專利名稱：增強細胞粘連特性的方法和組合物的制作方法
優(yōu)先權要求根據35 U.S.C§119(e)，本發(fā)明要求2004年4月29日提交的美國臨時申請?zhí)朜o.60/566,613的權利，其全部內容引入本文作為參考。
政府支持的陳述涉及本發(fā)明的研究由(至少部分由)NIH/NHLBI授予的美國政府資助號No.HL51818支持。政府在本發(fā)明中享有某些權利。
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及在細胞培養(yǎng)環(huán)境中具有增強粘連特性的修飾細胞以及制造和使用這些細胞的方法。
背景技術：
人胚腎(HEK)239細胞是被廣泛用于商業(yè)上和研究中的各種不同細胞的一個例子，主要由于它們易于生長和它們能夠被外源DNA有效轉染的能力。但是，293細胞和各種其它細胞衍生物的一個問題在于它們經常很難粘附到組織培養(yǎng)容器。這使這些細胞的操作困難?？朔@個問題的一個方式是以玻連蛋白或聚賴氨酸涂覆細胞培養(yǎng)容器，其既影響成本又影響處理這樣的細胞培養(yǎng)的簡易性，使這種方法對于大規(guī)模細胞生產是不期望的。
通過提供方法和組合物，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術中之前的缺點，細胞借助它們可以被修飾以在細胞表面上表達整聯(lián)蛋白以增強對細胞培養(yǎng)基質的粘連。
附圖簡要說明

圖1A-F.B-241細胞中人整聯(lián)蛋白cDNAs的細胞表面表達。以不同人整聯(lián)蛋白cDNAs穩(wěn)定轉染的B-241細胞系從組織培養(yǎng)板受胰蛋白酶作用。完整的活細胞以小鼠單克隆抗體染色，所述抗體結合到用于檢測α亞基的熒光素(FITC)或是用于檢測β3亞基的藻紅蛋白(PE)。所用抗體對人β3整聯(lián)蛋白(BD Bioscences，目錄號555754)、人αv整聯(lián)蛋白(Chemicon International，Inc.，目錄號CBL490F)和人血小板糖蛋白(GP)IIb，也稱為整聯(lián)蛋白αIIb整聯(lián)蛋白亞基(ChemiconInternational，Inc.，目錄號CBL589F)是特異性的。板塊(panel)表示不同B-241細胞系衍生物的螢光分布。板塊A未修飾的B-241細胞。板塊B被修飾以表達人血小板GPIIIa，也稱為β3整聯(lián)蛋白亞基的細胞。板塊C被修飾以表達人αIIb整聯(lián)蛋白亞基的細胞。板塊D被修飾以表達αIIbβ3整聯(lián)蛋白受體的細胞，其用于幾種細胞外基質分子，包括血纖蛋白原、von Willebrand因子、纖連蛋白和玻連蛋白。板塊E被修飾以表達αv整聯(lián)蛋白亞基的細胞。板塊F被修飾以表達用于玻連蛋白的αvβ3受體的細胞。
圖2.以人整聯(lián)蛋白轉染后BiG-45包裝細胞增加的粘連。含有馬傳染性貧血癥病毒(EIAV)-綠色熒光蛋白(GFP)載體的BiG-45EIAV包裝細胞被以不同的人整聯(lián)蛋白cDNAs轉染。細胞被接種到常規(guī)組織培養(yǎng)板的孔中。接種后一個小時，在輕微洗滌之前和之后每個孔的GFP熒光被測定以確定粘連到板的細胞百分數(shù)。細胞熒光平板讀數(shù)器(Cytofluor plate reader)被用于測量熒光。
圖3.轉瓶培養(yǎng)的帶有和不帶有人整聯(lián)蛋白cDNAs修飾的EIAV載體產生細胞系。每個瓶用7.75×107個細胞接種。
圖4.質粒pEV53B。
圖5.質粒pESIN6.1CpuroW。
圖6.質粒pCXIP和pCXIH。
圖7.質粒pEV53。
圖8.質粒pEV53A。
圖9.質粒pEC-lacZ。
圖10.質粒pEC-puro。
圖11.質粒pCI-VSV-G。
發(fā)明概述在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種修飾細胞，與未修飾細胞的粘連特性相比，其具有增加到至少三倍(increased at least three fold)的粘連特性，其包括重組核酸或由重組核酸組成或基本由重組核酸組成，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本文還提供的是一種293.01細胞，其包括、由和/或基本由重組核酸組成，所述重組核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本發(fā)明另外提供一種將細胞粘連到培養(yǎng)容器表面的方法，其包括、由或基本由以下組成a)向所述細胞中引入核酸，該核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)、(ii)和(iii)的組合；以及b)在所述細胞可以借以粘連到所述培養(yǎng)容器的表面的條件下，將所述細胞與所述培養(yǎng)容器表面接觸。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種產生修飾細胞的方法，與未修飾細胞的粘連特性相比，所述修飾細胞具有增加到至少三倍的粘連特性，其包括、由或基本由以下組成向所述細胞中引入重組核酸，所述重組核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本文還提供的是一種在培養(yǎng)容器的細胞中產生病毒顆粒的方法，其包括、由或基本由以下組成a)向所述細胞中引入選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)任何(i)、(ii)和(iii)的組合；b)將a)的細胞置于培養(yǎng)所述培養(yǎng)容器中；以及c)在病毒借以被產生的條件下，將感染性病毒顆粒引入b)的培養(yǎng)容器中。
