專利名稱：胰腺干細(xì)胞及其在器官移植中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到干細(xì)胞及其分化領(lǐng)域，尤其是涉及到胰腺胰島β細(xì)胞及nestin陽性肝臟干細(xì)胞及其從干細(xì)胞及祖細(xì)胞的分化，以及胰腺干細(xì)胞，祖細(xì)胞，及已分化的β細(xì)胞或nestin陽性肝臟干細(xì)胞或祖細(xì)胞在器官移植中的用途。
背景技術(shù)：
本發(fā)明是在得到至少部分美國政府基金的資助下完成的，其得到國立衛(wèi)生研究所授予的DK30457及DK30834，因此，美國政府享有本發(fā)明的一定權(quán)利。
胰島細(xì)胞的起源，包括其在胚胎發(fā)育還是在成熟哺乳動(dòng)物細(xì)胞階段，盡管已作了許多研究，但依然不確定。一些導(dǎo)管上皮細(xì)胞能夠分化或者反分化以形成在成熟胰島中的β細(xì)胞及其他類型的細(xì)胞(Bouwens，1998)。
來自分離胰島的導(dǎo)管細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中增殖且如果移植進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，可以分化成功能性β細(xì)胞(Cornelius et al.，1997)。
已經(jīng)可以證明exendin-4，一個(gè)長期作用的GLP-1拮抗劑，當(dāng)給予鼠類時(shí)激發(fā)了來自導(dǎo)管祖細(xì)胞的(新生)的β細(xì)胞的分化及β細(xì)胞的增殖。在一個(gè)2型糖尿病鼠模型的部分胰切手術(shù)中胰切后10天每天給予exendin-4可以減緩糖尿病的發(fā)展。已經(jīng)可以證明exendin-4刺激了胰腺的再生及新生的β細(xì)胞群體的擴(kuò)展及β細(xì)胞的增殖(Xuet al.，1999，Diabetes，482270-2276)。
Ramiya等，已經(jīng)證明分離自成人前驅(qū)糖尿病非肥胖糖尿病(NOD)鼠的胰腺導(dǎo)管的多能性干細(xì)胞的體外產(chǎn)生的胰島分化形成葡萄糖響應(yīng)性胰島其可以在不管是以囊裝是否進(jìn)入糖尿病NOD鼠類(Ramiyaet al.，2000，Nature Med.，6278-282)移植后反轉(zhuǎn)胰島素依賴型糖尿病。
促胰島激素，腸生胰高血糖素相似性多肽(GLP)-1可以提高有助于胰腺發(fā)育的同源區(qū)轉(zhuǎn)錄因子IDX-1的胰腺表達(dá)及胰島素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。與此同時(shí)，GLP-1被給予糖尿病小鼠刺激胰島素的分泌且可以有效地降低其血糖水平。GLP-1同樣可以提高β細(xì)胞的再生及胰島的大小(Stoffers et al.，2000，Diabetes，49741-748)。
Ferber等，已經(jīng)證明了腺病毒介導(dǎo)的體外PDX-1(同樣也為IDX-1)轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入小鼠肝細(xì)胞結(jié)果使得肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞數(shù)量向β細(xì)胞顯型反轉(zhuǎn)。
其表明使用PDX-1腺病毒載體靜脈內(nèi)輸入小鼠后有超過60％的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成PDX-1。處理小鼠的血清及肝臟中免疫反應(yīng)性胰島素濃度大量增加。使用PDX-1處理的小鼠存活于鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病且可以調(diào)節(jié)血糖過高癥(Ferber et al.，2000，NatureMed.，6568-572)。
獲自分離胰島的導(dǎo)管細(xì)胞培養(yǎng)物明顯含有可以提高胰島素分泌的細(xì)胞量，其還不清楚是否這些細(xì)胞是真正的干細(xì)胞或僅僅是導(dǎo)管上皮細(xì)胞所經(jīng)歷的反分化狀態(tài)。即使這些物質(zhì)中含有真正的干細(xì)胞，尚不清楚哪一部分代表干細(xì)胞及可以被描述的細(xì)胞類型。因此需要從胰腺組織中分離出特定的細(xì)胞類型，使用分子標(biāo)記證明哪一部分是干細(xì)胞的細(xì)胞類型且證明其是多能性的且可以長期增殖。
在大腦中已發(fā)現(xiàn)能夠分化成為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)組織的多能性干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞特定表達(dá)nestin，一個(gè)中間絲狀體蛋白(Lendahlet al.，1990；Dahlstrand et al.，1992)。在第E11天Nestin表達(dá)于發(fā)育小鼠胚胎神經(jīng)管中，其在第E16天在大腦皮層達(dá)到表達(dá)量的最高水平，然后在成人大腦皮層降低，局限于室管膜細(xì)胞群體(Lendahl etal.，1990)。發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)及胰腺胰島細(xì)胞顯示出其與普通細(xì)胞特征相似的表型。
本發(fā)明涉及到胰腺胰島干細(xì)胞/祖細(xì)胞(IPCs)群體其與神經(jīng)元及肝臟干細(xì)胞相似且分化成胰島α-細(xì)胞(胰高血糖素)及β細(xì)胞(胰島素)。本發(fā)明同樣涉及nestin陽性肝臟細(xì)胞。按照本發(fā)明的IPCs是免疫不容性型還是免疫優(yōu)勢型通過其自身作為移植受體來證實(shí)。按照本發(fā)明的IPCs可以被用于同種異基因或經(jīng)過異源基因載體移植。
本領(lǐng)域需要通過同種異基因或經(jīng)過異源基因載體的方法移植干細(xì)胞。
本領(lǐng)域同樣需要治療I型糖尿病mellitus的方法其中胰島，nestin陽性胰腺干細(xì)胞或者nestin陽性肝臟干細(xì)胞通過同種異基因或異種基因的載體方法被轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體細(xì)胞且并未發(fā)生移植排斥反應(yīng)。
本領(lǐng)域同樣需要移植進(jìn)入一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法其中胰島，nestin陽性胰腺干細(xì)胞或者nestin陽性肝臟干細(xì)胞通過同種異基因或異種基因的載體方法被轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體細(xì)胞且并未發(fā)生移植排斥反立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)哺乳動(dòng)物胰腺或肝臟干細(xì)胞用于治療糖尿病mellims及其他病癥。提供鑒別，定位及分離胰腺干細(xì)胞的方法也是本發(fā)明的目的，同樣為本發(fā)明目的的還有提供一個(gè)分化胰腺干細(xì)胞以獲得可產(chǎn)生胰島素及其他激素的細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供可使用哺乳動(dòng)物胰腺或肝臟干細(xì)胞移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法。這些及其他的本發(fā)明的目的可通過下述一個(gè)或多個(gè)具體的技術(shù)方案來體現(xiàn)。
本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案是提供一個(gè)治療糖尿病mellitus的患者的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島。干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者其中其分化成為一個(gè)胰島素生產(chǎn)細(xì)胞，另一個(gè)技術(shù)方案提供了另一種治療糖尿病患者的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島然后擴(kuò)展至體外以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞。祖細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者其中其分化成為一個(gè)可產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。另一個(gè)技術(shù)方案依然提供了另一種治療糖尿病患者的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島然后擴(kuò)展至體外以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞。祖細(xì)胞在培養(yǎng)基中分化形成假胰島相似性聚合體其被轉(zhuǎn)移進(jìn)患者。
另一個(gè)技術(shù)方案提供了另一種治療具有糖尿病mellitus的患者的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島然后擴(kuò)展至體外以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞。祖細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者其中其分化成為一個(gè)可產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。
在這些方案中，患者同樣作為胰島組織的供體，提供細(xì)胞的同系移植物或已分化的組織。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，患者本身并不作為胰島組織的供體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，患者是人且供體是非人哺乳動(dòng)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在轉(zhuǎn)移步驟之前對(duì)患者并不使用免疫抑制劑進(jìn)行處理。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在轉(zhuǎn)移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理干細(xì)胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結(jié)合體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，治療具有糖尿病mellitus的患者的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理患者的步驟。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減緩了已經(jīng)發(fā)生的免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫反應(yīng)是免疫移植排斥反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑選自含有下列組分的組FK-506，cyclosporin，及GAD65抗體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，其提供了一個(gè)從胰島中分離干細(xì)胞的方法。從供體中分離出胰島，然后對(duì)其細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。從培養(yǎng)基中選出Nestin陽性干細(xì)胞克隆?？蛇x擇的是，通過在使用伴刀豆球蛋白A包裹的容器中的非胰島細(xì)胞中清洗出去可結(jié)合在非胰島細(xì)胞的胰島細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，分離干細(xì)胞的方法進(jìn)一步包括通過使用選自含有EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-P，及其結(jié)合體的組的試劑進(jìn)行處理擴(kuò)展nestin陽性克隆的步驟。
進(jìn)一步的技術(shù)方案提供了一種誘導(dǎo)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分化成為胰腺祖細(xì)胞的方法。正如這兒所使用到的，＂分化＂指的是這樣一個(gè)過程其中細(xì)胞經(jīng)歷一種變化至一個(gè)特定的細(xì)胞類型，例如一個(gè)專門的細(xì)胞類型。干細(xì)胞使用選自含有下列組分的組的試劑進(jìn)行處理EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-P，及其結(jié)合體，干細(xì)胞隨后分化為胰腺祖細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，胰腺祖細(xì)胞隨后形成假胰島類似性聚合體。
本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案提供了一種移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的胰島。干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)其中其分化成為胰島素生產(chǎn)細(xì)胞。
另一個(gè)技術(shù)方案提供了另一種移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島然后擴(kuò)展至體外以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞。祖細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物其中其分化成為一個(gè)可產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。另一個(gè)技術(shù)方案也提供了另一種移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島然后擴(kuò)展以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞。祖細(xì)胞在培養(yǎng)基中分化形成假胰島相似性聚合體其被轉(zhuǎn)移進(jìn)哺乳動(dòng)物。
另一個(gè)技術(shù)方案提供了另一種移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法。一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分離自一個(gè)供體的一個(gè)胰腺胰島然后擴(kuò)展至體外以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞。祖細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物其中其分化成為一個(gè)可產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。
在這些方案中，哺乳動(dòng)物同樣作為胰島組織的供體，提供細(xì)胞的同系移植物或已分化的組織。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，哺乳動(dòng)物本身并不作為胰島組織的供體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，哺乳動(dòng)物是人且供體是非人哺乳動(dòng)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在轉(zhuǎn)移步驟之前對(duì)哺乳動(dòng)物并不使用免疫抑制劑進(jìn)行處理。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在轉(zhuǎn)移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理干細(xì)胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結(jié)合體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物的步驟。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減緩了已經(jīng)發(fā)生的免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫反應(yīng)是免疫移植排斥反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑選自含有下列組分的組FK-506，cyclosporin，及GAD65抗體。
而另一個(gè)技術(shù)方案提供了一種分離的，nestin陽性人類胰腺干細(xì)胞， 在這個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞分化成為或者一個(gè)β細(xì)胞，一個(gè)α細(xì)胞，一個(gè)假胰島類似聚合體或者一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在該技術(shù)方案中，干細(xì)胞是優(yōu)先免疫的。在一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞并不表達(dá)I型MHC抗原，在一個(gè)技術(shù)方案中， 干細(xì)胞并不表達(dá)II型MHC抗原，在一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞并不表達(dá)I型或II型MHC抗原。
另一個(gè)技術(shù)方案也提供了一種鑒別胰腺細(xì)胞作為干細(xì)胞的方法。一個(gè)細(xì)胞使用一個(gè)標(biāo)記的nestin特異性抗體接觸，如果細(xì)胞也為該抗體標(biāo)記，那么細(xì)胞就被鑒別為干細(xì)胞?？蛇x擇的另外的步驟包括使用抗細(xì)胞角蛋白19及抗膠原質(zhì)IV的抗體接觸細(xì)胞；如果其并未被或者細(xì)胞角蛋白19或者膠原質(zhì)IV的抗體標(biāo)記的話其就被鑒別為干細(xì)胞。
另一個(gè)技術(shù)方案提供了一個(gè)誘導(dǎo)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法，nestin陽性胰腺干細(xì)胞使用有效量的可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或可以分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞的試劑進(jìn)行處理。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，該試劑是cyclopamine。
而另一個(gè)技術(shù)方案提供了一個(gè)治療具有肝臟疾病的患者的方法。一個(gè)分離自供體胰島的nestin陽性胰腺干細(xì)胞且轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者其中干細(xì)胞分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
在一個(gè)相關(guān)的技術(shù)方案中，干細(xì)胞體外擴(kuò)展至一個(gè)祖細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者然后進(jìn)一步分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
