L。
9.按照權(quán)利要求1所述的方案，其特征在于獲得的胰島樣細胞團能表達胰島相關(guān)基因及蛋白，如葡萄糖轉(zhuǎn)運子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素等。
10.按照權(quán)利要求1所述的方案，其特征在于獲得的胰島樣細胞團通過肝門脈或腹腔等方式植入糖尿病患者體內(nèi)，可以發(fā)揮一定的降血糖功能。
全文摘要
發(fā)明名稱為一種誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細胞團并在糖尿病細胞治療中應(yīng)用的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案1)獲得PDX－1基因；2)將PDX－1基因插入原核表達載體中，表達、純化出PDX－1蛋白；或構(gòu)建含有PDX－1基因的病毒載體。3)分離、培養(yǎng)及擴增干細胞；4)向培養(yǎng)液中直接添加PDX－1蛋白，或利用病毒載體介導(dǎo)PDX－1基因在干細胞中表達，誘導(dǎo)干細胞分化為胰島樣細胞；5)經(jīng)肝門脈或腹腔移植，將獲得的胰島樣細胞植入糖尿病患者體內(nèi)發(fā)揮作用。本發(fā)明簡化了誘導(dǎo)干細胞向胰島樣細胞分化的方案，為糖尿病細胞治療提供了新的胰島細胞來源，為糖尿病患者實現(xiàn)自體干細胞治療自身疾病奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/12GK1637137SQ20041007064
公開日2005年7月13日 申請日期2004年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月6日
發(fā)明者裴雪濤, 李艷華, 張銳, 王韞芳, 閆舫 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所