此外，提供在培養(yǎng)容器中的293.101細胞中產生重組慢病毒顆粒的方法，其包括、由或基本由以下組成a)將重組核酸引入293.101細胞中，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)和(ii)和(iii)的組合；b)將(a)的細胞置于培養(yǎng)容器中，以及(c)在(b)的細胞中引入I)第一載體，其包括、由或基本由編碼慢病毒gag和慢病毒pol的慢病毒核酸序列組成，其中所述載體(1)包括在編碼慢病毒結構蛋白的至少一個基因的至少一個缺陷，和(2)包括缺陷包裝信號；II)第二載體，其包括、由或基本由慢病毒核酸序列組成，該序列包括載體基因組反轉錄所需的的順式作用序列元件，其中所述載體(1)包括活性包裝信號，(2)包括異源基因；以及III)第三載體，其包括、由或基本由病毒的核酸序列組成，其中所述第三載體(1)表達病毒包膜蛋白，以及(2)包括缺陷包裝信號，其在重組慢病毒顆粒借以被產生的條件下進行。
本文另外提供的是制造包裝細胞的方法，其包括、由或基本由以載體轉染本發(fā)明的修飾細胞組成，所述載體包括、由或基本由慢病毒核酸序列組成，其中所述載體包括缺陷包裝信號。
在另外的實施方式中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明修飾細胞的包裝細胞，其中所述細胞包括編碼至少一種慢病毒結構蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包裝信號缺陷的，如此該細胞自身產生至少一種慢病毒結構蛋白，但是不產生能夠復制的感染性病毒。
本發(fā)明的不同的其它目的和優(yōu)點從以下的詳細描述中將變得更加清晰。
發(fā)明詳述如本文所使用的，“a”，“an”或“the”可以意味著一個或多于一個。例如，“a”細胞可以意味著單細胞或多細胞。
還如本文使用的，“和/或”涉及并包括一個或更多相關所列項目的任何以及所有可能的組合，以及當在可替換的情形(“或”)中說明時的缺少的組合。
本發(fā)明是基于意料不到的發(fā)現(xiàn)，所述發(fā)現(xiàn)為修飾細胞以表達整聯(lián)蛋白，導致比未修飾細胞更加堅固的粘連到組織培養(yǎng)基的細胞。
因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種被修飾的細胞，其具有的粘連特性與未修飾細胞的粘連特性相比被增加了，其包括重組核酸，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。所述細胞在整聯(lián)蛋白亞基編碼序列借以在細胞中被表達和/或過表達的條件下保持。在一些實施方式中，整聯(lián)蛋白亞基的編碼序列根據現(xiàn)有技術中廣泛熟知的方法在細胞中被瞬時表達以調節(jié)核酸的表達，如此本發(fā)明編碼整聯(lián)蛋白亞基的核酸表達的時序和/或數(shù)量可以被控制。
與未修飾細胞的粘連特性相比，粘連特性的增量可以是至少兩倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、或至少十倍。通過使如本文所描述的被修飾的或未修飾細胞與組織培養(yǎng)基質[例如，塑料(例如，聚丙烯、聚乙稀、聚丙烯酸酯、聚山梨酯等)、玻璃、瓊脂、膠原質、纖連蛋白、陶瓷、金屬、生物降解或非生物可降解的聚酯支架(scafffold)、導管等]接觸一段時間，該時間足以允許細胞粘連到基質(substrate)，并根據本文所描述的方法，以及用于量化細胞的任何已知技術的方法，測定被粘連到基質的細胞數(shù)量，從而測定粘連特性的增加。比未修飾細胞以更大數(shù)量粘連到組織培養(yǎng)基質的被修飾細胞是具有增加的粘連特性的細胞。粘連特性的增加與被粘連細胞的增加數(shù)量相關并可以表達為X倍增量(例如，兩倍、三倍等)、表示為百分比(例如，粘連特性增加10％，其基于與未修飾細胞相比，被修飾細胞粘連到基質的數(shù)目多10％)、和/或根據任何其它已知技術的值，其識別相對于基線測量的增加。
本發(fā)明的細胞可以是任何類型的細胞，其可以在培養(yǎng)條件下生長和/或維持并可以攝取(take up)以及表達編碼整聯(lián)蛋白的重組核酸。例如，本發(fā)明的細胞可以是，但不限于，BiG-45細胞、293.101細胞、B-241細胞、293T細胞、HEK 293細胞、Dami細胞、中國倉鼠卵巢細胞、雜交瘤細胞、HUVEC和MS-5細胞。
本發(fā)明的細胞可以單獨地或以細胞群存在，并且本發(fā)明的細胞可以被包含在組織培養(yǎng)容器中，其可以是，但不限于，燒瓶、瓶子、轉瓶、管形瓶、試管、小室、燒瓶、皿、載玻片、板、組織培養(yǎng)孔、其可以呈現(xiàn)為單獨的孔或多孔板，和/或它們的任何組合。
通過引入編碼整聯(lián)蛋白的重組核酸，本發(fā)明細胞被修飾，所述整聯(lián)蛋白可以是人整聯(lián)蛋白、并可以是但不限于整聯(lián)蛋白β3亞基、整聯(lián)蛋白αv亞基、整聯(lián)蛋白αIIb亞基、和/或這些整聯(lián)蛋白亞基以任何順序的任何組合。本發(fā)明還提供連接到細胞外基質分子的任何整聯(lián)蛋白的組合，所述分子可通過細胞被涂覆或分泌到基質上，細胞在所述基質上生長。一些例子包括，但不限于，膠原質受體α2-β1、層粘連蛋白受體α6-β4、幾種體外結合素受體αV-β5、和β1，其可以與不同的α亞基組合用于諸如纖連蛋白等受體細胞外基質分子。本發(fā)明的整聯(lián)蛋白可以是來自任何物種，如作為實例，諸如雞、狗、大鼠、和小鼠。編碼這些整聯(lián)蛋白的核酸可以在一種或多于一種的核酸構建體上被引入細胞中，該核酸從該構建體被表達以在細胞內產生整聯(lián)蛋白。
如本文所使用的“核酸”涉及單或雙鏈分子，其可以是由核苷酸堿基A、T、C和G組成的DNA，或由堿基A、U(代替T)、C和G組成的RNA。本發(fā)明的核酸可以代表編碼鏈或它的互補鏈。本發(fā)明的核酸可以包括核苷酸序列，其可以與天然產生的序列在序列上相同，或由于核酸密碼的良好表征的簡并性而可以包括可替換的編碼相同氨基酸的密碼子，該氨基酸與見于天然存在的序列中的氨基酸相同。此外，本發(fā)明的核酸可以包括核苷酸序列，其可以包括密碼子，該密碼子代表現(xiàn)有技術中被廣泛熟知的保守的氨基酸替換，如此所得到的多肽的生物活性可以被保留。根據現(xiàn)有技術中廣泛熟知的用于分離核酸的方法，本發(fā)明核酸可以從細胞中被分離?？商鎿Q的，根據在文獻中廣泛描述的用于合成核酸的標準實驗設計，本發(fā)明的核酸可以被合成。對所述發(fā)明的核酸的修飾也可以被預期，前提是由所述核酸編碼的多肽的必要的結構和/或功能(即，生物活性)被保留。