在另一個(gè)相關(guān)的技術(shù)方案中，干細(xì)胞體外分化成為一個(gè)祖細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者，然后進(jìn)一步分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)相關(guān)的技術(shù)方案中，干細(xì)胞體外分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其再被移植進(jìn)入患者。
在這些技術(shù)方案中，患者可以作為胰島組織的受體，以提供細(xì)胞的同系移植物或分化組織。
在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，患者并不作為胰島組織的供體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，患者是人且供體是非人哺乳動(dòng)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在轉(zhuǎn)移步驟之前對(duì)患者并不使用免疫抑制劑進(jìn)行處理。
另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，治療具有肝病的患者的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理患者的步驟。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減緩了已經(jīng)發(fā)生的免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫反應(yīng)是免疫移植排斥反應(yīng)。
然而另一個(gè)技術(shù)方案提供了一種移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法。一個(gè)分離自一個(gè)供體胰島的nestin陽性胰腺干細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中干細(xì)胞分化成為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)相關(guān)的技術(shù)方案中，干細(xì)胞被被體外擴(kuò)展成為祖細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并進(jìn)一步分化成為一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
在另一個(gè)相關(guān)的技術(shù)方案中，干細(xì)胞被體外分化成為祖細(xì)胞，其被轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞并進(jìn)一步分化成為一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在另一個(gè)相關(guān)的技術(shù)方案中，干細(xì)胞體外分化成為祖細(xì)胞，然后被轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在這些技術(shù)方案中，哺乳動(dòng)物可以作為胰島組織的供體，其提供一個(gè)細(xì)胞的同系移植物或分化組織。
在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，哺乳動(dòng)物并不作為胰島組織的供體。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，哺乳動(dòng)物是人而供體是非人哺乳動(dòng)物。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，在轉(zhuǎn)移步驟之前對(duì)哺乳動(dòng)物并不使用免疫抑制劑進(jìn)行處理。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法此外還包括使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物的步驟。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減緩了已經(jīng)發(fā)生的免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫抑制劑減弱了免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。
在另一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，免疫反應(yīng)是免疫移植排斥反應(yīng)。
然而另一個(gè)技術(shù)方案提供了一種分離的，nestin陽性人類肝臟干細(xì)胞，在這個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞是優(yōu)先免疫的。在一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞并不表達(dá)I型MHC抗原，在一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞并不表達(dá)II型MHC抗原，在一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞并不表達(dá)I型或II型MHC抗原。
然而另一個(gè)技術(shù)方案提供了一種分離的，nestin陽性人類干細(xì)胞其并非是神經(jīng)干細(xì)胞其可以移植進(jìn)入動(dòng)物而并不導(dǎo)致移植過程中寄主的排斥反應(yīng)。在該技術(shù)方案中，干細(xì)胞并非主要組織相容性復(fù)合體I型或II型限制的。
這兒所使用的“干細(xì)胞”意指未分化細(xì)胞其可以在體內(nèi)外無限制性地繁殖并能夠分化成為其他細(xì)胞類型。其可以是某種分化細(xì)胞，定向型細(xì)胞，不成熟細(xì)胞，祖細(xì)胞或成熟細(xì)胞類型，例如紅血球及淋巴細(xì)胞其來源于相同的祖細(xì)胞，甚至是組織發(fā)育各階段的細(xì)胞類型其完全不同于干細(xì)胞時(shí)的組織。例如，血液干細(xì)胞可以變?yōu)槟X細(xì)胞或肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞可以變?yōu)楦渭?xì)胞，如此干細(xì)胞是多功能性的，假如從周圍環(huán)境中獲得一定的信號(hào)，其可以分化成為機(jī)體的任何組織。
在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明所述的“干細(xì)胞”是免疫盲或免疫優(yōu)先的。正如這兒所使用的“免疫盲或免疫優(yōu)先”指的是細(xì)胞并不誘發(fā)免疫反應(yīng)。正如這兒所使用的，“免疫反應(yīng)”指的是由免疫系統(tǒng)針對(duì)外源物質(zhì)所發(fā)生的反應(yīng)。正如這兒所使用的，包括但并不限于移植排斥，抗體產(chǎn)生，感染及抗原特異性淋巴細(xì)胞針對(duì)抗原的反應(yīng)。按照本領(lǐng)域的已知技術(shù)如果移植物志被成功移植或排斥都可以檢測到免疫反應(yīng)，正如在移植排斥反應(yīng)分析的部分進(jìn)行定義那樣。在一個(gè)技術(shù)方案中，按照本發(fā)明一個(gè)＂免疫盲的干細(xì)胞＂或者一個(gè)＂免疫優(yōu)先的干細(xì)胞＂可以被同種異體移植或者異種移植而不發(fā)生移植排斥反應(yīng)在移植受體或寄主中可以被識(shí)別為自身。
如果寄主對(duì)移植物質(zhì)不是免疫不容性的或者并未使用免疫抑制藥劑以防排斥移植物質(zhì)可能要遭受到移植受體或者寄主的排斥。
正如這兒所使用的，按照本發(fā)明，一個(gè)寄主如果是免疫不容性的，正如這兒所定義的那樣，其不會(huì)馬上發(fā)生免疫反應(yīng)。在一個(gè)技術(shù)方案中，免疫不容性寄主并不排斥或破壞移植物質(zhì)。在一個(gè)技術(shù)方案中，免疫不容性性寄主對(duì)抗原并不發(fā)生通過產(chǎn)生抗體結(jié)合在抗原上的反應(yīng)。
正如這兒所使用的，＂排斥＂指的是由寄主免疫系統(tǒng)排斥抑制物質(zhì)。在一個(gè)技術(shù)方案中，＂排斥意指針對(duì)寄主免疫反應(yīng)的結(jié)果移植物有超過90％的細(xì)胞或組織壞死現(xiàn)象發(fā)生＂。在另一個(gè)技術(shù)方案中，＂排斥＂意指生存能力的降低而且移植物針對(duì)寄主免疫反應(yīng)的結(jié)果其生存能力與移植前相比降低90％甚至更多。生存能力的降低可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)來確定其包括但并不限于trypan藍(lán)色排斥染色。在另一個(gè)技術(shù)方案中，＂排斥＂意指移植物不能增殖。增殖可以通過本領(lǐng)域的已知技術(shù)其包括但并不限于蘇木精/曙紅染色來測量。移植排斥的發(fā)生和/或移植后排斥發(fā)生的速度將依賴于各種因素，其包括但并不限于移植物質(zhì)(也就是說，細(xì)胞類型，細(xì)胞數(shù)量)或寄主(也就是說，不管寄主是否免疫不容性的和/或已經(jīng)使用免疫抑制劑處理過)。正如這兒所使用到的，＂移植物對(duì)寄主的排斥＂或＂移植物對(duì)寄主的反應(yīng)＂指的是移植物與寄主抗原發(fā)生的T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。
正如這兒所使用到的，＂寄主對(duì)移植排斥＂或＂寄主對(duì)移植物反應(yīng)＂指的是寄主免疫系統(tǒng)抵抗外來移植物的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
在另一個(gè)技術(shù)方案中，特異性抗體的產(chǎn)生發(fā)生免疫反應(yīng)(例如特異性連接在移植物抗原上的抗體或特異性連接在外源物質(zhì)或外源物質(zhì)產(chǎn)品上的抗體)通過本領(lǐng)域已知的免疫方法檢測，包括但并不限于ELISA，免疫染色，免疫沉降反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡分析。
干細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)形態(tài)發(fā)生或生長因子受體，且可以感覺到，例如，受傷相關(guān)因子然后定位于組織受傷位點(diǎn)，或感受到其周圍的微環(huán)境及分化成為合適的細(xì)胞類型。
＂基本無限制性增殖＂可以被確定，例如，通過分離干細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中通過至少50，最好是100，甚至200或者更多的細(xì)胞分化進(jìn)行增殖的能力。干細(xì)胞可以是＂全能的，＂意指其可以成為所有的有機(jī)體細(xì)胞例如細(xì)菌細(xì)胞。干細(xì)胞也可以是＂多能性的，＂意指其可以成為不同類型的細(xì)胞但并不是所有的有機(jī)體細(xì)胞，當(dāng)一個(gè)干細(xì)胞分化時(shí)，其一般成為一個(gè)更加成熟的細(xì)胞類型，其可以成為部分分化的細(xì)胞例如祖細(xì)胞，一個(gè)分化的細(xì)胞或者一個(gè)終止分化的細(xì)胞。干細(xì)胞可以是高度活動(dòng)性的。
＂Nestin＂指的是中間纖維蛋白其序列已在Genbank上登記，號(hào)為X65964(圖7)。
一個(gè)＂胰腺＂干細(xì)胞指的是分離自胰腺組織的干細(xì)胞和/或具備下述特征的細(xì)胞nestin陽性染色，nestin基因表達(dá)，cytokeratin-19負(fù)染色，培養(yǎng)基中的長期增殖，及分化成為假胰島細(xì)胞的能力。
一個(gè)＂肝＂干細(xì)胞指的是分離自肝組織的干細(xì)胞和或nestin陽性染色特征的細(xì)胞，nestin基因表達(dá)，及其在培養(yǎng)物中的長期增殖。
一個(gè)＂祖細(xì)胞＂指的是一個(gè)通過分化獲自干細(xì)胞的細(xì)胞其能夠進(jìn)一步分化成為更加成熟的細(xì)胞類型。
正如這兒所使用的，詞組＂胰島素產(chǎn)生的β細(xì)胞＂指的是能夠產(chǎn)生分泌與人類胰臟胰島細(xì)胞β細(xì)胞分泌的相同數(shù)量的胰島素的所有細(xì)胞。
更加適宜的是，胰島素產(chǎn)生的β細(xì)胞胰島素的分泌同樣以人類β細(xì)胞原位胰島素的分泌調(diào)控相似的方式進(jìn)行調(diào)控；例如，胰島素的分泌同樣可為在胰島素產(chǎn)生的β細(xì)胞周圍葡萄糖濃度的提高而刺激。
＂假胰島相似性＂聚合體是一個(gè)胰島素分泌細(xì)胞的人工聚合體其在形態(tài)與功能上與胰島細(xì)胞相似。假胰島相似性聚合體在細(xì)胞培養(yǎng)條件下體外產(chǎn)生。其直徑大約為50-150μm(與胰島平均直徑100μm相比較)且形狀為球形體。
＂分離＂一個(gè)干細(xì)胞指的是從組織樣品中移出干細(xì)胞且與另外的非組織干細(xì)胞分開。一個(gè)分離的干細(xì)胞可以從其他類型的細(xì)胞中自由分出且具有增殖能力而分化成為組織中的成熟細(xì)胞。然而，當(dāng)處理干細(xì)胞的收集時(shí)，例如干細(xì)胞的培養(yǎng)，已經(jīng)得知其有部分可能性獲得100％純度的干細(xì)胞。因此，一個(gè)分離的干細(xì)胞可以存在于其他類型的細(xì)胞僅有一部分時(shí)且并不與干細(xì)胞的分析或生產(chǎn)其它分化種類的細(xì)胞類型使用相沖突時(shí)，分離的干細(xì)胞一般至少為30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％純度。最好是，按照本發(fā)明分離干細(xì)胞至少有98％或99％的純度。
一個(gè)干細(xì)胞是＂擴(kuò)展的＂當(dāng)其在培養(yǎng)物中增值時(shí)且通過細(xì)胞分化變?yōu)槠渌愋偷母杉?xì)胞和/或祖細(xì)胞。干細(xì)胞的擴(kuò)展可以在干細(xì)胞的增殖的同時(shí)進(jìn)行其也可能需要某種特定的生長環(huán)境，例如最小的細(xì)胞濃度，容器表面的細(xì)胞匯集度或者加入化學(xué)因子例如生長因子，分化因子或信號(hào)因子。
一個(gè)干細(xì)胞，祖細(xì)胞或分化細(xì)胞被移植或者引入一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)其從一個(gè)培養(yǎng)器中轉(zhuǎn)移至一個(gè)患者時(shí)。這兒所使用到的移植可以包括按照本發(fā)明所述的干細(xì)胞分離步驟及將干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者體內(nèi)。移植可能涉及到通過注射細(xì)胞懸液進(jìn)入哺乳動(dòng)物或者患者，外科手術(shù)將細(xì)胞移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者體內(nèi)的組織或器官，使用細(xì)胞懸浮灌注組織或器官等將干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者體內(nèi)。轉(zhuǎn)移干細(xì)胞或移植的路徑將通過細(xì)胞在特定組織或器官中的定位的需要及細(xì)胞為靶定組織或器官所發(fā)現(xiàn)或獲得的能力來確定。在一個(gè)案例中移植細(xì)胞定位于特定的位點(diǎn)，其可以被外科轉(zhuǎn)移進(jìn)入組織或器官或者簡單地注射進(jìn)入血流如果該細(xì)胞在靶定細(xì)胞中有移植的能力。
正如這兒所使用的，移植可以包括按照本發(fā)明分離干細(xì)胞，培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或者患者體內(nèi)去的步驟。正如這兒所使用的，移植可以包括按照本發(fā)明分離干細(xì)胞，分化干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或者患者體內(nèi)去的步驟。正如這兒所使用的，移植可以包括按照本發(fā)明分離干細(xì)胞，分化和擴(kuò)展干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或者患者體內(nèi)去的步驟。
這兒所使用到的一個(gè)＂移植物質(zhì)＂按照本發(fā)明指的是至少105干細(xì)胞甚至到108或109個(gè)干細(xì)胞。
通過給予患者人以試劑其可以預(yù)防延緩如移植細(xì)胞組織器官的排斥等免疫反應(yīng)的發(fā)生或已發(fā)生免疫反應(yīng)強(qiáng)度的降低的免疫抑制劑。
正如這兒所使用到的，＂免疫抑制反應(yīng)＂指的是防止免疫反應(yīng)(例如如這兒所定義的給予免疫抑制劑)以至于免疫反應(yīng)并不能檢測到。正如這兒所使用到的，免疫反應(yīng)的預(yù)防指的是免疫反應(yīng)檢測不到。一個(gè)免疫反應(yīng)(例如移植排斥或抗體產(chǎn)生)按照本領(lǐng)域已知技術(shù)檢測到。
按照本發(fā)明＂免疫抑制＂同樣意指與任一并未受到免疫抑制試劑的移植受體或者不是“免疫盲的”或“免疫優(yōu)先”的如這兒所定義的那樣的移植物質(zhì)移植的受體相比較免疫反應(yīng)發(fā)生的延緩。免疫反應(yīng)的延緩發(fā)生可以是短期延緩，例如1小時(shí)至10天例如1小時(shí)，2，5或10天。免疫反應(yīng)發(fā)生的延緩也可以是長期延緩例如10天至10年(例如30天，60天，90天，180天，1，2，5，10年)。
按照本發(fā)明＂免疫抑制反應(yīng)＂同樣意指免疫反應(yīng)強(qiáng)度的減少，按照本發(fā)明免疫反應(yīng)強(qiáng)度可以減少例如5-100％，最好是25-100％及最好是75-100％任一并未受到免疫抑制試劑的移植受體或者不是“免疫盲的”或“免疫優(yōu)先”的如這兒所定義的那樣的移植物質(zhì)移植的受體的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。免疫反應(yīng)強(qiáng)度的減少通過確定移植物質(zhì)被排斥的時(shí)間點(diǎn)來測量。例如一個(gè)含有移植物質(zhì)在在移植后1天被排斥的免疫反應(yīng)比較在移植后30天被排斥的免疫反應(yīng)強(qiáng)度要大。
免疫反應(yīng)的強(qiáng)度同樣可以通過定量可特異性結(jié)合至移植物質(zhì)上的抗體的數(shù)量來測量其中所產(chǎn)生抗體的水平與免疫強(qiáng)度正相關(guān)。此外，免疫反應(yīng)強(qiáng)度可以通過確定檢測到的特異性抗體可特異性結(jié)合至移植物質(zhì)上的時(shí)間點(diǎn)來確定。
不同的方法和試劑可被用于免疫抑制。例如淋巴細(xì)胞的增殖和活化一般可通過使用這樣的試劑例如FK-506，環(huán)孢霉素或其他免疫抑制劑進(jìn)行抑制。另外的可能的方法是給予抗體例如抗GAD65單抗或其他的化合物其可以掩蓋移植細(xì)胞表面上的抗原并因此使得部分細(xì)胞為寄主免疫系統(tǒng)所看不到。
一個(gè)＂免疫抑制試劑＂是這樣的一個(gè)試劑其可以預(yù)防延緩寄主中外源細(xì)胞尤其是移植細(xì)胞的免疫反應(yīng)強(qiáng)度。最好是這樣的免疫抑制試劑其可以抑制細(xì)胞介導(dǎo)為其免疫系統(tǒng)鑒別為非自身的免疫反應(yīng)，免疫抑制試劑例如包括但并不限于環(huán)孢霉素，環(huán)磷酰胺，強(qiáng)的松，地塞米松，甲氨喋呤，咪唑硫嘌呤，mycophenolate，鎮(zhèn)靜劑，F(xiàn)K506，系統(tǒng)類固醇，及其他的大范圍內(nèi)的抗體，受體拮抗劑，及其他本領(lǐng)域已知的試劑。
一個(gè)＂促有絲分裂劑＂可以是任一試劑其可以刺激細(xì)胞的有絲分裂及增殖。
一個(gè)＂分化因子＂指的是可以導(dǎo)致干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化為另外細(xì)胞類型的試劑。分化一般通過改變干細(xì)胞或祖細(xì)胞一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其結(jié)果在于細(xì)胞改變了結(jié)構(gòu)及功能。