“重組”核酸是使用現(xiàn)有技術中廣泛熟知的基因工程技術制造的一種核酸。
就術語核酸序列的“表達”(及其語法的等同物)來說，它意味著所述序列被轉錄，以及任選的被翻譯。
本發(fā)明的編碼整聯(lián)蛋白的核酸還可以包括指導細胞內整聯(lián)蛋白表達的啟動子。因此，在某些實施方式中，啟動子可被操作的連接到編碼整聯(lián)蛋白的重組核酸。所述啟動子可以是組成型啟動子，導致細胞中整聯(lián)蛋白核酸的組成型表達，或所述啟動子可以是誘導型啟動子，導致細胞中整聯(lián)蛋白核酸僅在激活啟動子的誘導元素存在時表達，從而允許由重組核酸產生的整聯(lián)蛋白被控制。
本發(fā)明啟動子的例子包括，但不限于，CMV立即早期啟動子、勞斯內瘤病毒啟動子、延伸因子1α、β肌動蛋白、真核起始因子4A1、復合CMV增強子/β肌動蛋白啟動子(CAG)、復合延伸因子1α啟動子/HTLV 5′非翻譯區(qū)域、復合SV40增強子/人鐵蛋白重鏈-延伸因子1α啟動子、復合CMV增強子/人鐵蛋白輕鏈延伸因子1α啟動子和復合CMV啟動子/四環(huán)素操縱基因。本發(fā)明的啟動子可以任何組合和/或順序存在于本發(fā)明重組核酸上根據現(xiàn)有技術中廣泛熟知的方法，本發(fā)明的核酸可以被引入細胞中，所述方法包括但不限于轉導(例如，由病毒載體感染)、轉染(電穿孔、脂質轉染、磷酸鈣沉淀、顯微注射等)。
在某些實施方式中，本發(fā)明提供293.01細胞，其包括重組核酸，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)和(b)和(c)的組合。如本文注明的，編碼整聯(lián)蛋白的核酸可以以任何順序和/或組合出現(xiàn)在相同或不同的構建體上，并可以同時的和/或次序的被引入細胞中。核酸可以被同時地和/或以任何順序和/或組合而被表達。
在特別的實施方式中，本發(fā)明提供293.101細胞，其包括編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的重組核酸和編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的重組核酸。這些重組核酸可以出現(xiàn)在相同或不同的構建體上，并可以同時的和/或次序的以任何組合和/或順序被引入細胞中，并可以同時地和/或以任何順序被表達。
本文進一步提供的是用于生產本發(fā)明細胞的不同方法。因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供將細胞粘連到培養(yǎng)容器表面的方法，其包括a)將核酸引入細胞，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)、(ii)和(iii)的組合；以及b)在細胞可以借以粘連到培養(yǎng)容器表面的條件下，使(a)的細胞與培養(yǎng)容器表面接觸。
細胞可以借以粘連到培養(yǎng)器表面的條件在本文中被描述，并對于任何給定的細胞類型是現(xiàn)有技術中廣泛熟知的，其根據被包括在培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基，以及培養(yǎng)容器被維持時所處的環(huán)境(例如，溫度、濕度、二氧化碳含量等)。用于本發(fā)明細胞類型的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件在現(xiàn)有技術中已經被很好的建立。作為一個例子，HEK 293細胞在以下條件的培養(yǎng)中生長和維持在37℃并在5％CO2的保溫箱中，HEK293細胞在含有10％的胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM目錄編號11995-065，Invitrogen Corp)中被培養(yǎng)。當細胞成為90％融合時，它們被傳代以保持在1∶6的稀釋度。
本文另外提供的是生產被修飾細胞的方法，所述細胞具有的粘連特性與未修飾細胞的粘連特性相比增加到至少兩倍、至少三倍、和/或至少四倍，該方法包括將重組核酸引入細胞，所述核酸可以是a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或d)任何(a)、(b)和(c)的組合。
本發(fā)明的細胞在本文中顯示可以更好的經受處理(諸如甘油休克或DMSO休克)，其通常用于瞬時轉染實驗設計以增加核酸攝取。因此，在另一實施方式中，本發(fā)明提供具有增強的攝取核酸能力的本發(fā)明的細胞，并且根據本文描述的實驗設計而進一步提供制造這樣的細胞的方法，以及使用這樣的細胞用于產生病毒顆粒的方法，其具有如本文所描述的修改以提供對用于轉染實驗設計中的處理的增強的耐受能力。
本發(fā)明的細胞可以被用于各種商業(yè)的和研究的應用，包括細胞內不同材料的產生(例如，蛋白質、病毒等)，其產量可以被提高，因為由于提高了粘連特性，在培養(yǎng)容器中可用于生產的細胞的數(shù)量增加。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明提供在培養(yǎng)容器中的細胞中制造病毒顆粒的方法，其包括a)將重組核酸引入細胞，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)任何(i)和(ii)和(iii)的組合；b)將(a)的細胞置于培養(yǎng)容器中，以及(c)在病毒顆粒借以產生的條件下，將感染性的病毒顆粒引入(b)的培養(yǎng)容器中。
本發(fā)明的病毒可以是可在細胞培養(yǎng)中產生的任何病毒，包括但不限于，慢病毒、逆轉錄病毒、副黏病毒、正黏病毒、黃病毒、腺病毒、腺病毒伴隨病毒(AAV)、桿狀病毒、微小核糖核酸病毒、α-病毒、冠狀病毒、皰疹病毒、乳頭狀瘤多型空泡形病毒(papovavirus)、布尼亞病毒、環(huán)狀病毒、痘病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、肝脫氧核糖核酸病毒(hepadnavirus)和纖絲病毒，以及可在細胞中產生的現(xiàn)在已知或之后被鑒定的其它病毒。
在本發(fā)明的某些實施方式中，所述病毒可以是慢病毒，其可以是靈長類慢病毒(例如，HIV-1、HIV-2、SIV)、非靈長類慢病毒(例如，F(xiàn)IV、BLV、EIAV、CEV和綿羊脫髓鞘性腦白質炎病毒(visnavirus))，和/或現(xiàn)在已知或之后被鑒定的任何其它病毒。
此外，本發(fā)明還提供在培養(yǎng)容器中的細胞中產生重組慢病毒顆粒的方法，其包括a)將重組核酸引入細胞，所述核酸可以是i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；和/或iv)(i)和(ii)和(iii)的任何組合；b)將(a)的細胞置于培養(yǎng)容器中，以及(c)在(b)的細胞中引入I)第一載體，其包括編碼一個或更多慢病毒結構蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述載體(1)包括在編碼慢病毒結構蛋白的至少一個基因中的至少一個缺陷，和(2)包括缺陷包裝信號；II)第二載體，其包括慢病毒核酸序列，該序列包括載體基因組反轉錄所需的的順式作用序列元件，其中所述載體包括活性(competent)包裝信號，以及III)第三載體，其包括病毒的核酸序列，其中所述第三載體(1)表達病毒包膜蛋白，以及(2)包括缺陷包裝信號，其在重組慢病毒顆粒被產生的條件下進行。
在某些實施方式中，以上方法的第二載體對于表達至少一種慢病毒結構蛋白(例如，gag、pol或env)可能是有缺陷的。在其它實施方式中，第一載體可以是gag-pol表達載體，其不具有env基因或具有的env基因包括使它不能從第一載體被表達的缺陷。在env基因中的缺陷可以是缺失、替換和/或添加突變，它們使基因不能夠從第一載體被表達。
在其它實施方式中，第一和第二載體可以都缺失env基因或都可以包括env基因，此基因包括可以是缺失、替換和/或添加突變的缺陷，其使所述基因不能從第一載體被表達。
以上所述方法的第三載體可以包括編碼病毒包膜蛋白的核酸，該核酸可以是慢病毒env基因，和/或所述第三載體可包括編碼病毒包膜蛋白的核酸，該包膜蛋白非慢病毒包膜蛋白。例如，由第三載體的核酸編碼的包膜蛋白可以是皰疹性口炎病毒G(VSV-G)糖蛋白。
以上所述方法的第二載體可以包括多克隆位點，異源核酸序列可以被插入其中，和/或一種或更多異源核酸。本發(fā)明的異源核酸可以編碼蛋白質或多肽，當在異源核酸被引入的細胞中產生時，其可以是抗原性的、免疫原性的和/或治療性的。
詞匯“異源核酸”是本領域廣泛熟知的并將被本領域技術人員容易的理解為一種核酸，其在它已經被引入的細胞中通常是不存在的，和/或是在通常不出現(xiàn)在細胞內的調節(jié)元件的控制下被表達的核酸。本發(fā)明的異源核酸還可以是以一定數(shù)量出現(xiàn)或以一定數(shù)量表達的核酸，該數(shù)量通常不同于在此核酸已經被引入的細胞中存在的數(shù)量?！爱愒春怂帷睂⑼ǔＪ羌毎蟹翘烊划a生的序列。可替換的，異源核苷酸序列可以指被置于非天然環(huán)境中的序列(例如，通過與啟動子關聯(lián)，其不是天然關聯(lián)的)。
根據制造核酸序列的標準方法，本發(fā)明的第一載體、第二載體、和第三載體可以被制造以制造載體構建體，以及在某些實施方式中，本發(fā)明的第一、第二和/或第三載體可以來自慢病毒基因組的cDNA克隆。
作為一些例子，本發(fā)明的第一載體可以是質粒pEV53、質粒pEV53A和/或質粒pEV53B；本發(fā)明的第二載體可以是質粒pEC-lacZ、質粒pEC-puro、質粒pESIN6.1GpuroW、質粒pESIN6.1G3W、質粒pE11.1G3W和/或質粒pESIN11.1G3W；以及本發(fā)明的第三載體可以是質粒pCI-VSV-G。
pEV53B類似于pEV 53，除了直到主要剪接供體位點上游3nt的所有EIAV前導序列被移除。為了構建pEV53B，gag基因和部分pol從pEV53由PCR擴增，使用引物5’-TTTGGCGCGCCAGGTAAGATGGGAGACCCTTTGAC-3’(正向)(SEQ ID NO1)和5’-CTACTTGATCCTTCTCCTTGAC-3’(反向)(SEQ ID NO2)。AscI抑制位點(下劃線)被包括在用于克隆目的的正向引物中。用于正向引物中的gag的ATG翻譯起始位點被以粗體指示，以及EIAV序列被顯示為斜體用于正義引物。所得到的1.4kb的PCR產物用AscI和BsrGI消化并克隆到AscI-BsrGI消化的pEV53A中。這樣得到pEV53B。序列分析被用于證實由PCR擴增的gag-pol序列是正確的。
本發(fā)明第二載體的例子是質粒pESIN6.1CpuroW，一種6866bp的質粒，源自表達鏈霉菌Streptomyces alboniger嘌呤霉素報道基因的EIVA。所述質粒含有兩個CMV立即早期增強子/啟動子區(qū)域(位于bp1-734和1863-2384)；來自EIAV長末端重復(LTR)的R-U5序列區(qū)域(bp735-857)；引導序列，其含有EIAV RNA的包裝信號(～bp870-1200)、變異的tat翻譯起始位點(在bp909-911的CTG到TAG)、在bp996-997的剪接供體位點、變異的gag翻譯起始位點(在bp1000-1003的ATG到TAG)、部分的EIAV gag序列(bp1004-1200)；“DNA瓣(flap)”序列，其含有EIVA中心聚嘌呤區(qū)(bp1314-1330)和中心終止信號序列(bp1422-1448)；嘌呤霉素編碼序列(bp2480-3105)；旱獺肝炎病毒轉錄后調節(jié)元件(bp3110-3996)；刪除EIAV增強子/啟動子序列的EIAV自身滅活(SIN)LTR序列(bp4037-4138)；噬菌體f1區(qū)域(bp4280-4735)；氨芐青霉素抗性編碼區(qū)域(bp5174-6034)；以及DAN復制的ColE1起始點(origin)(bp5554-6228)。
第二載體的另一個例子是pE6.1CpuroW，其類似于pESIN6.1CpuroW，除了SIN LTR被野生型EIAV LTR取代。其它的例子包括pESIN6.1CW和pE6.1CW，它們分別類似于pESIN6.1CpuroW和pESIN6.1CpuroW，除了嘌呤霉素抗性基因已經被擴展的多克隆位點取代，以便于感興趣的其它基因或序列的插入。第二載體的進一步的改善是可能的例如，pESIN11.1CW和pE11.1CW是載體的例子，該載體的引導區(qū)域已經被重排列并被優(yōu)化以提供更高的效價。