正如這兒所使用到的一個(gè)＂信號(hào)因子＂為一個(gè)細(xì)胞所分泌的試劑其可以作用于相同或不同的細(xì)胞。例如一個(gè)信號(hào)因子其可以抑制或誘導(dǎo)生長，增殖或其本身的分化，機(jī)體中的相鄰細(xì)胞或距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞。信號(hào)因子可以例如在組織中傳遞位置信息，調(diào)控結(jié)構(gòu)形成，或影響各種解刨學(xué)構(gòu)造的大小，形狀及功能。
正如這兒所使用到的，哺乳動(dòng)物指的是任一哺乳動(dòng)物包括但并不限于人類，鼠，羊，猴，山羊，兔子，碩鼠，馬，?；蜇i。
一個(gè)＂非人哺乳動(dòng)物＂，正如這兒所使用到的，意指非人的任一哺乳動(dòng)物。
正如這兒所使用到的，＂同種異源基因＂指的是同種遺傳性不同的成員。
正如這兒所使用到的，＂同基因＂指的是同樣的遺傳構(gòu)造。
正如這兒所使用到的，＂異基因＂指的是不同種的成員。
正如這兒所使用到的，＂培養(yǎng)＂指的是增殖或營養(yǎng)一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞，組織或器官的收集通過在一定環(huán)境下孵育一段時(shí)間并在此條件下支持細(xì)胞的增殖或存活。培養(yǎng)包括一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)展或增殖細(xì)胞，按照本發(fā)明收集細(xì)胞組織或器官的步驟。
本發(fā)明同樣提供了一個(gè)藥物組合物其包括本發(fā)明的分離干細(xì)胞以及藥理學(xué)上合適的載體。


圖1A及1B顯示了鼠胰島在胚胎16天雙重?zé)晒饷庖呒?xì)胞化學(xué)染色(圖1A)及在出生后60天(圖1B)。Nestin的抗體免疫染色以白色顯示(一開始是紅色，使用Cy3作為螢光團(tuán))且抗胰島素抗體是以灰色顯示(一開始是綠色，使用Cy2作為螢光團(tuán))。
圖2顯示了使用獲自50個(gè)鼠胰島mRNA進(jìn)行的RT-PCR結(jié)果，前后引物都已被標(biāo)明。834bp的單鏈被測序且被標(biāo)明為nestin序列。
圖3顯示了nestin陽性細(xì)胞其已從培養(yǎng)的鼠胰島中增殖。
圖4顯示了鼠胰島類似物在培養(yǎng)物中的發(fā)育。
圖5顯示了培養(yǎng)物中產(chǎn)生的胰島類似結(jié)構(gòu)的RT-PCR的分析結(jié)果。NCAM及cytokeratin-19(CK19)的表達(dá)都被檢測到。
圖6顯示了高葡萄糖刺激nestin mRNA的表達(dá)。APRT作為對(duì)照進(jìn)行鑒定。
圖7是nestin的氨基酸及核苷酸序列。
圖8描述了在胰島中獨(dú)特的細(xì)胞群體的神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記nestin的表達(dá)如免疫細(xì)胞化學(xué)或RT-PCR所確定的那樣。
圖9描述的是通過免疫細(xì)胞化學(xué)或RT-PCR從胰腺中分離的干細(xì)胞nestin。
圖10描述的是獲自nestin陽性胰島祖細(xì)胞(NIPs)的人類胰島類似性聚合體中的同族區(qū)域蛋白IDX-1及proglucagon的表達(dá)。
圖11證明了nestin陽性細(xì)胞在鼠胰腺管區(qū)域定位。
圖12描述其為胰島內(nèi)分泌細(xì)胞祖先的胰管細(xì)胞的起源的替代模型。
圖13A及B描述了nestin陽性肝臟干細(xì)胞的免疫熒光染色。
圖14描述了在鼠內(nèi)分泌胰腺發(fā)育期間轉(zhuǎn)錄因子的序列。
圖15描述了在含有干細(xì)胞的人類NIP培養(yǎng)物中神經(jīng)內(nèi)分泌，外分泌胰腺及肝臟標(biāo)記。
圖16描述了通過RT-PCR確定的proglucagon及胰島素mRNA的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在的發(fā)明家已經(jīng)鑒別且分離出了來自具有干細(xì)胞功能及分子特征的哺乳動(dòng)物胰腺胰島管細(xì)胞的一個(gè)特定的亞簇。尤其是，這些新發(fā)現(xiàn)的胰腺干細(xì)胞通過一個(gè)或多個(gè)(最好是全部)的其他事物來描述nestin陽性染色，nestin基因表達(dá)，cytokeratin-19陰性染色，培養(yǎng)物中的長期增殖，分化成為培養(yǎng)物中假胰島的能力。這些發(fā)明者同樣也鑒別出展示nestin陽性染色的肝細(xì)胞。
在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明提供了用于不同應(yīng)用的干細(xì)胞，其包括但并不限于當(dāng)研究工具發(fā)展至可以研究不同糖尿病條件下，荷爾蒙異常及遺傳疾病或條件例如具有特定生理及病理特征的多態(tài)性等條件下治療I型胰島素依賴型的糖尿病及其他類型的糖尿病的細(xì)胞替換。本發(fā)明的干細(xì)胞被同樣用于內(nèi)分泌胰腺及其他組織在同系移植物，同種異體移植物或異種移植物移植時(shí)的基因治療。而且，這兒所描述的干細(xì)胞可被用于產(chǎn)生重組細(xì)胞，人工組織及器官替換。
他們同樣可用于體外產(chǎn)生胰島素及其他激素。
本發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的胰腺干細(xì)胞的分子特征例如nestin陽性及cytokeratin-19陰性染色，或者肝干細(xì)胞，例如nestin陽性染色，其可被用于各種診斷，病理或調(diào)查性的方法以鑒別，定位及計(jì)量患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物組織中干細(xì)胞的數(shù)量。
胰島干細(xì)胞的鑒別以前的研究都聚焦于胰島管上皮細(xì)胞或者外分泌組織作為干細(xì)胞可能的來源以用于胰島外分泌細(xì)胞的再生。Nestin是一個(gè)中間纖維蛋白其通過從一個(gè)E15鼠胚胎使用一個(gè)單克隆抗體R.401(Hockfield & McKay，1985；Lendahl et al.，1990)篩選一個(gè)cDNA文庫進(jìn)行克隆。Nestin最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)上皮干細(xì)胞且其在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。在鼠胚胎E16中達(dá)到最高水平后，nestin表達(dá)量在成人大腦皮層降低至幾乎不可檢測的水平，其正好與早期nestin表達(dá)祖細(xì)胞的終止分化相一致(Lendahl et al.，1990)。Nestin起初僅發(fā)現(xiàn)于胚胎發(fā)育的腦及骨骼肌中的干細(xì)胞中(Lendahl et al.，1990)。最近的研究表明在成人哺乳動(dòng)物前腦中室管膜下層nestin陽性神經(jīng)干細(xì)胞(Morshead et al.，1994)。
Nestin陽性干細(xì)胞已被證明其是一個(gè)多能性的甚至當(dāng)其分離出成熟小鼠大腦中。例如，nestin陽性干細(xì)胞可以產(chǎn)生所有三種主要類型神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突細(xì)胞(Reynolds & Weiss，1996)。Nestin陽性神經(jīng)干細(xì)胞反應(yīng)脊髓的損傷是通過可以分化成為星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移細(xì)胞的增殖及降解，其也參與疤的形成(Johansson et al.，1999)且在輸入照射鼠后儲(chǔ)存骨髓造血細(xì)胞(Bjornson et al.，1999)。
干細(xì)胞的特征按照本發(fā)明所述的干細(xì)胞可以通過nestin的表達(dá)，例如FACS，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，RT-PCR，DNA印跡及蛋白質(zhì)印跡分析，及其他的本領(lǐng)域已知的細(xì)胞鑒別技術(shù)進(jìn)行鑒別。
免疫細(xì)胞化學(xué)染色，例如，按照下述方法進(jìn)行準(zhǔn)備自胰腺或肝臟的Cryosections(6pM)以及細(xì)胞在磷酸溶液的4％的多聚甲醛中固定。細(xì)胞首先使用3％正常的驢血清室溫下凝固30分鐘且與最初的抗相關(guān)蛋白的抗血清在4℃下過夜孵育培養(yǎng)。抗血清使用PBS洗滌且在合適的熒光標(biāo)記的第二抗體下室溫下孵育1小時(shí)。然后使用PBS再次洗滌斜面且使用熒光封固劑涂附斜面(Kirkegaard and PerryLabs，Gaithersburg，MD)。使用裝有界面上有一個(gè)PowerMac 7100裝有IP實(shí)驗(yàn)光譜分析軟件(Signal Analytics Corp，Vienna，VA)的光學(xué)TEC-470 CCD照相機(jī)(Optronics Engineering，Goleta，CA)的Zeiss Epifluorescence顯微鏡獲取熒光圖片。
按照本發(fā)明所述的有用的抗血清包括下列抗人細(xì)胞角蛋白19(clone K4.62，Sigma，St.Louis，MO)的鼠單抗，抗鼠nestin的兔多克隆抗血清以及抗鼠IDX-1(使用純化的GST-nestin融合蛋白或鼠IDX-1最后十二個(gè)氨基酸分別免疫兔子所準(zhǔn)備)(McManus et al.，1999，J.Neurosci.，199004-9015)的兔多克隆抗血清，豚鼠抗胰島素及抗胰腺多肽抗血清，獲自Linco，St.Charles，MO，且鼠抗胰高血糖素及兔抗生長激素抑制素，分別購買自Sigma(St.Louis，MO)及DAKO(Carpinteria，CA)，鼠抗人galanin(PeninsulaLaboratories，Belmont，CA)，角原質(zhì)IV抗血清(CaltagLaboratories，San Francisco，CA)，鼠抗鼠MHC I型血清(Seroteck)，及抗鼠MHC II型抗血清。本發(fā)明預(yù)期這些指向一定標(biāo)記的抗血清是可獲得的，另外的一些抗血清的使用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
RT-PCR及DNA印跡法按照下述方法進(jìn)行。獲自鼠或人胰島的總的細(xì)胞RNA被反轉(zhuǎn)錄且通過PCR擴(kuò)增按照擴(kuò)增的預(yù)期程度大約35個(gè)循環(huán)，正如前所述(Daniel，et al.，1998，Endocrinology，1393721-3729)。用作PCR引物或擴(kuò)增引物以及RNA印跡雜交的探針的寡聚核苷酸可以為鼠nestin正向，5′gcggggcggtgcgtgactac3′
反向，5′aggcaagggggaagagaaggatgt3′；雜交，5′aagctgaagccgaatttccttgggataccagagga3′。
鼠角蛋白19正向，5′acagccagtacttcaagacc3′；反向，5′ctgtgtcagcacgcacgtta3′；雜交，5′tggattccacaccaggcattgaccatgcca3′。
Rat NCAM正向，5′cagcgttggagagtccaaat3′；反向，5′ttaaactcctgtggggttgg3′；雜交，5′aaaccagcagcggatctcagtggtgtggaacgatgat3′。
Rat IDX-1正向，5′atcactggagcagggaagt3′反向，5′gctactacgtttcttatct3′雜交，5′gcgtggaaaagccagtggg3′人類nestin正向，5′agaggggaattcctggag3′；反向，5′ctgaggaccaggactctcta3′；雜交，5′tatgaacgggctggagcagtctgaggaaagt3′。
人類角蛋白正向，5′cttttcgcgcgcccagcatt3′；反向，5′gatcttcctgtccctcgagc3′；雜交5′aaccatgaggaggaaatcagtacgctgagg3′。
人類胰高血糖素正向，5′atctggactccaggcgtgcc3′；反向，5′agcaatgaattccttggcag3′；雜交，5′cacgatgaatttgagagacatgctgaaggg3′；人E-Cadherin正向，5′agaacagcacgtacacagcc3′反向，5′cctccgaagaaacagcaaga3′
雜交，5′tctcccttcacagcagaactaacacacggg3′人transthyretin正向，5′gcagtcctgccatcaatgtg3′反向，5′gttggctgtgaataccacct3′雜交，5′ctggagagctgcatgggctcacaactgagg3′人胰淀粉酶正向，5′gactttccagcagtcccata3′反向，5′gtttacttcctgcagggaac3′雜交，5′ttgcactggagaaggattacgtggcgttcta3′人羧肽酶原正向，5′tgaaggcgagaaggtgttcc3′反向，5′ttcgagatacaggcagatat3′雜交，5′agttagacttttatgtcctgcctgtgctca3′人Synaptophysin正向，5′cttcaggctgcaccaagtgt3′反向，5′gttgaccatagtcaggctgg3′雜交，5′gtcagatgtgaagatggccacagacccaga3′人類肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長因子(HGF)正向，5′gcatcaaatgtcagccctgg3′反向，5′caacgctgacatggaattcc3′雜交，5′tcgaggtctcatggatcatacagaatcagg3′人cMET(HGF-receptor)正向，5′caatgtgagatgtctccagc3′反向，5′ccttgtagattgcaggcaga3′雜交，5′ggactcccatccagtgtctccagaagtgat3′人XBP-1正向，5′gagtagcagctcagactgcc3′反向，5′gtagacctctgggagctcct3′
雜交，5′cgcagcactcagactacgtgcacctctgca 3′人Glut-2正向，5′gcagctgctcaactaatcac 3′反向，5′tcagcagcacaagtcccact 3′雜交，5′acgggcattcttattagtcagattattggt 3′人胰島素正向，5′aggcttcttctacaca 3′反向，5′caggctgcctgcacca 3′雜交，5′aggcagaggacctgca 3′其他的一些這樣的一些序列是可能的且這些序列被認(rèn)為在本技術(shù)方案的范圍之內(nèi)。正如普通教導(dǎo)，選自兩個(gè)不同外顯子的引物其包含至少一個(gè)內(nèi)含子序列。此外，一個(gè)RT負(fù)對(duì)照也用于許多樣品。PCR擴(kuò)增在94℃下1分鐘隨后再在94℃下10秒鐘，58/56℃下10秒，72℃下1分鐘，35個(gè)循環(huán)，及在72℃下2分鐘。退火溫度是58℃對(duì)于鼠nestin來講且對(duì)于其他的引物堿基對(duì)來講為56℃。
對(duì)于分離自非鼠或人的哺乳動(dòng)物的mRNA的RT-PCR，特異于來自要準(zhǔn)備分析的哺乳動(dòng)物種的擴(kuò)增核酸的寡聚核苷酸。這些引物的選擇及使用為本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知。
對(duì)于DNA雜交寡聚核苷酸探針使用合適的放射性核來進(jìn)行標(biāo)記，例如y32PATP，其使用傳統(tǒng)的技術(shù)。
放射性標(biāo)記探針在37℃下雜交于轉(zhuǎn)移進(jìn)入尼龍膜的PCR產(chǎn)品一小時(shí)，然后在1×SSC+0.5％SDS在55℃下洗滌10-20分鐘或在0.5×SCC+0.5％SDS在42℃下對(duì)于人類的PCR產(chǎn)品。
Nestin作為胰腺干細(xì)胞的標(biāo)記發(fā)明家已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)成人哺乳動(dòng)物包括人類的胰臟含有表達(dá)nestin的細(xì)胞。重要的是，nestin陽性細(xì)胞在胰臟中的分布并不相應(yīng)于激素產(chǎn)生細(xì)胞。例如特異性反應(yīng)與胰島素或胰高血糖素的熒光標(biāo)記抗體分別標(biāo)記有胰島的β及α細(xì)胞，其中發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在老鼠及人類中熒光標(biāo)記的nestin抗體僅位于管上皮的某些細(xì)胞中且并不是α，β，delta，及產(chǎn)生于胰島的胰臟多肽(圖1)。發(fā)明者同樣發(fā)現(xiàn)特異于膠原質(zhì)IV的抗體，動(dòng)脈管endothelial細(xì)胞galanin，神經(jīng)末梢的一個(gè)標(biāo)記及細(xì)胞角蛋白19，管細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)記，其并不共位于nestin抗體。此外，發(fā)明家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)nestin陽性胰島細(xì)胞并不與抗胰島素，胰高血糖素，生長激素抑制素或者胰多肽共標(biāo)記(圖1)。這表明這些nestin包含細(xì)胞并非內(nèi)分泌細(xì)胞，管細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞或者動(dòng)脈endothelial細(xì)胞，但是其卻代表一個(gè)先前并未描述的胰島中的真正獨(dú)特的細(xì)胞類型。發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰島中的nestin陽性細(xì)胞正如胰臟導(dǎo)管中的其他區(qū)域一樣且位于外分泌胰臟的centroacinar區(qū)域。
nestin mRNA在胰島中的表達(dá)通過使用RT-PCR使用分離自鼠胰島的RNA(圖2)進(jìn)行檢測。nestin陽性胰臟細(xì)胞的功能性特點(diǎn)使用通過從胰島中分離出nestin陽性細(xì)胞且細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行檢測，這些下面進(jìn)一步描述。
發(fā)明家同樣發(fā)現(xiàn)了鼠肝含有可以表達(dá)nestin的細(xì)胞(圖13)。
細(xì)胞角蛋白-19作為管上皮細(xì)胞截然不同的細(xì)胞特征的標(biāo)記細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)是另一種中間纖維蛋白。CK-19及相關(guān)的細(xì)胞角蛋白先前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在胰臟導(dǎo)管細(xì)胞中表達(dá)(Bouwens etal.，1994)。發(fā)明家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雖然如此但是CK-19表達(dá)限制于小導(dǎo)管，特異于CK-19的熒光抗體完全不同于nestin特異性抗體標(biāo)記的導(dǎo)管細(xì)胞。這表明胰島中的nestin陽性細(xì)胞可能是一種很特別的導(dǎo)管細(xì)胞類型其不同于CK-19陽性細(xì)胞。
從胰島中分離干細(xì)胞及其用途干細(xì)胞可分離自準(zhǔn)備的胰腺組織，例如，獲自糖尿病患者組織的活組織切片的胰島。干細(xì)胞然后被體外擴(kuò)展然后結(jié)果產(chǎn)生的移植細(xì)胞再回到供體作為移植物。在供體內(nèi)，其可以分化成為胰島素分泌細(xì)胞例如β細(xì)胞以取代可因自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致糖尿病的β細(xì)胞丟失。該方法可以克服來自于移植組織的免疫排斥問題，例如，來自于另一可能作為供體的個(gè)體的胰島。在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，同系移植干細(xì)胞的使用促使開發(fā)別的方法以避免免疫排斥，也就是移植細(xì)胞的基因治療以實(shí)施其對(duì)免疫排斥的抵抗，例如I型糖尿病中的自身免疫性疾病。在整個(gè)胰島中使用干細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)勢是移植干細(xì)胞可以原位分化以更好地適應(yīng)寄主細(xì)胞的環(huán)境，例如提供合適的微循環(huán)及反應(yīng)于寄主生理需要的不同胰島細(xì)胞類型的互補(bǔ)。本發(fā)明另一個(gè)技術(shù)方案中設(shè)計(jì)了部分分化干細(xì)胞體外的用途，例如，形成祖細(xì)胞，其進(jìn)一步被移植進(jìn)入寄主再在寄主中選擇性進(jìn)一步分化。盡管干細(xì)胞，祖細(xì)胞或假胰島細(xì)胞同系移植物的用途，另一個(gè)技術(shù)方案也設(shè)計(jì)了獲自其他的個(gè)體或種的哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞，祖細(xì)胞或假胰島細(xì)胞的同種異體移植物。