根據本發(fā)明方法產生的慢病毒顆粒能夠感染細胞并在傳遞異源核酸到靶細胞的過程中進行一輪復制。這種技術的一方面是核酸傳遞系統(tǒng)，其排除病毒基因到靶細胞的傳遞。這通過將編碼病毒結構蛋白的載體與編碼異源核酸的載體物理分隔而實現(xiàn)。分開的載體被引入受納細胞(“包裝細胞”)。病毒結構蛋白對于病毒顆粒產生是必要的，但是編碼這些蛋白的基因出現(xiàn)在包括缺陷包裝信號或沒有包裝信號的載體上，如此以致結構蛋白基因沒有被包裝到在包裝細胞中產生的病毒顆粒中。所得到的慢病毒顆粒是“復制缺陷的”，其中被包裝的載體不含有編碼顆粒組裝所需的所有病毒結構蛋白的核酸。
因此，在另一些實施方式中，本發(fā)明提供制造包裝細胞的方法，其包括以包括慢病毒核酸序列的載體轉染本發(fā)明的修飾細胞，其中所述載體包括缺陷包裝信號。所述載體可以是gag-pol表達載體，并在某些實施方式中，所述載體可以是質粒pEV53B。
本文額外提供的是含有本發(fā)明修飾細胞的包裝細胞，其中所述細胞包括編碼至少一種慢病毒結構蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包裝信號缺陷的，如此所述細胞自身產生至少一種慢病毒結構蛋白，但是不產生能夠復制的感染性病毒。
特別是，關于本發(fā)明的慢病毒載體，在某些實施方式中，所述載體源自EIAV。天然EIAV核酸可以從感染病毒的細胞分離，并從其制備載體。用于制備EIVA載體的示例性的方法在Perry等人的J.Virol.664085-4097(1992)中被提供。例如，使用本領域已知的方法，通過逆轉錄酶，從EIAV RNA可以產生cDNA。那么雙鏈EIAV cDNA可以被制造并克隆到克隆載體中，諸如細菌克隆載體。本領域技術人員已知的和使用的任何克隆載體可以被使用，諸如細菌、酵母或真核載體。在一些實施方式中，本發(fā)明的載體可以包括cDNA分子，其可以包括互補于至少部分EIAV基因組的一個或更多核酸序列，并包括用于基因組復制所需的RNA基因組的一部分，所述cDNA分子被置于在靶細胞中功能性的啟動子的轉錄控制之下。
本發(fā)明的啟動子可以包括真核和/或原核來源的啟動子，足以指導細胞中遠處定位的序列(即，連接到啟動子序列5’末端的序列)的轉錄。啟動子區(qū)域還可以包括用于增強或抑制轉錄的控制元件。適合的啟動子的例子是巨細胞病毒立即早期啟動子(pCMV)，勞斯肉瘤病毒長末端重復啟動子(pRSV)、和SP6、T3、或T7啟動子。啟動子上游的增強子序列或編碼區(qū)域下游的終止子序列可以任選的被包括在本發(fā)明的載體中以便于表達。本發(fā)明的載體還可以含有額外的核酸序列，諸如多腺苷酸化(polyadenylation)序列、定位序列和/或信號序列，足以允許細胞有效率的和有效的表達載體的異源核酸?？赡艿亩嘞佘账峄蛄械睦邮荢V40早期區(qū)多腺苷酸化位點(Hall等人.，J.Molec.App.Genet.2101(1983))和SV40晚期區(qū)多腺苷酸化位點(Garswell and Alwine，Mol.Cell Biol.94248(1989))。這樣的附加序列被插入到載體中，如此如果轉錄是被期望的，它們被可操作的與啟動子序列連接，或者如果翻譯和加工是被期望的，額外的與起始和加工序列連接?？商鎿Q的，被插入的序列可以被置于載體中的任何位置。所述詞匯“可操作的連接”被用于描述在核酸序列和啟動子和/或其它調節(jié)或加工序列之間的連接，如此核酸序列的轉錄由可操作連接的啟動子序列而指導，所述序列的翻譯由可操作連接的翻譯調節(jié)序列指導，以及所述序列的轉錄后加工由可操作連接的加工序列指導。
用于構建本發(fā)明載體的標準技術對于所述領域技術人員是廣泛熟知的，并可以見于這樣的文獻，如Sambrook等人的.，Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NY，1989)。各種策略可用于連接DNA片斷，它的選擇依賴于DNA片斷末端的性質，和哪種選擇可以由技術人員容易的作出。
在本發(fā)明的一個實施方式中，重組慢病毒表達系統(tǒng)包括三種載體。第一載體包括至少部分EIAV基因組的核酸序列，其中載體(i)包含在編碼EIAV結構蛋白的至少一個基因中的至少一個缺陷，以及(ii)包含缺陷包裝信號。第二載體包括至少部分EIAV基因組的核酸序列，其中載體(i)包含活性的包裝信號，以及(ii)包含異源基因可以被插入其中的多克隆位點。第三載體包括病毒核酸序列，其中載體(i)表達病毒包膜蛋白，以及(ii)包含缺陷包裝信號。
在發(fā)明的另一實施方式中，第一載體是gag/pol表達載體。Gag/pol表達載體表達用于從細胞組裝和釋放病毒顆粒所需的EIAV蛋白，并包括編碼病毒多蛋白Gag和Gag-Pol的基因。第一載體還可以表達編碼輔助蛋白Rev和Tat的基因。編碼功能未知的蛋白的開放閱讀框架S2可以額外的被包括在第一載體中。所述第一載體被構建以包含排除逆轉錄病毒介導的病毒基因轉移的突變。這樣的突變可以是病毒env基因中的序列缺失的形式，因此排除產生活性復制的EIAV的可能性，或可以是在基因組3’末端的某些順式作用序列元件的缺失，其為病毒逆轉錄和整合所需。因此，即使來自這種構建體的病毒基因被包裝到病毒顆粒中，它們將不被復制，以及活性復制的野生型病毒將不能產生。
在另一實施方式中，表達系統(tǒng)的第一載體是質粒pEV53bB，其可以是11874bp的質粒和cDNA克隆，其在堿基對209-863含有CMV立即早期增強子/啟動子區(qū)域，它位于EIAV主剪接供體位點(bp915-916)，gag編碼區(qū)域(bp920-2380)，pol編碼區(qū)域(bp2137-5578)和ORF S2編碼區(qū)域(bp5741-5938)的上游。載體還包括部分env編碼區(qū)域(bp5767-7437)和rev編碼區(qū)域(bp5892-5992和6954-7358)。已知的Rev效應元件(Rev Responsive Element)(RRE)被包含在rev的第一編碼區(qū)域(bp5892-5992)。載體不表達功能性tat基因，由于tat的第一外顯子的缺失，但是tat的第二外顯子出現(xiàn)在bp5590-5730。牛生長激素(BGH)的多腺苷酸化信號被提供(bp7463-7677)，還提供了噬菌體f1區(qū)域(bp7741-8154)，SV40早期啟動子區(qū)域和復制起點(bp8218-8543)，新霉素抗性編碼區(qū)域(bp9389-9628)，SV40多腺苷酸化信號(bp9389-9628)，復制的Col E1起始點(bp10060-10733)，以及β-內酰胺酶(氨芐青霉素抗性)的編碼區(qū)域(bp10878-11739)。
本發(fā)明表達系統(tǒng)的第二載體被設計為用于核酸傳遞的載體，并包含支持載體核酸的殼體化和逆轉錄(復制)所需的所有順式作用元件，以及用于插入編碼異源核酸的cDNAs的多克隆位點。在本發(fā)明中，包括異源核酸的載體是重組EIAV衍生載體，其挾帶將被轉導到靶細胞中的遺傳信息，以及對于病毒基因組的包裝和整合必要的順式作用序列元件。第二載體可以包含gag編碼序列的一些部分，由于人們相信gag序列的某些部分在包裝EIAV基因組中起作用。第二載體還可以包含所謂的慢病毒“DNA瓣”區(qū)域，它是來自慢病毒DNA的順式作用序列并含有涉及逆轉錄的中心聚嘌呤區(qū)(tract)(cPPT)和中心終止位點(CTS)序列。此外，第二載體可以包含順式作用元件以促進新合成的RNA從細胞核到細胞質的有效輸出。RNA輸出信號的例子包括同源慢病毒Rev效應元件(RRE)，其與Rev一起工作，以及異源的土撥鼠肝炎病毒轉錄后調節(jié)元件(WPRE)，其還可以通過RNA穩(wěn)定作用或其它方法增加基因表達。此外，被包含在LTR的中5’剪接供體位點可以含有增加所產生病毒的效價的突變，如在例如，Tan等人.，J.Virol.703645-3658(1996)所描述的。
本發(fā)明第二載體的例子是質粒pESIN6.1CpuroW，一種6866bp的質粒，源自表達鏈霉菌Streptomyces alboniger嘌呤霉素報道基因的EIVA。所述質粒含有兩個CMV立即早期增強子啟動子區(qū)域(位于bp1-734和1863-2384)；來自EIAV長末端重復(LTR)的R-U5序列區(qū)域(bp735-857)；引導序列，其含有EIAV RNA的殼體化信號(～bp870-1200)、變異的tat翻譯起始位點(在bp909-911的CTG到TAG)、在bp996-997的剪接供體位點、變異的gag翻譯起始位點(在bp1000-1003的ATG到TAG)、部分的EIAV gag序列(bp1004-1200)；“DNA瓣”序列，其含有EIVA中心聚嘌呤區(qū)(cPPT，bp1314-1330)和中心終止位點(CTS)序列(bp1422-1448)；病毒剪接受體序列(bp1753-1754)；Rev效應元件(RRE，bp1755-1857)；嘌呤霉素編碼序列(bp2480-3105)；旱獺肝炎病毒轉錄后調節(jié)元件(bp3110-3996)；刪除EIAV增強子/啟動子序列的EIAV自身滅活(SIN)LTR序列(bp4037-4138)；噬菌體f1區(qū)域(bp4280-4735)；氨芐青霉素抗性編碼區(qū)域(bp5174-6034)；以及復制的ColE1起始點(bp5554-6228)。
本領域技術人員將認識到的是，異源核酸的核苷酸序列可以是任何核苷酸序列。例如，異源核酸可以是報道基因序列或可選擇的標記基因序列。如本文使用的報道基因序列是任何基因序列，當其被表達的時候，導致其存在或活性可以被檢測的蛋白質的產生。適合的報道基因的例子包括半乳糖激酶，β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、β-內酰胺酶等的基因?？商鎿Q的，報道基因序列可以是任何基因序列，它的表達產生以某種可檢測的方式影響細胞生理學的基因產物。
可選擇的標記基因序列是能夠被表達以產生蛋白質的任何基因序列。它的存在允許人們選擇性的繁殖包含它的細胞?？蛇x擇的標記基因的例子包括能夠給予宿主抗生素抗性(例如，嘌呤霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素等)、能夠給予宿主對氨基酸類似物的抗性、和/或允許細菌在額外的碳源上或在本來不允許的培養(yǎng)條件下生長的基因序列。基因序列既可以是報道基因，也可以是可選擇的標記基因序列。本發(fā)明報道基因的例子是lacZ基因，其編碼E.Coli的β-半乳糖苷酶活性，以及編碼嘌呤霉素抗性的基因。
本發(fā)明的報道基因或可選擇的標記基因序列是那些足以允許普通細胞中載體的識別或選擇的基因序列。在發(fā)明的一個實施方式中，報道基因序列將編碼酶或其它蛋白質，其通常不出現(xiàn)在哺乳動物細胞中，并且它的存在可以因此確定的證實在這樣的細胞中的所述載體的存在。
本發(fā)明的異源核酸還可以包括所需產物的編碼序列，所述產物諸如適合的生物活性蛋白或多肽，免疫原性的或抗原性的蛋白或多肽，或治療活性蛋白或多肽。可替換的，異源核酸可以包括互補于RNA序列的序列，諸如反義RNA序列，該反義序列可以對受試者給藥以抑制在受試者細胞中的互補多聚核苷酸的表達。
異源核酸的表達可以提供免疫原的和/或抗原的蛋白和/或多肽以獲得免疫反應，其可以包括抗體反應。這樣的抗體可以在疫苗接種中有效賦予患者治療效果和/或所述抗體可從諸如血液、血清或腹水等動物體液中被收集。
在本發(fā)明的另一實施方式中，第三載體包括編碼病毒包膜蛋白的核酸。這樣的載體將相應的包括編碼在適合的啟動子控制之下的病毒蛋白的核酸序列。病毒包膜蛋白可以是慢病毒包膜蛋白。但是，可能的是改變本發(fā)明的病毒載體可以感染的細胞的宿主范圍，通過利用來自另一病毒的包膜蛋白基因來進行。換而言之，可能的是擴展本發(fā)明EIAV載體的宿主范圍，通過利用某些病毒的包膜蛋白的能力以參與其它病毒的殼體化(encapsidation)。水泡性口膜炎病毒的G-蛋白(VSV-G；見Rose和Gillione，J.Virol.39519-528(1981)；Rose andBergmann，Cell 30753-762(1982))有效的形成帶有其它病毒的基因組和基質成分的假型病毒體。這些VSV-G假型載體具有非常寬的宿主范圍并可以通過超速離心法被濃縮到高的效價。如本文所使用的，詞匯“假型”是指病毒顆粒，其含有一個病毒的核酸以及另一個病毒的包膜蛋白。