在本發(fā)明的另外的技術(shù)方案中，干細(xì)胞是免疫盲的或免疫優(yōu)先的。在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，免疫優(yōu)先的干細(xì)胞并不表達(dá)足夠量的I型和/或II型主要組織相容性抗原(a.k.a.HLA或者人類白細(xì)胞抗原)以誘導(dǎo)來自寄主的免疫反應(yīng)。例如，這些干細(xì)胞獲自同種異基因或異種異基因來源其在免疫活性的移植受體中并不誘發(fā)寄主抗移植物反應(yīng)。
在本發(fā)明的另外的技術(shù)方案中，免疫優(yōu)先的干細(xì)胞并不表達(dá)I型MHC抗原和/或II型MHC抗原。這些干細(xì)胞，獲自同種異基因或異種異基因來源的其在免疫活性的移植受體中并不誘發(fā)寄主抗移植物反應(yīng)。
在本發(fā)明的另外的技術(shù)方案中，人類組織移植物包括表達(dá)人類特異性的I型和II型MHC抗原的干細(xì)胞，但是卻為免疫活性鼠本身所識(shí)別而且并不忍受寄主對(duì)移植物的排斥。這些干細(xì)胞，獲自同種異基因或異種異基因來源的其在免疫活性的移植受體中并不誘發(fā)寄主抗移植物反應(yīng)。
本發(fā)明同樣提供了從異種異基因供體中分離干細(xì)胞及將結(jié)果的干細(xì)胞移植進(jìn)入其他種的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中去的方法(例如鼠干細(xì)胞被移植進(jìn)入人體例如一個(gè)人糖尿病患者)作為異種移植物。
本發(fā)明提供了進(jìn)行nestin陽性干細(xì)胞的同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特征在于干細(xì)胞在移植前已被培養(yǎng)了很長一段時(shí)間，例如，2-4小時(shí)，4-5小時(shí)，5-10小時(shí)或1-3天。
本發(fā)明同樣提供了進(jìn)行nestin陽性干細(xì)胞的同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特征在于干細(xì)胞在移植前已擴(kuò)展了一段時(shí)間，例如，2-4小時(shí)，4-5小時(shí)，5-10小時(shí)或1-3天通過細(xì)胞分化成為其他的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明同樣提供了干細(xì)胞的同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特征在于nestin陽性干細(xì)胞通過使用選自下列組份的組的試劑EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，IDX-1，編碼IDX-1的一個(gè)核酸分子，GLP-1，exendin-4，betacellulin，activinA，TGF-，或其組合在移植前一段時(shí)間例如2-4小時(shí)，4-5小時(shí)，5-10小時(shí)或1-3天誘導(dǎo)其分化成為祖細(xì)胞。以胰臟干細(xì)胞為例，干細(xì)胞最終分化成為胰臟祖細(xì)胞。
本發(fā)明同樣提供了同基因，同種異基因，及異源異基因的移植方法其特征在于nestin陽性干細(xì)胞在移植前并不培養(yǎng)擴(kuò)展或分化成為祖細(xì)胞或者其特征在于nestin陽性干細(xì)胞在移植前被培養(yǎng)和/或擴(kuò)展和/或分化。
Nestin陽性細(xì)胞在來自分離胰島的培養(yǎng)物中被增殖隨后被分離以形成可以無限增殖的干細(xì)胞系。
發(fā)明家發(fā)現(xiàn)了nestin表達(dá)細(xì)胞在培養(yǎng)胰島中生長且在培養(yǎng)后4天就發(fā)現(xiàn)在其周圍生長。這些細(xì)胞具有神經(jīng)元類似的形態(tài)(圖3)，表現(xiàn)出nestin陽性染色，且表達(dá)nestin mRNA。含有nestin陽性細(xì)胞的胰島也可分離自其他細(xì)胞，例如纖維原細(xì)胞其通過使用伴刀豆球蛋白培養(yǎng)胰島使其增殖。這些含有nestin陽性干細(xì)胞的胰島將不再粘附在伴刀豆球蛋白包覆的容器表面例如，這樣可使胰島被簡單移出而其他類型細(xì)胞卻被粘附在容器上。胰島然后被移至不含伴刀豆球蛋白包覆的容器中。以鼠細(xì)胞為例的具體的培養(yǎng)及分離方法詳見實(shí)施例1所述。相似的結(jié)果獲自人類細(xì)胞。
培養(yǎng)物中假胰島及導(dǎo)管結(jié)構(gòu)的形成本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案提供了通過使其形成假胰島類似聚合體以至于可被移植進(jìn)入胰島細(xì)胞數(shù)量在不給予激素治療時(shí)不足以維持正常的生理學(xué)調(diào)控的患者移植干細(xì)胞或祖細(xì)胞的替代途徑。胰島衍生干細(xì)胞可如上所述獲自培養(yǎng)物胰島或獲自增殖的干細(xì)胞系。將干細(xì)胞暴露于不同的生長因子條件下以誘導(dǎo)其分化，這個(gè)過程在實(shí)施例2和3中進(jìn)行描述。
干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化成為胰島細(xì)胞可以誘導(dǎo)胰臟干細(xì)胞分化的生長因子包括但并不限于EGF-2，堿性FGF，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，betacellulin，activin A，TGF-P，及其組合。
GLP-1指的是胰高血糖素類似的多肽-1。高葡萄糖指的是比培養(yǎng)干細(xì)胞所使用的正常的濃度要高的葡萄糖濃度。例如，干細(xì)胞在大約5.6mM濃度葡萄糖下可以正常培養(yǎng)及增殖，而高葡萄糖濃度指的是另外的高于5.6mM的葡萄糖濃度。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，設(shè)計(jì)了一個(gè)16.7mM的葡萄糖濃度。在實(shí)施例2中，可能還要使用這樣的生長因子如堿性纖維生長因子(bFGF)及上皮生長因子(EGF)。
在培養(yǎng)基中除了加入生長因子之外還包括在干細(xì)胞被移植進(jìn)入動(dòng)物或人體時(shí)其他有助于分化的生長因子。在這種情況下許多生長因子不管是已知的還是未知的都能被內(nèi)生細(xì)胞所分泌且暴露于干細(xì)胞周圍。移植干細(xì)胞通過內(nèi)源或外源給予的與預(yù)期目標(biāo)也就是說最終的分化的細(xì)胞類型或形成的解剖學(xué)特征(如組織或器官)相適應(yīng)的生長因子的任意組合誘導(dǎo)其分化。
一個(gè)技術(shù)方案提供了一個(gè)刺激分化的方法給予生長因子的下游感受器或使用編碼該感受器的核酸分子轉(zhuǎn)染干細(xì)胞或祖細(xì)胞。一個(gè)例子是IDX-1，其是一個(gè)可為GLP-1或exendin-4誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子。
引入的感受器例如IDX-1可以引發(fā)分化以形成內(nèi)分泌胰島細(xì)胞。
移植排斥分析本發(fā)明提供了一個(gè)體內(nèi)評(píng)估移植物質(zhì)存活的方法。按照本發(fā)明通過移植一個(gè)干細(xì)胞或一個(gè)假胰島類似性聚合體入一個(gè)免疫抑制的或非免疫抑制的哺乳動(dòng)物分析實(shí)驗(yàn)性移植排斥反應(yīng)。
例如，非免疫抑制的C57BL/6小鼠按照本發(fā)明被使用人類干細(xì)胞移植(例如在腎囊中)，通過犧牲移植受體且對(duì)存活移植物染色或在移植物上(例如移植物上的一個(gè)器官或組織)在移植后合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)移植排斥進(jìn)行分析。在該時(shí)間點(diǎn)對(duì)移植物的染色(例如蘇木精/曙紅或免疫染色)可以變化，例如按照移植哺乳動(dòng)物平均的存活時(shí)間或預(yù)期的存活時(shí)間。通過染色分析移植位點(diǎn)，移植后1天至10年(例如，1，5，10，30，100或更多天，1，2，5，或10年)，最好是10天至1年且更好是10-100天。例如，如果移植物質(zhì)在鼠腎囊中被引入，檢查移植鼠的腎。如果移植物質(zhì)被檢測到和/或移植物質(zhì)在組織中進(jìn)行增殖的話說明移植物被成功移植(也就是說沒有被排斥)。
移植物的增殖及檢測例如通過準(zhǔn)備自移植位點(diǎn)的冷凍部分(例如腎)的蘇木精/曙紅染色及并不起源于移植受體的新生長(例如不是寄主腎獲得的)的檢測進(jìn)。在異種移植的情況下，使用特異于獲自移植物起源的種的抗原的抗血清進(jìn)行的特異性的免疫染色的話移植物被成功移植，按照本領(lǐng)域已知的且這兒所描述的免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法鑒別陽性細(xì)胞。此外，在一個(gè)技術(shù)方案中進(jìn)行的異種移植，如果獲自移植種的(從其中移植物質(zhì)所獲得的種)分子(例如蛋白或抗原)在移植受體的血液中檢測到的話移植物被成功移植。
正如這兒所使用到的，＂排斥＂指的是寄主免疫系統(tǒng)對(duì)移植物的排斥。在一個(gè)技術(shù)方案中，“排斥”意指移植物中有超或90％的細(xì)胞或組織因?yàn)榧闹髅庖叻磻?yīng)壞死的發(fā)生。在另一個(gè)技術(shù)方案中，“排斥”意指生存能力的降低也就是說因?yàn)榧闹鞯拿庖叻磻?yīng)移植物中有90％甚至更多與移植前相比較生存能力降低。生存能力的降低可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測到，包括但并不限于trypan藍(lán)專一染色。在另一個(gè)技術(shù)方案中，“排斥”意指移植物增殖的失敗。增殖可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)包括但并不限于蘇木精/曙紅染色檢測到。移植排斥的發(fā)生和/或移植后排斥發(fā)生的速度將因各種因素而變化，包括但并不限于移植物質(zhì)(例如細(xì)胞類型或細(xì)胞數(shù)量)或寄主(也就是說不管寄主是免疫不容性的和/或使用免疫抑制劑處理過的)。
移植方法本發(fā)明提供了移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法。一個(gè)干細(xì)胞，祖細(xì)胞或分化細(xì)胞被“移植”或“引入”進(jìn)入一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)期從培養(yǎng)器皿中進(jìn)入患者時(shí)。
按照本發(fā)明，移植包括按照本發(fā)明所述分離干細(xì)胞的步驟且轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者的步驟。按照本發(fā)明，移植還涉及到轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者通過注射細(xì)胞懸液進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者的途徑，外科輸入哺乳動(dòng)物或患者的組織或器官的細(xì)胞，或使用細(xì)胞懸液注入組織或器官。轉(zhuǎn)移干細(xì)胞或移植的路徑，將按照細(xì)胞在特定組織或器官中的位置需要及細(xì)胞發(fā)現(xiàn)且滯留在預(yù)期目標(biāo)組織或器官位置的能力確定。當(dāng)移植細(xì)胞停留在特定的位置時(shí)，其可以通過外科手術(shù)方法進(jìn)入組織或器官或簡單地注入到血漿中去如果細(xì)胞具有移動(dòng)至目標(biāo)靶器官的能力的話。按照本發(fā)明所述的移植包括分離干細(xì)胞的步驟以及培養(yǎng)且轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者體內(nèi)去的步驟。在另一個(gè)實(shí)施例中，這兒所使用的移植還包括分離干細(xì)胞，分化干細(xì)胞，轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者體內(nèi)去的方法。這兒所使用的移植還包括按照本發(fā)明分離干細(xì)胞，分化及擴(kuò)展干細(xì)胞且轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入哺乳動(dòng)物或患者體內(nèi)去的方法。
使用胰臟干細(xì)胞治療胰島素依賴型糖尿病患者的方法干細(xì)胞對(duì)于取代I型糖尿病患者的喪失的β細(xì)胞或提高II型糖尿病患者的β細(xì)胞的總的數(shù)量是非常有用的。糖尿病患者更適宜作為用于產(chǎn)生干細(xì)胞，祖細(xì)胞或假胰島類似物聚合體的供體。干細(xì)胞存在成人胰島或胰臟導(dǎo)管。對(duì)糖尿病患者進(jìn)行活組織檢查后，從活組織中分離出胰島且體外準(zhǔn)備24小時(shí)，干細(xì)胞然后使用上述方法在2-3周內(nèi)分離且增殖。分離后或經(jīng)過一段時(shí)間生長因子誘導(dǎo)的分化干細(xì)胞可被直接移回患者。胰島可通過如實(shí)施例2所述的亞培養(yǎng)產(chǎn)生。胰臟外科手術(shù)活組織分析的整個(gè)過程在大約30天內(nèi)進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中可用到多功能干細(xì)胞。這些細(xì)胞是免疫盲的或免疫優(yōu)先的例如在異源或異種移植物中，其可以被受體作為自身識(shí)別而不是限制于I型或II型抗原的MHC。在本發(fā)明該技術(shù)方案的一方面，這些細(xì)胞并不表達(dá)MHC型和/或II型抗原。
在本發(fā)明另一個(gè)技術(shù)方案中，移植物受體可以證明寄主對(duì)其它移植細(xì)胞的移植排斥其可以通過給予抗體激起反應(yīng)，例如一個(gè)自身抗原如GAD65，通過給予一個(gè)或多個(gè)這里所述的免疫抑制劑或使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)以預(yù)防或減緩自身免疫排斥反應(yīng)。
此外，按照本發(fā)明分離自非人哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞移植進(jìn)入人糖尿病患者。在移植步驟之前，干細(xì)胞可被培養(yǎng)和/或擴(kuò)展和/或分化。
使用胰臟干細(xì)胞治療肝病患者的方法胰臟干細(xì)胞或祖細(xì)胞分化形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的能力是眾所周知的(Bisgaard & Thorgeirsson，1991)。本發(fā)明的胰臟干細(xì)胞可以用于提供肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞以治療肝病患者所遭受的肝病例如cirrosis，肝炎，或肝癌其中功能性肝組織已經(jīng)被減少。本發(fā)明所述的干細(xì)胞同樣可被經(jīng)過基因治療處理遺傳缺陷并引入患者恢復(fù)肝功能。Nestin陽性干細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中被分化也可在體內(nèi)使用一個(gè)或多個(gè)生長因子或其它的處理例如使用核酸分子轉(zhuǎn)染其結(jié)果是干細(xì)胞分化形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。在一個(gè)技術(shù)方案中，發(fā)明設(shè)計(jì)了使用cyclopamine以抑制例如sonichedgehog，結(jié)果使得肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞形成。在本發(fā)明另一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞可不經(jīng)過任何體外處理移植且在患者體內(nèi)使用合適的生長因子。在另一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞使用生長因子或其它試劑體外處理結(jié)果以部分分化或結(jié)果分化的狀態(tài)移植進(jìn)入患者。在發(fā)明的另一個(gè)方面，包括轉(zhuǎn)染干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，注射的劑量及途徑，藥物組合物，供體一同系移植物的方法及免疫抑制方法可用與反分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞就像分化為胰臟組織一樣。
本發(fā)明專門設(shè)計(jì)了移植進(jìn)入患者的同基因移植，異基因移植或異種異基因移植干細(xì)胞或其組合。
干細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法有不同的方法基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入胰臟干細(xì)胞。磷酸鈣沉降DNA法已被使用但轉(zhuǎn)化效率很低，尤其是對(duì)非粘附性細(xì)胞來講。此外，磷酸鈣沉降DNA法經(jīng)常導(dǎo)致多種反復(fù)子的插入，增加了內(nèi)外源DNA功能的損害的可能性(Boggs，1990)。陽離子脂類例如以脂質(zhì)體的形態(tài)，同樣是包裝DNA以轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的有效方法且?guī)追N商業(yè)陽離子脂類試劑也是可獲得的。電穿孔法相比較磷酸鈣沉降法提高了轉(zhuǎn)化效率，其具有在基因組單一位點(diǎn)提供單一拷貝插入子的優(yōu)勢。DNA直接微注射進(jìn)入細(xì)胞核是另外一種基因轉(zhuǎn)移的方法，其已經(jīng)顯示可提供對(duì)于短期轉(zhuǎn)染來講將近100％的效率且對(duì)于穩(wěn)定的DNA整合有20％的效率。微注射有時(shí)避免了外源DNA通過細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞運(yùn)輸?shù)膯栴}。該方法要求轉(zhuǎn)移物體積要小，其還要考慮到在每細(xì)胞中引入已知量的DNA。獲取事實(shí)上較純的干細(xì)胞的能力將提高微注射途徑用于靶定胰臟干細(xì)胞基因修飾的可行性。盡管如此，微注射也是一項(xiàng)沉悶的，高度專一的技術(shù)。該技術(shù)的這一特征限制了在一定時(shí)間內(nèi)注射進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量，因此其在大范圍內(nèi)的使用是很受限制的。是用逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法將基因插入胰臟干細(xì)胞是較為理想的方法。逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了一個(gè)任意的，單拷貝的單位點(diǎn)插入子且轉(zhuǎn)染效率很高。其它的一些轉(zhuǎn)染方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來講是已知的且被認(rèn)為是在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
胰臟干細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化胰臟細(xì)胞基因轉(zhuǎn)化涉及到逆轉(zhuǎn)錄病毒也作“輔助病毒”(也就是說，膜缺陷型病毒基因組其攜有相關(guān)外源基因但是不能形成完整的病毒顆粒)。例外的載體例如DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，腺病毒，SV40，腺病毒相關(guān)病毒，及單純皰疹病毒載體也可被用到。當(dāng)選擇不同的載體用于轉(zhuǎn)染時(shí)要考慮到各種因素，有時(shí)最好使用一個(gè)病毒長末端重復(fù)子或者一個(gè)強(qiáng)的內(nèi)源啟動(dòng)子以表達(dá)外源基因而不是簡單依靠拼接的亞基因簇RNA。
干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的兩種最基本的方法是共培養(yǎng)或上清感染。上清感染涉及到將干細(xì)胞重復(fù)暴露于病毒上清液中。共培養(yǎng)涉及到干細(xì)胞及一感染的“組裝細(xì)胞系”(參見下面)混合24-48小時(shí)，共培養(yǎng)一般要較上清感染對(duì)于干細(xì)胞轉(zhuǎn)化來講更為有效。共培養(yǎng)后，感染的干細(xì)胞進(jìn)一步被培養(yǎng)以建立一個(gè)長期培養(yǎng)物(LTC)。
含有輔助病毒的細(xì)胞系指的是包裝細(xì)胞系，不同的包裝細(xì)胞系也是可獲得的。包裝細(xì)胞系的一個(gè)重要的特點(diǎn)是其并不能產(chǎn)生復(fù)制完整的輔助病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中從中獲得干細(xì)胞的動(dòng)物或患者在抽取干細(xì)胞前使用5-fluorouracil(5-FU)對(duì)其進(jìn)行處理，相比較未處理的細(xì)胞來講，5-FU處理的干細(xì)胞更易于逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染。然而，5-FU干細(xì)胞很大程度地減少了克隆基因起源的數(shù)量。
在另一個(gè)技術(shù)方案中，收獲的干細(xì)胞暴露于不同的生長因子條件下，例如那些用于提高胰臟干細(xì)胞增殖及分化的生長因子。生長因子在轉(zhuǎn)染之前，其中或之后被引入培養(yǎng)物以提高細(xì)胞的復(fù)制及轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明生長因子的使用提高了轉(zhuǎn)化效率從30到80％不等。
典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化方案哺乳動(dòng)物胰臟干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)及隨后移植進(jìn)入未被切除的受體以充分獲得可能的移植及基因表達(dá)在含有已顯示于小鼠的后裔細(xì)胞的不同組織中。靶細(xì)胞在輸入受體之前在含有相關(guān)基因的合適載體的存在下培養(yǎng)2-4天。
更確切地講，骨髓干細(xì)胞獲自雄性供體(4-8周年齡時(shí))BALB/cAnNCr小鼠(National Cancer Institute，Division of Cancer TreatmentAnimal Program，F(xiàn)rederick，MD)。這些細(xì)胞被培養(yǎng)在一個(gè)密度為1-2×107cells/10cm的平皿上且在含有10％熱失活的牛胎血清，谷氨酸鹽，Pen/Strep，100U/ml的白細(xì)胞介素-6(IL-6)及以激活細(xì)胞生長的干細(xì)胞因子(SCF；Immunex，Seattle，WA)(Schiffmann，et。al.，1995)的DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時(shí)，
與此同時(shí)，培養(yǎng)一個(gè)病毒包裝細(xì)胞系24小時(shí)，該包裝細(xì)胞系為Schiffmann，等所使用。其為GP+E86且病毒載體為基于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LN系列的LG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
經(jīng)過一段合適的培養(yǎng)時(shí)間，1-2×107干細(xì)胞被培養(yǎng)在一個(gè)10cm的含有病毒包裝細(xì)胞的平皿上然后在8g/ml polybrene的存在下共培養(yǎng)48小時(shí)然后在相同的生長因子刺激的環(huán)境下其作為供體干細(xì)胞。收獲該干細(xì)胞，洗滌生長培養(yǎng)基注入受體鼠以2×107細(xì)胞/注射的劑量并進(jìn)行多次注射(總共5次以每天或每周計(jì))。
干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)及移植的成功可通過例如PCR分析，免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DNA印跡法或蛋白質(zhì)印跡法或其它本領(lǐng)域已知技術(shù)來進(jìn)行。
哺乳動(dòng)物本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物可以是任意哺乳動(dòng)物(例如，人，小鼠，鼠，綿羊，兔子，山羊，猴子，馬，東歐鼠，豬或牛)。本發(fā)明所述非人哺乳動(dòng)物可以是任意非人哺乳動(dòng)物包括但并不限于小鼠，鼠，綿羊，兔子，山羊，猴子，馬，東歐鼠，豬或牛。
給予的劑量及模式作為一個(gè)例子，這兒所述的需要胰臟干細(xì)胞的患者可以如下進(jìn)行處理，本發(fā)明的細(xì)胞可被給予患者，最好以生物學(xué)上適宜的溶液形式或藥物學(xué)上可接受的輸入載體，通過攝取，注射，吸入或其它的一些方法。一個(gè)可行的方法是內(nèi)向倒退注射。另外的方法是注射或取代細(xì)胞或假胰島類似性聚合體進(jìn)入腎囊中。給予的藥劑量可因患者而不同，一個(gè)“治療有效性劑量”可被確定，例如但不限于通過功能性增強(qiáng)的水平(例如，胰島素產(chǎn)量或血漿葡萄糖水平)。干細(xì)胞引入水平的監(jiān)控，由該轉(zhuǎn)移影響的某些基因的表達(dá)水平，和/或編碼產(chǎn)品的存在及表達(dá)，同樣也使得本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇及調(diào)整給予的劑量。一般來講一個(gè)含有干細(xì)胞的藥物組合物以105-108，最好是106-107個(gè)細(xì)胞每公斤體重的范圍以單一劑量給予患者。這些劑量可以以每天，每周，每月，每年計(jì)或者由治療醫(yī)師確定合適的劑量。本發(fā)明提供了同樣可被移出患者體內(nèi)的細(xì)胞群體或者通過體外擴(kuò)展，使用含有預(yù)期治療基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，然后再重新輸入患者體內(nèi)。
藥物組合物本發(fā)明提供了包含如本發(fā)明所述干細(xì)胞混合有生理學(xué)上可接受載體的藥物組合物。正如這兒所使用的，＂生理學(xué)上適宜的載體＂指的是生理學(xué)上可接受的稀釋劑例如水，磷酸緩沖鹽或鹽及進(jìn)一步包括佐劑，佐劑例如有不完整的傅氏佐劑，正磷酸鋁，氫氧化鋁，以及明礬等本領(lǐng)域已知的物質(zhì)。
本發(fā)明同樣也提供了藥物組合物。除了活性成分以外，這些藥物組合物還包括合適的藥學(xué)載體其可以被藥理學(xué)上使用。
用于口服的藥物組合物可使用本領(lǐng)域已知的適于口服的藥物載體一起包裝。這些載體使得藥物組合物以片劑，藥丸，糖衣，膠囊，液體，凝膠體，糖漿，漿液，懸浮液及其類似的形式為患者所攝取。
用于口服的藥劑可通過結(jié)合活性成分與固體賦形劑，加入合適的輔助劑后，例如為了獲得片劑或糖衣核心混合后選擇性碾磨，處理混合細(xì)粒。相應(yīng)的賦形劑可為糖類或蛋白類例如糖包括乳糖，蔗糖，甘露糖或山梨糖糖，玉米淀粉，小麥，大米，馬鈴薯及其他植物；維生素例如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，或者羧甲基纖維素鈉；以及橡膠包括阿拉伯膠及黃芪膠；以及蛋白例如凝膠及膠原質(zhì)。如果需要，加入溶解劑或分解劑例如交聯(lián)的乙烯聚合物pyrrolidone，瓊脂，褐藻酸，或其鹽例如藻酸鈉。
所提供的糖衣核心具有合適的糖衣例如濃縮的糖溶液，其也含有阿拉伯樹膠，云母，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，carbopol凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦漆溶液，及合適有機(jī)溶液及溶液混合物。染料或色料加入到片劑中或糖衣上用于產(chǎn)品識(shí)別或表明活性成分的數(shù)量例如劑量。
可被用于口服的藥物制劑包括由凝膠制成的推入契合膠囊以及軟的由凝膠制成的封閉膠囊一樣以及衣被甘油或山梨糖醇。推入契合膠囊包括混有諸如乳糖或淀粉的添充劑，諸如云母或硬脂酸鎂的潤滑劑以及可選擇性的穩(wěn)定劑的活性成分。在軟的膠囊中，活性化合物可被溶解或懸浮在合適的液體中例如油脂，液體石蠟或液體聚乙二醇有或無穩(wěn)定劑。
腸胃外投藥的藥劑包括活性成分的液體溶液。對(duì)于注射，本發(fā)明的藥物組合物可以溶液形式，最好在生理學(xué)上適宜的緩沖劑例如Hank′s溶液，Ringer′溶液，或生理緩沖鹽的存在下制成。液體注射懸浮液可以包括可提高懸浮液粘度的物質(zhì)例如羧甲基鈉纖維素，山梨糖，或右旋糖酐。此外，活性溶劑或載體的懸浮液包括油脂例如香油，或合成的脂肪酸酯例如乙基油酸鹽或甘油三酸酯，或脂質(zhì)體?？蛇x擇地，該懸浮液也包括適宜的穩(wěn)定劑或可以提高化合物溶解度以形成高濃度溶液的化合物。
對(duì)于鼻給藥形式，適于特定屏障的滲透劑在制藥時(shí)考慮使用，該滲透劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均為已知。
本發(fā)明的藥物組合物可以本領(lǐng)域已知技術(shù)生產(chǎn)例如通過傳統(tǒng)的混合，溶解，?；?，糖衣制備，懸浮，乳化，形成膠囊，包載及凍干途徑。
藥物組合物可以鹽的形式提供也可以許多酸的形式形成，包括但不限于鹽酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，蘋果酸，琥珀酸等等。適宜在液體情況下更易溶解的鹽及其他的質(zhì)子溶劑其也具有相應(yīng)自由的堿基。在另外的情況下，首選的試劑也可以是一凍干的干粉其在lmM-50mM組氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇在PH值4.5至5.5其在使用前使用緩沖液混合。
在含有本發(fā)明化合物的藥物組合物以一合適載體形成完成時(shí)，其可放置于合適的容器標(biāo)簽上給藥的條件包括數(shù)量，頻率及途徑。
上述基本描述了本發(fā)明，其通過下述實(shí)施例可以更好地完整理解，其在這里僅僅是證明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1從鼠胰臟中分離Nestin陽性干細(xì)胞鼠胰島分離自2-3個(gè)月的老的Sprague-Dawley鼠使用如Lacy及Kostianovsky所述的膠原酶溶解的方法。人體胰島由糖尿病研究所，邁阿密，F(xiàn)L提供使用膠原酶溶解法獲得。胰島在37℃下在12孔平板培養(yǎng)96小時(shí)(Falcon 3043 plates，Becton Dickinson，LincolnPark，NJ)在該平板上涂覆有伴刀豆球蛋白A。培養(yǎng)基為RPMI 1640補(bǔ)充有10％牛胎血清，1mM丙酮酸鈉，10mM HEPES緩沖液，100μg/ml鏈霉素，100units/ml青霉素，0.25μg/ml兩性霉素B(GIBCOBRL，Life Science Technology，Gaithersburg，MD)，及71.5mMβ巰基乙醇(Sigma，St。Louis，MO)。
96小時(shí)后，纖維原細(xì)胞及其他非胰島細(xì)胞粘附在伴刀豆球蛋白A涂覆的培養(yǎng)孔表面上而胰島在漂浮(并未附在表面)。這時(shí)，含有胰島的培養(yǎng)基被移走，離心分離，將純化的胰島重新種植在沒有伴刀豆球蛋白A涂覆的12孔平板上。胰島然后在上述RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)充有20ng/ml堿性纖維原細(xì)胞生長因子-2及20ng/ml上皮生長因子下培養(yǎng)。
粘附在平板表面的胰島及長出且離開胰島的細(xì)胞在一個(gè)單層。這些形成單層的細(xì)胞使用麻州普通醫(yī)院的Dr。Mario Vallejo所創(chuàng)立的兔抗鼠nestin抗血清免疫染色為nestin陽性。另外的nestin抗體也可能被用到，例如這兒所述的R.401抗體，或MAB533抗體。特異于鼠胚胎脊髓nestin的單抗，MAB353，ATCC No.1023889；描述于神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)雜志1996；161901-100；其同樣可獲自ChemiconInternational，Single Oak Dr.，Temecula，CA 92590 USA。培養(yǎng)后兩周，幾個(gè)(3-5)nestin陽性單層細(xì)胞通過毛細(xì)管采摘移出(cylinder cloning)且在12孔平板上重新種植(其上不再涂覆有伴刀豆球蛋白A)且培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充有bFGF-2及EGF。細(xì)胞以很快的速度進(jìn)行增殖且培養(yǎng)后六天覆蓋平板。培養(yǎng)后12天細(xì)胞單層形成波動(dòng)其中其開始以co-linear型式疊加。培養(yǎng)第15天，細(xì)胞波開始濃縮，移入球形體后在第17天形成含有球形體的孔表面(ca.直徑為100μm)，中空，一部分保留有單層細(xì)胞，重新挑選幾個(gè)這樣的單層細(xì)胞且重新克隆，然后上述途徑在相同的時(shí)間段再次進(jìn)行。
實(shí)施例2胰腺干細(xì)胞分化形成胰島鼠胰島首先在含有10％的牛胎血清的RPMI培養(yǎng)基上在伴刀豆球蛋白A包覆的12孔平板上培養(yǎng)，胰島在除了牛胎血清外未加入培養(yǎng)因子的情況下培養(yǎng)三天。經(jīng)過這個(gè)期間，其中胰島并未粘附，胰島被轉(zhuǎn)移至不含伴刀豆球蛋白A的新的平板。
干細(xì)胞然后通過暴露其于bFGF-2(20ng/ml)及EGF(20ng/ml)24天被刺激從干細(xì)胞中增殖形成單層。24天以后，單層達(dá)到豐度其中圍繞著胰島的是一群細(xì)胞，這些細(xì)胞被挑選然后被亞克隆進(jìn)入新的12孔平板并再次在含有bFGF及EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
亞克隆快速以無性繁殖的形式增殖進(jìn)入單層，并從中心向外延擴(kuò)展。細(xì)胞在第6天達(dá)到豐度并在第12天重疊細(xì)胞波。在第17天細(xì)胞幾乎被全部移植進(jìn)入球形結(jié)構(gòu)體及關(guān)系型結(jié)構(gòu)體等胰島類似結(jié)構(gòu)(假胰島類似聚合體)及管狀類似結(jié)構(gòu)(假導(dǎo)管)(圖4)。RT-PCR分析表明假胰島類似聚合體表達(dá)NCAM(內(nèi)分泌細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)記，參見圖5)，細(xì)胞角蛋白19(導(dǎo)管細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)記，參見圖5)，以及轉(zhuǎn)錄因子brain-4(一個(gè)貝塔細(xì)胞標(biāo)記)。使用生長因子處理以實(shí)現(xiàn)其最終分化成為成熟胰島細(xì)胞的目的。
實(shí)施例3人或鼠胰島的分離及培養(yǎng)分離及培養(yǎng)人類胰島，人類胰島組織獲自細(xì)胞移植中心，糖尿病研究所，邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)院哈佛醫(yī)學(xué)院，Boston，MA的用于胰島移植的青少年糖尿病基金的胰島分配程序，手工挑選徹底洗滌的胰島，在修飾的RPMI1640培養(yǎng)基(11.1mM葡萄糖)補(bǔ)充有10％牛胎血清，10mM HEPES緩沖液的，1mM丙酮酸鈉，100U每mL青霉素G鈉鹽，100μg/mL鏈霉素硫酸鹽，0.25ng/mL兩性霉素B，及71.5uMβ巰基乙醇，及加入鷹3043且包覆有伴刀豆球蛋白A(ConA)的12孔組織培養(yǎng)平板。胰島在37℃下在有5％空氣及5％CO2下孵育96小時(shí)。在這種條件下，更多的胰島依然保留在懸浮液中(漂浮)，而纖維原細(xì)胞及其他的非胰島細(xì)胞黏附在培養(yǎng)基上，孵育后96小時(shí)，含有懸浮胰島的培養(yǎng)基被小心移出，手工挑選胰島然后在修飾的RPMI1640補(bǔ)充有20ng/mL堿性纖維原細(xì)胞生長因子(bFGF)及上皮生長因子(EGF)中重懸浮。胰島懸浮液(包含有20-30個(gè)胰島的平板)被加入到12孔并不附有ConA的組織培養(yǎng)平板上，胰島快速黏附在平板表面。
在幾天內(nèi)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞單層從胰島中長出。在有些情況下，人源細(xì)胞被培養(yǎng)在含有2.5mM葡萄糖及幾種包括activin-A(2nM)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長因子(100pM)，或betacellulin(500pM)的生長因子的組合的修飾的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這些實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞使用10mM煙堿處理，培養(yǎng)基不含有血清及生長因子。
實(shí)施例4葡萄糖及GLP-1對(duì)胰腺干細(xì)胞分化的影響。
可使胰島尺寸增加的血漿葡萄糖濃度的評(píng)估。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度使用含有nestin陽性干細(xì)胞的分離的胰島來調(diào)查。鼠胰島被培養(yǎng)在含有高葡萄糖濃度(16.7mM)的培養(yǎng)基或正常的(5.6mM)葡萄糖濃度中。四天后，使用RT-PCR確定nestin mRNA的水平。結(jié)果表明與正常葡萄糖濃度培養(yǎng)的胰島相比高濃度葡萄糖濃度培養(yǎng)下的胰島nestin mRNA的水平提高了3倍(圖6)。
類似的，注入glucagon類似的多肽-1(GLP-1)進(jìn)入小鼠發(fā)現(xiàn)48小時(shí)后胰島數(shù)提高了2倍。具有編碼GLP-1受體的分裂的基因的暈的小鼠再次檢查其胰島nestin的表達(dá)。
使用一nexin抗體進(jìn)行的免疫染色被發(fā)現(xiàn)可以大大減少其與正常小鼠的GLP-1受體相比較。
糖尿病動(dòng)物模型給予結(jié)果是其癥狀的減少的糖尿病類型的治療在一個(gè)其可展示糖尿病癥狀的動(dòng)物中進(jìn)行測試。所設(shè)計(jì)的進(jìn)行試劑或方法測試的動(dòng)物有益于人體的糖尿病的治療。糖尿病的潛在治療首先在動(dòng)物模型中測試并觀察其效果并比較其與未處理的對(duì)照組的區(qū)別。
非肥胖的糖尿病(NOD)小鼠對(duì)于I型糖尿病或胰島素依賴的糖尿病來說是重要的(參見Kikutano and Makino，1992，Adv.Immunol.52285 and references cited therein，herein incorporated by reference)。在NOD小鼠中I型糖尿病的發(fā)展不需要外界的任何刺激可以自然發(fā)生也可突然發(fā)生，當(dāng)NOD小鼠發(fā)展糖尿病時(shí)，其遭到β細(xì)胞的程序性破壞其由慢性自身免疫性疾病所致。在NOD小鼠中胰島素依賴型的糖尿病的發(fā)展可以被大概分為兩個(gè)階段自身免疫刺激的誘發(fā)(胰島中淋巴細(xì)胞感染)及胰島破壞的加速并爆發(fā)糖尿病。糖尿病NOD小鼠以euglycemia開始其生命，或正常的血液葡萄糖水平，但是在大約過了15至16周時(shí)NOD小鼠開始變成hyperglycemic，表明其大部分胰腺β細(xì)胞的破壞且胰腺喪失產(chǎn)生足夠量的胰島素的能力。除了胰島素缺乏及多糖癥外，糖尿病NOD小鼠也要遭受嚴(yán)重的糖尿，polydypsia，及多尿癥，伴隨有體重的快速減少。這樣，該疾病的發(fā)生及進(jìn)程非常相似于遭受胰島素依賴型的糖尿病的人體患者。自然康復(fù)很少發(fā)生于NOD小鼠上，且這些糖尿病動(dòng)物在糖尿病發(fā)生后1-2個(gè)月如果不接受胰島素治療的話均死去。