本發(fā)明第三載體的例子是質粒和cDNA克隆pCI-VSV-G，一種用于包膜糖蛋白VSV-G的表達載體。所述質粒含有5679個堿基對并包括CMV立即早期增強子啟動子區(qū)域(bp1-795)、嵌合內含子區(qū)域(bp857-989)，VSV-G編碼區(qū)域(bp1088-2633)、噬菌體f1區(qū)域(3093-3548)、SV40晚期多腺苷酸化信號(bp2782-3003)，DNA復制的ColE1起始點(bp4992-5666)和氨芐青霉素抗性編碼區(qū)域(bp3987-4847)。
在本發(fā)明的方法中，感染性的、復制缺陷的EIAV顆粒可根據本文所公開的方法結合本領域技術人員已知技術而制備。所述方法包括以本發(fā)明載體轉染慢病毒受納細胞；被轉染細胞中產生EIAV衍生的顆粒；并從細胞收集病毒顆粒?？筛鶕绢I域技術人員已知的任何適合的方法來實施轉染慢病毒受納細胞的步驟。例如，在本發(fā)明的方法中，本文所述的三質粒表達系統(tǒng)被用于通過瞬時轉染產生EIAV衍生的逆轉錄病毒載體顆粒。作為另一個例子，載體攝取到細胞中可以通過任何適合的方法而實現(xiàn)，諸如，例如，以DEAE-葡聚糖處理細胞、添加到細胞之前以LIPOFECTIN處理載體-衍生的DNA或RNA，或通過電穿孔法。這些技術在現(xiàn)有領域中是已知的。
促進細胞中感染性病毒顆粒產生的步驟使用常規(guī)技術實施，諸如通過在現(xiàn)有技術中廣泛熟知的標準細胞培養(yǎng)生長技術。
收集感染性病毒顆粒的步驟也可以使用常規(guī)技術實施。例如，感染性病毒顆?？梢酝ㄟ^細胞溶解而被收集，或收集細胞培養(yǎng)上清液，如在現(xiàn)有技術中已知的?？蛇x的，如果需要，收集的病毒顆?？梢员患兓＿m合的純化技術對本領域技術人員是廣泛熟知的。
如果技術人員需要，慢病毒母液(stock solution)可以使用本發(fā)明的載體和方法被制備。制備病毒母液的方法在技術領域中是已知的，并通過例如，Soneoka等人.，Nucl.Acid Res.23628-633(1995)和Landau等人.，J.Virol.665110-5113(1992)而被說明。在本發(fā)明產生母液的方法中，本發(fā)明的慢病毒受納細胞用本發(fā)明的載體轉染。于是，細胞在適合的細胞培養(yǎng)條件下生長，且慢病毒顆?；蚴菑募毎旧砘蚴菑募毎囵B(yǎng)基中被收集，如以上所描述的。
本發(fā)明的載體還用于制備包裝細胞(即，表達EIAV病毒蛋白的細胞，該細胞不能由自身產生感染性病毒顆粒)。制備表達逆轉錄病毒蛋白的包裝細胞的方法在技術領域中是已知的并通過例如Temin等人的美國專利No.4,650,764中所闡述的方法而被舉例說明，以其整體引入本文以便于參考對于這些方法的教導。本發(fā)明的包裝細胞可以包括本發(fā)明的慢病毒受納細胞，包括編碼至少一種EIVA結構蛋白的EIAV核酸，該核酸是包裝信號缺陷的，因此使細胞自身能夠產生至少一種EIAV結構蛋白，但是不能夠產生復制活性的感染性病毒。那么，包裝細胞可以具有被引入的其它核酸序列(例如，pSIN61.CpuroW和/或pCI-VSV-G)，其可以包含異源核酸和適合的包裝信號。一旦以附加序列轉染，包裝細胞就被用于產生EIAV病毒的母液，所述EIAV病毒包含異源核酸，但是該病毒是不能自身復制的。
本發(fā)明在以下實施例中被更加詳細的描述，其僅作為說明，因為本文的許多改變和變體對于本領域技術人員將是顯而易見的。
實施例實施例1細胞HEK 293細胞來自美國典型培養(yǎng)物收藏所(American Type CultureCollection(ATCC))。這些細胞的克隆基因庫通過限制稀釋而被制備，并且被篩選以得到對產生逆轉錄病毒和慢病毒載體顯示最大能力的細胞系(Johnson等人.″Effect of host modification and age on airwayepithelial gene transfer mediated by a murine leukemia virus-derivedvector″J.Virol.728861-72(1998))。這些克隆之一，293.101，被選擇用于構建EIAV輔助細胞系和EIAV載體包裝細胞。B-241細胞系是EIAV載體輔助細胞系。這些細胞通過以表達載體(EV53B)穩(wěn)定轉染而由293.101細胞獲得，該表達載體由CMV啟動子表達EIAV gag，pol，S2，以及rev基因。Big-45細胞系是EIAV包裝細胞系。這些細胞通過以質粒表達載體穩(wěn)定轉染而得自B-241細胞，該表達載體編碼四環(huán)素可調節(jié)的VSV-G包膜cDNA和CMV啟動子驅動的四環(huán)素抑制物基因。BiG-45/8Z-20細胞來自以pONY8Z穩(wěn)定轉染的BiG-45細胞，該pONY8Z是編碼細菌lacZ報道基因的一種EIAV基因傳遞載體(Rohll等人.″Design，production，safety，evaluation，and clinicalapplications of nonprimate lentiviral vectors″Methods Enzymol346466-500(2002))。
整聯(lián)蛋白表達質粒pCXIH表達載體被用于表達人αIIb或αv整聯(lián)蛋白亞基。pCXIP表達載體被用于表達野生型或突變的人β3整聯(lián)蛋白亞基。這些載體使用CMV啟動子以驅動被插入的cDNA的表達，并包含連接到或潮霉素抗性基因(pCXIH)或嘌呤霉素抗性基因(pCXIP)的IRES序列，其用于動物細胞中的選擇。
pCXIP質粒是5562bp長度并是設計為表達靶基因以及嘌呤霉素可選標記的雙順反子(bicistronic)表達載體。這種載體包括CMV立即早期增強子/啟動子區(qū)域(bp1-532)、用于插入將被表達的序列的多克隆位點區(qū)域(bp639-687)、內部核糖體進入位點序列(bp689-1261)、嘌呤霉素抗性基因(bp1298-1894)、來自鼠白血病病毒的poly A添加信號(bp2268-2693)、DNA復制的SV40起始點(bp2973-3259)、DNA復制區(qū)域的Col E1起始點(bp3580-4200)，和氨芐青霉素抗性基因(bp4340-5200)。