NOD小鼠被用作動(dòng)物模型以測試按照本發(fā)明給予干細(xì)胞治療糖尿病的不同方法的有效性。同樣地，通過給予干細(xì)胞治療在NOD小鼠中也進(jìn)行測試以驗(yàn)證其對(duì)I型糖尿病的有效性。
干細(xì)胞被給予一個(gè)NOD小鼠，一般是通過腹腔進(jìn)行，按照下述的劑量。NOD小鼠被給予大約每個(gè)小鼠1×101至1×104個(gè)細(xì)胞每小鼠。在NOD小鼠中在大約4周給予小鼠，然后從8至10周，每周3次。用于檢測糖尿病的小鼠在大約13周時(shí)開始，按照下述方法一周兩次。治療效果可比較處理及未處理的NOD小鼠得出。
在NOD的小鼠中對(duì)糖尿病的治療效果可通過分析NOD小鼠中糖尿病進(jìn)行其使用本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如，檢查NOD小鼠是否多渴，多尿，糖尿，多糖癥及胰島素缺乏癥或者體重減少。例如，葡萄糖尿的水平(糖尿)可通過Testape(Eli Lilly，Indianapolis，IN.)進(jìn)行檢測且血漿葡萄糖水平使用如Burkly，1999，U.S.Patent 5,888,507，這兒被引用作為參考等所述的Glucometer 3血糖儀(Miles，Inc.，Elkhart，IN.)。通過這些方法檢測尿糖及血糖水平，NOD小鼠被認(rèn)為是糖尿病患者在經(jīng)過兩個(gè)連續(xù)的尿陽性測試使用Testape值+1或更高或血漿葡萄糖水平＞250mg/dL(Burkly，1999，supra)。在NOD小鼠中另外的檢測糖尿病的方法在NOD小鼠中檢測胰島素水平，例如胰島素水平可由免疫測定且在處理及對(duì)照組比較后確定(Yoon，U.S.Patent 5,470,873，herein incorporated by reference)。在這種情況下，從鼠胰臟中抽取的胰島素及其濃度可由免疫活性例如放射性免疫測定來進(jìn)行確定，使用鼠胰島素作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。
除了一般使用NOD小鼠檢測糖尿病外，治療方法效果如果干細(xì)胞被使用外源基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染通過基因特異性或基因產(chǎn)品特異性來進(jìn)行檢測，因此，考慮到在外源基因表達(dá)及其對(duì)糖尿病的效果之間有一定的關(guān)聯(lián)。例如，外源基因產(chǎn)品的存在可以通過產(chǎn)生基因產(chǎn)品及胰島素的NOD小鼠胰臟β細(xì)胞的胰島的免疫組織化學(xué)而確定。通過檢測RNA轉(zhuǎn)錄補(bǔ)丁或平滑受體在NOD小鼠中進(jìn)一步測定補(bǔ)丁及平滑基因的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增是通過已知技術(shù)擴(kuò)增一個(gè)鼠補(bǔ)丁或平滑cDNA片段來進(jìn)行的，且按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。擴(kuò)增cDNA片段的鑒別通過雜交擴(kuò)增片段與用于補(bǔ)丁或者平滑基因的熒光標(biāo)記的內(nèi)寡聚核苷酸探針，或者通過本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)進(jìn)行。
實(shí)施例5nestin陽性的人或鼠胰腺干細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒別通過分析nestin的表達(dá)來分析胰島。胰島及干細(xì)胞如上進(jìn)行分離。Nestin的表達(dá)通過在胚胎第16天(E16)鼠胰腺中(圖8A)及在成人胰腺胰島中(出生后60天)(圖8B)發(fā)育的胰島群中明顯的免疫細(xì)胞化學(xué)染色來觀察。免疫細(xì)胞化學(xué)染色如下進(jìn)行。
取自胚胎第16天及成人(60天)的鼠胰腺Cryosections(6M)與細(xì)胞一樣使用4％多聚甲醛磷酸溶液固定。
細(xì)胞首先使用3％正常的猴血清在室溫下處理30分鐘且在4℃下使用第一抗體過夜培養(yǎng)?？寡迨褂肞BS洗滌且分別使用Cy-3及Cy-2標(biāo)記的第二抗體在室溫下孵育一小時(shí)。再使用PBS洗滌斜面PBS且使用熒光封固劑(Kirkegaard and Perry Labs，Gaithersburg，MD)重新覆蓋斜面。組織部分在4℃下使用第一抗體過夜培養(yǎng)。第一抗血清使用PBS洗滌，且斜面使用3％正常猴血清在室溫下孵育10分分鐘在其使用猴抗Cy3(indocarbocyanine)及抗豚鼠豬(胰島素)，抗鼠(胰高血糖素)，或抗綿羊(生長激素抑制素)sera DTAF(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)在室溫下孵育30分鐘。斜面然后再使用PBS洗滌并使用熒光封固劑(Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)重新覆蓋。使用裝有界面上有一個(gè)PowerMac7100裝有IP實(shí)驗(yàn)光譜分析軟件(Signal Analytics Corp，Vienna，VA)的光學(xué)TEC-470 CCD照相機(jī)(Optronics Engineering，Goleta，CA)的Zeiss Epifluorescence顯微鏡獲取熒光圖片。
Nestin陽性細(xì)胞區(qū)別于β-，α-，δ-，及PP細(xì)胞因?yàn)槠洳⒉慌c抗荷爾蒙胰島素，胰高血糖素，生長激素抑制素，或者胰腺多肽的抗血清共染色-(圖8A&B)。Nestin陽性細(xì)胞同樣也并不與抗膠原質(zhì)IV，動(dòng)脈endothelial細(xì)胞標(biāo)記(圖8C)的抗血清共染色，也不與抗galanin，神經(jīng)細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)記或者細(xì)胞角蛋白19也即導(dǎo)管細(xì)胞的一個(gè)單抗(圖8)的一個(gè)單抗共染色。Nestin陽性染色與核共染色所清楚觀察到的胰島的截然不同細(xì)胞相關(guān)(圖4D)。
實(shí)施例6通過RT-PCR鑒別nestin陽性人及鼠干細(xì)胞為了證實(shí)胰島中nestin表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒別，我們使用準(zhǔn)備自新的分離鼠胰島及人類胰島組織的總的RNA進(jìn)行的nestin mRNA的RT-PCR。按照下述方法進(jìn)行RT-PCR取自鼠及人胰島的總的細(xì)胞RNA被反轉(zhuǎn)錄且通過PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)如前所述(Daniel等.，1998，Endocrinology，1393721-3729)。用作PCR的引物或擴(kuò)增引物以及隨后DNA印跡雜交的探針的寡聚核苷酸如下鼠nestin正向，5′gcggggcggtgcgtgactac3′；反向，5′aggcaagggggaagagaaggatgt3′；
雜交，5′aagctgaagccgaatttccttgggataccagagga3′。
鼠角蛋白19正向，5′acagccagtacttcaagacc3′；反向，5′ctgtgtcagcacgcacgtta3′；雜交，5′tggattccacaccaggcattgaccatgcca3′。
鼠NCAM正向5′cagcgttggagagtccaaat3′；反向5′ttaaactcctgtggggttgg3′；雜交，5′aaaccagcagcggatctcagtggtgtggaacgatgat3′。
鼠IDX-1正向，5′atcactggagcagggaagt3′反向，5′gctactacgtttcttatct3′雜交，5′gcgtggaaaagccagtggg3′人類nestin正向，5′agaggggaattcctggag3′；反向，5′ctgaggaccaggactctcta3′；雜交，5′tatgaacgggctggagcagtctgaggaaagt3′。
人類角蛋白正向，5′cttttcgcgcgcccagcatt3′；反向，5′gatcttcctgtccctcgagc3′；雜交，5′aaccatgaggaggaaatcagtacgctgagg3′。
人類胰高血糖素正向，5′atctggactccaggcgtgcc3′；反向，5′agcaatgaattccttggcag3′；雜交，5′cacgatgaatttgagagacatgctgaaggg3′。
選自兩個(gè)不同外顯子的引物包含至少一個(gè)內(nèi)含子序列。此外，一個(gè)RT負(fù)的對(duì)照也有很多例子。PCR循環(huán)在94℃下1分鐘然后再在94℃下10秒，58/56℃下10秒，72℃下1分鐘，35個(gè)循環(huán)且在72℃下2分鐘。退火溫度為58℃對(duì)于鼠nestin來講且在56℃下對(duì)其它的引物堿基。
對(duì)于DNA雜交寡聚核苷酸探針使用熒光標(biāo)記的T4多聚核苷酸激酶及y32P ATP。熒光標(biāo)記探針雜交于PCR產(chǎn)品其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上在37℃下1小時(shí)，然后使用1×SSC+0.5％SDS在55℃下洗滌10-20分鐘或在0.5×SCC+0.5％SDS在42℃下洗滌對(duì)于人類PCR產(chǎn)品來講。
合適預(yù)期尺寸的RT-PCR產(chǎn)生的產(chǎn)品(圖8E，上面板)且通過DNA印跡法證實(shí)(圖8E，較低面板)且通過產(chǎn)品的DNA測序。這些數(shù)據(jù)證明表達(dá)nestin的且可能代表胰島多功能性干細(xì)胞其相似于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的nestin陽性干細(xì)胞的胰島中新的細(xì)胞類型的鑒別。
實(shí)施例7nestin陽性干細(xì)胞的體外增殖nestin陽性干細(xì)胞的體外增殖能力的確定。
獲自60天大的小鼠或正常成人的胰島首先種植在伴刀豆球蛋白A包覆的盤子上然后在修飾的含有10％牛胎血清的RPMI1640培養(yǎng)基上培養(yǎng)四天以洗滌去胰島中的粘附在ConA-包覆的盤子上的纖維原細(xì)胞及其他非胰島細(xì)胞。在這些培養(yǎng)基條件下并不黏附在盤子上的胰島被收集然后轉(zhuǎn)移進(jìn)入一個(gè)12孔平板上(并不含有ConA包覆)其含有相同的修飾RPMI1640培養(yǎng)基此外補(bǔ)充有bFGF及EGF(20ng/mL每一個(gè))。生長因子bFGF及EGF一起被選擇因?yàn)槠湟阎梢源碳か@自大腦室管膜的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖(Reynolds and Weiss，1996，Dev.Biol.，1751-13)。粘附在平板上的胰島及細(xì)胞慢慢地長出胰島形成單層(在人類細(xì)胞中估計(jì)細(xì)胞有兩倍的時(shí)間40-45小時(shí))。長出的細(xì)胞單層表型同類(圖9A，平板1)且表達(dá)nestin(圖9A，平板12)。鼠細(xì)胞從單層中挑出(一批至少20-30個(gè)細(xì)胞)，亞克隆進(jìn)入一個(gè)12孔平板上，及在含有bFGF及EGF的修飾的RPMI1640培養(yǎng)基中(11.1mM葡萄糖濃度)下培養(yǎng)。亞克隆細(xì)胞快速生長且在第6天達(dá)到豐度估計(jì)細(xì)胞數(shù)加倍的時(shí)間為12-15小時(shí)(圖9A，平板3)，且在第12天形成波狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)后15-17天，細(xì)胞形成胰島類似性聚合體(ILCs)(圖9A，平板14)。相同的細(xì)胞克隆自人類細(xì)胞(圖9B)。在達(dá)到豐度時(shí)(圖9B，平板1)，人類細(xì)胞遷移以形成大空泡結(jié)構(gòu)(圖9B，平板2及3)。大范圍的細(xì)胞形態(tài)改變，圓的聚集形成三維ILCs(圖9B，平板4-6)。
這些形成ILCs的nestin陽性胰島祖細(xì)胞(NIPs)的分化的指示劑通過RT-PCR及DNA印跡法進(jìn)行確定發(fā)現(xiàn)其可以表達(dá)內(nèi)分泌標(biāo)記NCAM(神經(jīng)細(xì)胞黏附分子)(Cirulli et al.，1994，J.Cell Sci.，1071429-36)(圖9C，右邊的盤子)且導(dǎo)管細(xì)胞標(biāo)記CK19(細(xì)胞角蛋白19)(Bouwens et al.，1998，J.Pathol.，184234-9；Bouwens et al.，1995，J.Histochem.Cytochem.，43245-53；Bouwens et al.，1994，Diabetes，431279-93)(圖9C，左邊盤子)。在研究的這個(gè)階段其得出結(jié)論當(dāng)NIPs形成豐度并聚合進(jìn)胰島類似性細(xì)胞聚合物，其開始表達(dá)胰腺基因(NCAM及CK19)，但是因?yàn)槿狈ζ浞只癁閮?nèi)分泌細(xì)胞的生長因子胰島基因的表達(dá)很受局限性，同樣發(fā)現(xiàn)祖細(xì)胞群體的分化一般需要首先一個(gè)增殖階段然后在分化特異成形素生長因子的存在下增殖靜止階段。因此培養(yǎng)條件在某些情況下是需要修飾的例如更替含有其誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖的11.1mM葡萄糖，bFGF及EGF的培養(yǎng)基，取而代之的是包含低濃度葡萄糖(2.5mM)，其是低增殖活性的，且生長因子HGF/散開因子或betacellulin及ActivinA的培養(yǎng)基。對(duì)于胰島β細(xì)胞來講葡萄糖是已知的增殖因子(Swenne，1992，Diabetologia，35193-201；Bonner-Weir，1989，Diabetes，3849-53)且包括HGF/分散因子及Activin A表明可以分化胰腺導(dǎo)管細(xì)胞系A(chǔ)R42J以形成一個(gè)可分泌胰島素，胰高血糖素及其它胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞蛋白的內(nèi)分泌表型(Mashima et al.，1996，Endocrinology，1373969-76；Mashima et al.，1996，J.Clin.Invest.，971647-54)。
含有ILCs的培養(yǎng)物表達(dá)胰腺特異性homeodomain蛋白IDX-1通過免疫細(xì)胞化學(xué)(圖10A，上層)，RT-PCR及DNA印跡法(圖10B)，及通過蛋白質(zhì)印跡(圖10C)。ILCs同樣表達(dá)編碼如RT-PCR(Fig。10D)所示胰高血糖素前體且產(chǎn)生免疫反應(yīng)性的胰高血糖素，胰高血糖素類似性多肽-1及胰島素。在幾個(gè)正好給定值為40-80pg/ml GLP-1，30-70pg/ml胰高血糖素，29-44pg/ml胰島素的胰島類似聚合體培養(yǎng)后72-96小時(shí)后獲得的培養(yǎng)基的放射性免疫測定。放射性免疫測定如下進(jìn)行。
培養(yǎng)基中胰島素及胰高血糖素的濃度分別通過購買自Linco研究公司以及DPC公司的超敏感性放射性免疫試劑盒來確定。在各自的試劑盒中的抗血清是豚鼠抗人胰島素及兔抗人胰高血糖素。GLP-1分泌物使用合成多肽CFIAWLVKGR氨基化合物配對(duì)keyhole limpet血藍(lán)質(zhì)免疫兔形成的抗人GLP-1(7-36)氨基化合物兔多克隆抗血清進(jìn)行測量。該抗血清對(duì)于GLP-1(7-36)氨基化合物的檢測是高度特異性的而且僅僅是每周檢測胰高血糖素前體，這些測試的敏感水平分別是6pg/mL，13pg/mL及10.2pg/mL。
在10mM鹽堿中孵育ILCs 7天，正如Ramiya等(Ramiya et al.，2000，Nat.Med.，6278-282)所述那樣，可以將胰島素的分泌提高2至3倍。
幾個(gè)額外的胰腺標(biāo)記在分化的NIPs例如葡萄糖運(yùn)輸子-2(Wanget al.，1998)，synaptophysin，及HGF(Menke et al.，1999)如圖15所示進(jìn)行表達(dá)。為了確定分化的NIPs是否具有胰腺外分泌組織的特點(diǎn)，我們使用RT-PCR以及檢測淀粉酶以及羧肽酶原的表達(dá)(圖15)。
含有干細(xì)胞的一些NIPs培養(yǎng)物通過RT-PCR同樣表達(dá)編碼如16A及B所示的胰島素及胰高血糖素前體的mRNA。
IDX-1的表達(dá)顯得尤為重要因?yàn)槠浔昏b別為一個(gè)胰腺發(fā)育的主要調(diào)控子且尤其是在可產(chǎn)生胰島素的胰島β細(xì)胞成熟及形成功能所必需的因子(Stoffers et al.，1997，Trends Endocrinol.Metab.，8145-151)。
在胰管中尤其是在新生階段(鼠及小鼠)甚至在有些情況下整個(gè)成人階段(Bonner-weir et al.，1993，Diabetes，421715-1720；Rosenberg，1995，Cell Transplant，4371-383；Bouwens et al.，1996，Virchows Arch.，427553-560)由細(xì)胞分化所形成新的胰島已為大家所共知，在成熟數(shù)的胰管中分析nestin的表達(dá)。通過雙重抗nestin及抗細(xì)胞角蛋白熒光免疫細(xì)胞化學(xué)抗血清，一個(gè)導(dǎo)管上皮細(xì)胞標(biāo)記，nestin都是很強(qiáng)地表達(dá)于大小導(dǎo)管的一定區(qū)域以及在一些外分泌腺泡組織中的centrolobular導(dǎo)管(圖11A及11B)。尤其是，導(dǎo)管中nestin表達(dá)的一定區(qū)域大部分沒有使用抗CK19抗血清染色。更進(jìn)一步講，nestin陽性細(xì)胞表現(xiàn)出具有一定的形態(tài)其區(qū)別于包含有同系立體，圓柱細(xì)胞的上皮細(xì)胞。Nestin陽性細(xì)胞是有核的，匐行的且停留在上皮細(xì)胞中或其周圍的裂縫中。(圖11C)。
這樣，CK19并未表達(dá)于大多數(shù)的表達(dá)nestin的導(dǎo)管細(xì)胞中其表明這些nestin表達(dá)細(xì)胞位于胰臟導(dǎo)管中其為一個(gè)過客細(xì)胞不同于導(dǎo)管上皮細(xì)胞且為尚未分化進(jìn)入導(dǎo)管或內(nèi)分泌表型的干細(xì)胞。胰腺導(dǎo)管中及成熟鼠胰島中nestin表達(dá)細(xì)胞的定位的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了這樣的觀點(diǎn)鼠胰管包含有胰島細(xì)胞(新生)的祖細(xì)胞，但是這些祖細(xì)胞卻并不是導(dǎo)管上皮細(xì)胞本質(zhì)上的亞簇。
實(shí)施例8所設(shè)計(jì)的在糖尿病患者的人體中表達(dá)IDX-1的胰腺干細(xì)胞的移植分離自豬或人供體胰臟的胰島，或來自最終的人體轉(zhuǎn)移受體的的胰腺活組織的胰島在體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是可以刺激干細(xì)胞的增殖的條件。干細(xì)胞從胰島中分離(克隆的)，在含有bFGF-2，EGF，及11.1mM葡萄糖的增殖培養(yǎng)基中體外擴(kuò)展，使用含有編碼轉(zhuǎn)錄因子IDX-1的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或注入并轉(zhuǎn)錄進(jìn)入糖尿病受體中。
作為一種選擇，在移植以激發(fā)設(shè)計(jì)干細(xì)胞分化形成β細(xì)胞之前IDX-1轉(zhuǎn)染干細(xì)胞使用GLP-1處理1-3天或其他分化的成形素或生長因子。在一個(gè)技術(shù)方案中，干細(xì)胞在給予受體之前既不擴(kuò)展也不分化或者僅僅在給予受體之前擴(kuò)展或分化。在一個(gè)技術(shù)方案中，在移植以刺激干細(xì)胞分化期間或之后幾天GLP-1給予受體并使得其成功移植。按照這種方法，xenographs(豬胰島)或allographs(來自人供體而不是受體的人胰島)，也正如進(jìn)行的isographs(獲自受體的胰島)一樣。假定當(dāng)移植進(jìn)入寄主受體時(shí)干細(xì)胞遺傳庫被重新設(shè)計(jì)以至于寄主將干細(xì)胞識(shí)別為自身(在所有的xenographs或allographs情況下)，以至于由自身免疫反應(yīng)所形成的免疫不容或或破壞以及移植排斥不發(fā)生。
實(shí)施例9在患有糖尿病的人體中移植培養(yǎng)的胰腺干細(xì)胞以激發(fā)IDX-1的表達(dá)所述分離胰島體外培養(yǎng)幾天首先激發(fā)胰島中干細(xì)胞的擴(kuò)展或增殖然后表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子IDX-1。干細(xì)胞的增殖通過在含有bFGF-2，EGF，及11.1mM葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胰島實(shí)現(xiàn)。經(jīng)過預(yù)處理的上述胰島被移植進(jìn)入受體。此外，移植后幾天或期間寄主受體可被給予GLP-1以進(jìn)一步分化或擴(kuò)展干細(xì)胞形成胰島素產(chǎn)生細(xì)胞以提高移植的成功性。
按照這種方法，xenographs(豬胰島)，allographs(來自人體供體而不是受體的人胰島)，正如isographs(獲自受體的胰島)一起進(jìn)行。
實(shí)施例10胰腺干細(xì)胞異種移植進(jìn)入腎人類nestin陽性胰島祖細(xì)胞(NIPS)如所述進(jìn)行分離并在非免疫抑制的8個(gè)C57B16小鼠的腎囊中移植。移植的人體細(xì)胞并不為鼠受體所排斥。一般的理解是一個(gè)異種移植物例如人體組織將在5-10天內(nèi)為鼠所排斥。與該理解相反的是，我們發(fā)現(xiàn)8個(gè)非免疫抑制的小鼠中有8個(gè)如期測試所有的移植物成功移植且在大約移植105-106個(gè)細(xì)胞之后一個(gè)月(30-38天)吸附腎的組織中增殖。
一個(gè)C57B16小鼠作為試驗(yàn)以確定在移植位點(diǎn)大范圍的新的生長。具有新組織的部分腎被分為兩部分被冷凍為組織冷凍切片，另一部分組織學(xué)石蠟切片在多聚甲醛中固定。準(zhǔn)備冷凍切片使用蘇木精和曙紅(H&E)及抗不同胰島細(xì)胞抗原的抗血清染色。
檢查H&E染色的腎部分證明其不是部分腎的新的生長的存在，顯示了含有混合間葉細(xì)胞以及含有肝，神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)管，adipodipic及hematopoetic組份的多態(tài)性。腎切片的顯微圖片證明了新的生長的腎parenchyme，及glomeruli。使用人體(非鼠)特異的抗血清的免疫染色揭示了許多人類特異性的角蛋白，vimentin及CD45白細(xì)胞抗原特異于人類造血淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞染色。另外一個(gè)C57B16小鼠的腎同樣具有NIP移植位點(diǎn)相似外觀的新生長。
C57B16小鼠的NIP移植腎的石蠟切片(殺死第一小鼠)被檢測。被檢測的凝血組織來自腎的頂部其在沒有顯示進(jìn)入腎實(shí)質(zhì)中的腎囊中顯示出外源組織很好的相容性。顯著的是，在多態(tài)相似性移植組織中為腎實(shí)質(zhì)區(qū)域。不局限于任一理論的是含有干細(xì)胞的移植物分化該干細(xì)胞不是侵入而只是簡單的轉(zhuǎn)移且增殖一個(gè)小生境，即間葉細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。其可從腎臟中獲取某種誘導(dǎo)并分化為腎。移植細(xì)胞不是惡性的，但卻是具有其功能的干細(xì)胞。
實(shí)施例11胰腺干細(xì)胞異種移植進(jìn)入胰臟人類nestin陽性胰島祖細(xì)胞(NIPS)如上所述被分離并移植進(jìn)入非免疫抑制的小鼠的胰臟且(a)使用鏈脲霉素(產(chǎn)生鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病)處理或(b)NOD小鼠中胰島正在發(fā)炎。
移植動(dòng)物的胰腺被檢測以確定是否NIPs發(fā)現(xiàn)其合適的小生境并接受來自胰島區(qū)域的誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞。
實(shí)施例12通過異種移植胰腺干細(xì)胞治療糖尿病人類胰島如上進(jìn)行分離然后體外培養(yǎng)幾天以擴(kuò)展干細(xì)胞數(shù)目，人類NIPS通過靜脈移植進(jìn)入肝臟(按照本領(lǐng)域已知的移植進(jìn)入肝臟的技術(shù))。
作為一種選擇，一定數(shù)量的人類NIPs(如上所述進(jìn)行分離)被引入血管。在一些技術(shù)方案中，人類NIPS通過胰腺動(dòng)脈被引入并將其導(dǎo)向糖尿病胰腺。
對(duì)照組(未移植動(dòng)物)及移植動(dòng)物被用于分析糖尿病癥狀的改善(例如血糖水平，胰島素水平，胰腺β細(xì)胞數(shù)量)。
實(shí)施例13
肝臟中Nestin陽性干細(xì)胞的鑒別按照本領(lǐng)域已知技術(shù)及這里所描述的技術(shù)分離鼠肝臟且凍結(jié)切片。
鼠肝凍結(jié)切片(6μM)使用兔抗nestin多克隆抗體免疫染色。免疫熒光信號(hào)通過反應(yīng)標(biāo)記有熒光團(tuán)Cy3(黃橙顏色)的抗猴IgG血清來進(jìn)行測定。圍繞在一個(gè)大的膽管的Nestin陽性細(xì)胞如圖13A所示。圍繞在幾個(gè)小的膽管的nestin陽性細(xì)胞如圖13B所示。
實(shí)施例14NIPs向肝顯型分化因?yàn)閳?bào)道的肝干細(xì)胞(卵形細(xì)胞)，肝星細(xì)胞，及胰腺祖細(xì)胞的外觀相似性，隨后一些損傷的觀察，再生的胰腺經(jīng)歷了肝的轉(zhuǎn)化(Slack，1995；Reddy et al.，1991；Bisgaard et al.，1991；Rao et al.，1996)，我們進(jìn)行RT-PCR異在干細(xì)胞中檢測肝表達(dá)基因。PCR產(chǎn)品獲得XBP-1，一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)育中所需要的轉(zhuǎn)錄因子(Reimold等.，2000)，以及transthyretin，一個(gè)肝急性狀態(tài)蛋白。幾個(gè)其他的肝標(biāo)記同樣被表達(dá)例如胎蛋白(Dabeva et al.，2000)，E-Cadherin(Stamatoglou et al.，1992)，c-MET(Ikeda et al.，1998)，HGF(Skrticet al.，1999)以及synaptophysin(Wang et al.，1998)；see Fig.15))。胰腺及肝臟所共同進(jìn)行的蛋白表達(dá)，例如HGF及synaptophysin，可以反映出其共同起源于胚胎前腸內(nèi)胚葉且表明其分化為或者胰腺或者肝的顯型。
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其他的一些技術(shù)方案權(quán)利要求書中所出現(xiàn)的其它的技術(shù)方案如下。
權(quán)利要求
1.治療糖尿病患者的方法，包括以下步驟(a)從供體的胰島中分離出nestin陽性胰腺干細(xì)胞；且(b)將該干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)患者中，其特征在于干細(xì)胞分化形成胰島素產(chǎn)生細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于患者作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于患者并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于患者是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于在步驟(b)之前患者并不使用免疫抑制劑進(jìn)行處理。
6.如權(quán)利要求1所述的方法其特征在于，在轉(zhuǎn)移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理干細(xì)胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結(jié)合體。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，此外又包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理患者。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于免疫抑制劑可以延緩已經(jīng)發(fā)生的免疫反應(yīng)。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
12.如權(quán)利要求8，9，10或11所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于免疫抑制劑選自下列組份FK-506，環(huán)孢霉素，及GAD65抗體。
14.治療糖尿病患者的一個(gè)方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外培養(yǎng)干細(xì)胞；且(c)將祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者，其特征在于祖細(xì)胞分化形成一個(gè)胰島素生產(chǎn)β細(xì)胞。
15.治療糖尿病患者的一個(gè)方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外擴(kuò)展干細(xì)胞以產(chǎn)生祖細(xì)胞；且(c)將祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者，其特征在于祖細(xì)胞分化形成一個(gè)胰島素生產(chǎn)β細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于患者作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
17.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于患者并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
18.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于患者是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其特征在于患者在步驟(b)之前并不為免疫抑制劑處理。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于擴(kuò)展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進(jìn)行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-β，及其結(jié)合體。
21.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求14所述的方法，此外又包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理患者。
23.如權(quán)利要求15所述的方法，此外又包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理患者。
24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)的發(fā)生。
25.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于免疫抑制劑延緩了免疫反應(yīng)的發(fā)生。
26.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
29.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
30.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于免疫抑制劑選自含有下列組份的組FK-506，環(huán)孢霉素，及GAD65抗體。
31.治療糖尿病患者的方法，包含下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)擴(kuò)展干細(xì)胞以產(chǎn)生祖細(xì)胞；(c)在培養(yǎng)基中分化祖細(xì)胞以形成假胰島類似聚合體；且(d)將假胰島類似聚合體轉(zhuǎn)移進(jìn)入患者。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于患者作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于患者并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于患者是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
35.如權(quán)利要求33或34所述的方法，其特征在于患者在步驟(b)之前并不為免疫抑制劑處理。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于擴(kuò)展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進(jìn)行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-β，及其結(jié)合體。
37.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
38.如權(quán)利要求31所述的方法此外還包括步驟(e)使用免疫抑制劑處理患者。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于免疫抑制劑防止免疫反應(yīng)。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于免疫抑制劑延緩了免疫反應(yīng)的發(fā)生。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
42.如權(quán)利要求39，40或41所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
43.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于免疫抑制劑選自含有下列組份的組FK-506，環(huán)孢霉素，及GAD65抗體。
44.從胰島中分離干細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a)從供體中轉(zhuǎn)移出胰島；(b)培養(yǎng)來自胰島的細(xì)胞；且(c)從培養(yǎng)物中挑選nestin陽性克隆。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于培養(yǎng)是首先在一個(gè)伴刀豆球蛋白A包覆的容器中進(jìn)行的，然后再在沒有伴刀豆球蛋白A包覆的容器中進(jìn)行培養(yǎng)。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，此外還包括下列步驟(d)通過使用選自含有EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activinA，TGF-P，及其結(jié)合體的組的試劑進(jìn)行處理擴(kuò)展nestin陽性克隆。
47.一種誘導(dǎo)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分化成為胰腺祖細(xì)胞的方法。包括下列步驟干細(xì)胞使用選自含有下列組分的組的試劑進(jìn)行處理EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結(jié)合體，干細(xì)胞隨后分化為胰腺祖細(xì)胞。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于胰腺祖細(xì)胞隨后形成假胰島類似聚合體。
49.移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法，包括下列步驟(a)從供體胰腺中分離出一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞且(b)將干細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物，其特征在于干細(xì)胞分化形成胰島素產(chǎn)生細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求49所述方法，其特征在于哺乳動(dòng)物作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
51.如權(quán)利要求49所述方法，其特征在于哺乳動(dòng)物并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
52.如權(quán)利要求49所述方法，其特征在于哺乳動(dòng)物是人，而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
53.如權(quán)利要求51或52所述的方法，其特征在于在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
54.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于在轉(zhuǎn)移步驟之前，使用選自含有下列組分的組的試劑體外處理干細(xì)胞EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-P，及其結(jié)合體。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
56.如權(quán)利要求49所述的方法，此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑防止免疫反應(yīng)的發(fā)生。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑延緩了免疫反應(yīng)的發(fā)生。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
60.如權(quán)利要求56，57，58，或59所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
61.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑選自含有FK-506，環(huán)孢霉素，及GAD65抗體的組。
62.移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的一個(gè)方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外培養(yǎng)干細(xì)胞；且(c)將祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物，其特征在于祖細(xì)胞分化形成一個(gè)胰島素生產(chǎn)β細(xì)胞。
63.移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的一個(gè)方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外擴(kuò)展干細(xì)胞以產(chǎn)生祖細(xì)胞；且(c)將祖細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物，其特征在于祖細(xì)胞分化形成一個(gè)胰島素生產(chǎn)β細(xì)胞。
64.如權(quán)利要求62或63所述的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
65.如權(quán)利要求62或63所述的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
66.如權(quán)利要求62或63所述的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
67.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于在步驟(b)之前使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
68.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
69.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于擴(kuò)展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進(jìn)行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-β，及其結(jié)合體。
70.如權(quán)利要求62或63所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
71.如權(quán)利要求62所述的方法此外還包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
72.如權(quán)利要求63所述的方法此外還包括步驟(d)使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
73.如權(quán)利要求71或72所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑防止免疫反應(yīng)的發(fā)生。
74.如權(quán)利要求71或72所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑延緩了免疫反應(yīng)的發(fā)生。
75.如權(quán)利要求71或72所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
76.如權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
77.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
78.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
79.如權(quán)利要求71或72所述的方法，其特征在于免疫抑制劑選自含有FK-506，環(huán)孢霉素，及GAD65抗體的組。
80.移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法，包括步驟(a)從供體胰島中分離出一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)擴(kuò)展干細(xì)胞以生產(chǎn)一個(gè)祖細(xì)胞；(c)在培養(yǎng)基中分化祖細(xì)胞以形成一個(gè)假胰島類似聚合體；且(d)將該假胰島類似聚合體轉(zhuǎn)移進(jìn)入哺乳動(dòng)物。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
82.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
83.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于哺乳動(dòng)物是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
84.如權(quán)利要求82或83所述的方法，其特征在于在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
85.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于擴(kuò)展步驟是在選自含有下列組份的組的情況下進(jìn)行的EGF，bFGF-2，高葡萄糖，KGF，HGF/SF，GLP-1，exendin-4，IDX-1，編碼IDX-1的核酸分子，betacellulin，activin A，TGF-β，及其結(jié)合體。
86.如權(quán)利要求80所述的方法，其特征在于轉(zhuǎn)移步驟是通過內(nèi)向倒退注射法進(jìn)行。
87.如權(quán)利要求80所述的方法此外還包括步驟(e)使用免疫抑制劑處理哺乳動(dòng)物。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)的發(fā)生。
89.如權(quán)利要求87所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑可以延緩免疫反應(yīng)的發(fā)生。
90.如權(quán)利要求87所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑可以降低免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
91.如權(quán)利要求88，89或90所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
92.如權(quán)利要求87所述的方法，其特征在于免疫抑制劑選自含有FK-506，環(huán)孢霉素，及GAD65抗體的組。
93.一個(gè)分離的，非神經(jīng)干細(xì)胞的nestin陽性人類胰腺干細(xì)胞。
94.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其分化形成胰島素生產(chǎn)的β細(xì)胞。
95.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其分化形成胰高血糖素生產(chǎn)的β細(xì)胞。
96.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其分化形成假胰島類似聚合體。
97.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其分化形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
98.權(quán)利要求93的分離干細(xì)胞是免疫優(yōu)勢的。
99.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其并不表達(dá)I型MHC抗原。
100.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其并不表達(dá)II型MHC抗原。
101.如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞其并不表達(dá)I型或II型MHC抗原。
102.鑒別胰腺細(xì)胞是否干細(xì)胞的方法，其包括步驟接觸細(xì)胞以標(biāo)記的nestin特異性抗體，如果細(xì)胞也被抗體標(biāo)記該細(xì)胞也就被鑒別為干細(xì)胞。
103.如權(quán)利要求102所述的方法其進(jìn)一步包括步驟接觸細(xì)胞以標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白19特異性抗體，如果細(xì)胞沒有被抗體標(biāo)記該細(xì)胞也就被鑒別為干細(xì)胞。
104.如權(quán)利要求102或103所述的方法其進(jìn)一步包括步驟接觸細(xì)胞以標(biāo)記的膠原質(zhì)IV特異性抗體，如果細(xì)胞沒有被抗體標(biāo)記該細(xì)胞也就被鑒別為干細(xì)胞。
105.一種誘導(dǎo)nestin陽性胰腺干細(xì)胞分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法，包括下列步驟使用可以誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞或分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞的有效劑量的試劑處理nestin陽性的胰腺干細(xì)胞。
106.如權(quán)利要求105所述的方法，其特征在于試劑是cyclopamine。
107.治療肝病患者的方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；且(b)轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入患者，其特征在于干細(xì)胞分化形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
108.如權(quán)利要求107所述的方法，其特征在于患者作為步驟a所述的干細(xì)胞的供體。
109.治療肝病患者的方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外擴(kuò)展干細(xì)胞以形成祖細(xì)胞；且(c)轉(zhuǎn)移組細(xì)胞進(jìn)入患者，其特征在于祖細(xì)胞分化形成一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
110.如權(quán)利要求109所述的方法，其特征在于患者作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
111.治療肝病患者的一個(gè)方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外分化干細(xì)胞以產(chǎn)生一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；且(c)轉(zhuǎn)移肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入患者。
112.如權(quán)利要求111所述方法，其特征在于患者作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
113.如權(quán)利要求107，109或111所述方法，其特征在于患者并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
114.如權(quán)利要求107，109或111所述方法，其特征在于患者是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
115.如權(quán)利要求113所述的方法，其特征在于患者在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理。
116.如權(quán)利要求114所述的方法，其特征在于患者在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理。
117.如權(quán)利要求113所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理患者。
118.如權(quán)利要求114所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理患者。
119.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)。
120.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑延緩免疫反應(yīng)的發(fā)生。
121.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
122.如權(quán)利要求117所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
123.如權(quán)利要求118所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
124.如權(quán)利要求119所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
125.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
126.如權(quán)利要求121所述的方法，其特征在于所述免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
127.移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的方法，包括下述步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；且(b)轉(zhuǎn)移干細(xì)胞進(jìn)入所述哺乳動(dòng)物，其特征在于干細(xì)胞分化形成一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
128.如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物作為步驟a干細(xì)胞的供體。
129.移植進(jìn)入哺乳動(dòng)物的一個(gè)方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離一個(gè)nestin陽性的胰腺干細(xì)胞；(b)體外擴(kuò)展干細(xì)胞以產(chǎn)生一個(gè)祖細(xì)胞；且(c)轉(zhuǎn)移祖細(xì)胞進(jìn)入所述哺乳動(dòng)物，其特征在于祖細(xì)胞分化形成一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
130.如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
131.移植進(jìn)入一個(gè)哺乳動(dòng)物的方法，包括下列步驟(a)從供體胰島中分離出一個(gè)nestin陽性胰腺干細(xì)胞；(b)體外分化干細(xì)胞以產(chǎn)生一個(gè)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；且(c)轉(zhuǎn)移肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入所述哺乳動(dòng)物。
132.如權(quán)利要求131所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
133.如權(quán)利要求127，129或131所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物并不作為步驟a所述干細(xì)胞的供體。
134.如權(quán)利要求127，129或131所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物是人而步驟a所述干細(xì)胞的供體是非人哺乳動(dòng)物。
135.如權(quán)利要求133所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理。
136.如權(quán)利要求134所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物在步驟(b)之前并不使用免疫抑制劑處理。
137.權(quán)利要求133所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理所述哺乳動(dòng)物。
138.權(quán)利要求134所述的方法此外還包括步驟(c)使用免疫抑制劑處理所述哺乳動(dòng)物。
139.如權(quán)利要求137所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑可以防止免疫反應(yīng)的發(fā)生。
140.如權(quán)利要求137所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑延緩了免疫反應(yīng)的發(fā)生。
141.如權(quán)利要求137所述的方法，其特征在于所述免疫抑制劑降低了免疫反應(yīng)發(fā)生的程度。
142.如權(quán)利要求137所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
143.如權(quán)利要求138所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
144.如權(quán)利要求139所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
145.如權(quán)利要求140所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
146.如權(quán)利要求141所述的方法，其特征在于免疫反應(yīng)是移植排斥反應(yīng)。
147.一個(gè)分離的，非神經(jīng)干細(xì)胞的nestin陽性人類肝臟干細(xì)胞。
148.如權(quán)利要求147所述的分離的干細(xì)胞其是免疫優(yōu)先的。
149.如權(quán)利要求147所述的分離的干細(xì)胞其并不表達(dá)I型MHC抗原。
150.如權(quán)利要求147所述的分離的干細(xì)胞其并不表達(dá)II型MHC抗原。
151.如權(quán)利要求147所述的分離的干細(xì)胞其并不表達(dá)I型或II型MHC抗原。
152.一個(gè)分離的，非神經(jīng)干細(xì)胞的nestin陽性人類干細(xì)胞其可以移植進(jìn)入動(dòng)物而并不導(dǎo)致移植物對(duì)寄主的移植排斥反應(yīng)。
153.如權(quán)利要求152所述的分離的，nestin陽性人類干細(xì)胞其并不是主要組織相容性復(fù)合體I型或II型限制的。
154.含有如權(quán)利要求93所述的分離干細(xì)胞且混和有一個(gè)生理學(xué)上適宜的載體的藥物組合物。
155.含有如權(quán)利要求147所述的分離干細(xì)胞且混和有一個(gè)生理學(xué)上適宜的載體的藥物組合物。
156.含有如權(quán)利要求152所述的分離干細(xì)胞且混和有一個(gè)生理學(xué)上適宜的載體的藥物組合物。
全文摘要
治療I型胰島素依賴型糖尿病及其他使用新辨認(rèn)的能夠分化為不同的胰島細(xì)胞,包括胰島素生產(chǎn)的β細(xì)胞以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞的情況的方法及組合物。Nestin已被鑒別為胰腺干細(xì)胞的一個(gè)分子標(biāo)記,而細(xì)胞角蛋白19作為胰導(dǎo)管細(xì)胞的一個(gè)明確的類的標(biāo)記。本發(fā)明同樣也描述了nestin陽性干細(xì)胞可分離自胰島且培養(yǎng)以獲得干細(xì)胞或假胰島類似結(jié)構(gòu)的方法。同樣也描述了胰腺干細(xì)胞的體外分化的方法。分離,擴(kuò)展及移植胰腺干細(xì)胞進(jìn)入患者以或者同種異體移植,或者同種移植或者異種異體移植以取代丟失或損壞胰島素分泌細(xì)胞或其它細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1423563SQ00816754
公開日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2000年12月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月6日
發(fā)明者伊利莎白·J·亞伯拉罕, 丹尼斯·福斯特曼, 喬·L·哈本娜, 馬里奧·瓦立喬, 亨德里克·祖里烏斯基, 梅利莎·K·托馬斯 申請(qǐng)人:通用醫(yī)療公司