pCXIH質粒是6161bp長度并是設計為表達靶基因以及潮霉素可選標記的雙順反子(bicistronic)表達載體。這種載體包括CMV立即早期增強子/啟動子區(qū)域(bp1-532)、用于插入將被表達的序列的多克隆位點區(qū)域(bp640-680)、內部核糖體進入位點序列(bp689-1263)、潮霉素抗性基因(bp1287-2321)、來自鼠白血病病毒的poly A添加信號(bp2867-3292)、DNA復制的SV40起始點(bp3572-3858)、DNA復制區(qū)域的Col E1起始點(bp4179-4799)，和氨芐青霉素抗性基因(bp4939-5799)。
對于在BiG-45細胞中表達αv和β3兩個整聯(lián)蛋白亞基，pVITRO2-mcs表達載體(InvivoGen，San Diego)被使用。這種載體使用復合人鐵蛋白重鏈起動子/SV40增強子序列以驅動人αv整聯(lián)蛋白的表達，以及復合人鐵蛋白輕鏈啟動子/CMV增強子序列以驅動人β3整聯(lián)蛋白的表達。
基于293的EIAV產生細胞中整聯(lián)蛋白亞基的表達編碼αIIb、αv和β3亞基的整聯(lián)蛋白cDNAs被亞克隆到表達載體中，其中使用的CMV啟動子，不同組合被穩(wěn)定轉染到B-241 EIAV輔助細胞系中以產生一系列細胞系。藥物選擇12天之后，來自每次轉染的細胞菌落被混合并被分析各整聯(lián)蛋白亞基αIIb、αv和β3的細胞表面表達，或作為整聯(lián)蛋白受體αIIbβ3、αvβ3，通過由流式細胞計量法的活細胞免疫熒光法分析(圖1)。人們發(fā)現(xiàn)每個整聯(lián)蛋白都在B-241細胞的細胞表面被表達。與表達單獨的亞基相比，α和β亞基二者的表達共同增強它們在細胞表面的總表達。免疫熒光研究確認每個整聯(lián)蛋白的表達相對于內源整聯(lián)蛋白的表達大大增強了。
整聯(lián)蛋白修飾的293細胞連接到組織培養(yǎng)基質細胞連接試驗被用于測試β3整聯(lián)蛋白亞基單獨或與它的αIIb或αv結合配偶體一起表達是否將導致對組織培養(yǎng)基質的增加的粘連。該試驗涉及在基于293的BiG-45 EIAV包裝細胞中瞬時表達整聯(lián)蛋白亞基，所述包裝細胞表達綠色熒光蛋白。所述細胞在12孔板中每個孔被鋪板3×105個細胞。鋪板后1h通過測量在洗滌細胞之前和之后的細胞熒光，確定細胞的鋪板效率。與未修飾細胞相比，β3整聯(lián)蛋白亞基的過表達單獨導致293細胞對未處理組織培養(yǎng)板的粘連顯著增加(圖2)。αv的共表達進一步的增加293細胞的粘連。β3亞基的突變型也被測試，當與血小板上αIIb結合的時候，其引起αIIbβ3受體被永久激活。與野生型β3亞基相比較，單獨的或結合αIIb或αv的突變β3亞基不提供任何細胞粘連的增加(圖2)。因此，在293衍生的細胞中野生型人αvβ3整聯(lián)蛋白受體的表達顯著增加了它們連接到常規(guī)組織培養(yǎng)板的能力。
整聯(lián)蛋白修飾對293細胞的轉瓶培養(yǎng)的影響為了減少產生慢病毒載體所需的時間和努力，整聯(lián)蛋白-修飾細胞在轉瓶培養(yǎng)中的連接和生長的能力被研究。在初期試驗中，整聯(lián)蛋白β3修飾的B-241細胞或未修飾的B-241細胞被接種到轉瓶中。第二天，細胞以結晶紫染色并拍照(圖3)。β3修飾細胞粘連顯著優(yōu)于未修飾的細胞，即使一些細胞凝集是明顯的。為了測試β3與它的αv結合配偶體一起表達的效果，產生EIAV-lacZ載體(BiG-45/8Z-20)的BiG-45包裝細胞用表達兩種整聯(lián)蛋白的pVITRO2mcs載體穩(wěn)定轉染，并被接種到轉瓶中。接種后一天，細胞被染色用于表達帶有X-GaI的lazZ基因。如圖3示出的，與單獨以β3修飾的細胞相比，細胞顯示更加均一的連接而細胞凝集更少。在之后的試驗中，接種到轉瓶中之后24h，整聯(lián)蛋白修飾的和未修飾的B-241細胞的鋪板效率被測定。對于β3和αvβ3二者修飾的B-241細胞，鋪板效率是98.3％±1.5％(n＝6)。與此相反，對于未修飾的B-241細胞，鋪板效率僅是45.7％±15.3％(n＝3)。
整聯(lián)蛋白表達對慢病毒載體生成的影響α在使用磷酸鈣介導的轉染的瞬時載體產生系統(tǒng)中，通過將編碼嘌呤霉素基因的EIAV載體(ESIN6.1CpuroW)以及編碼VSV-G包膜的載體共轉染到B-241輔助細胞系中，對整聯(lián)蛋白表達對慢病毒載體生成的影響進行測定。人們發(fā)現(xiàn)單獨的αIIb或αv整聯(lián)蛋白亞基表達對載體效價不具有影響(表1)。αIIb和β3的共表達一致地導致載體效價4-5倍的減少。相反，β3的單獨表達或與αv整聯(lián)蛋白的組合的表達導致載體的產生增加30-60％。
用αvβ3整聯(lián)蛋白對B-241細胞，或其它基于293的細胞系的修飾，導致細胞變平，如此整聯(lián)蛋白修飾的細胞比未修飾細胞占據更大的表面積。由于優(yōu)化的轉染試驗設計通常使用80-90％融合的培養(yǎng)物，這導致比未修飾細胞更少數(shù)量的整聯(lián)蛋白-修飾細胞用于轉染試驗。為了進一步表征從整聯(lián)蛋白-修飾細胞產生EIAV載體，每個細胞的感染性載體的產量被測定并與未修飾細胞比較。此外，用于增加DNA攝取效率的試劑(丙三醇或DMSO)的效果被測定(Lopata等人。1984.″High level transient expression of a chloramphenicol acetyltransferase gene by DEAE-dextran mediated DNA transfectioncoupled with a dimethyl sulfoxide or glycerol shock treatment″NucleicAcids Res 125707-17)。如表2示出的，使用以αvβ3整聯(lián)蛋白修飾的細胞，每個細胞產生的載體產量增加3.6倍。此外，在整聯(lián)蛋白-修飾細胞中的載體產量可以進一步增加近似3倍，其通過結合丙三醇或DMSO休克處理到試驗設計中以增強DNA攝取(表2)。相反，從未修飾培養(yǎng)物的載體產生沒有通過以丙三醇或DMSO的處理而被增強。部分的，這被歸因于由于未修飾培養(yǎng)物的低粘連性的細胞損失。丙三醇或DMSO處理的期間減少到30秒，導致未修飾培養(yǎng)物的細胞損失減少，但是載體產量沒有被增加。
實施例2HEK 293細胞整聯(lián)蛋白表達分布的改變允許慢病毒載體的方便的大規(guī)模轉瓶生產使用轉瓶的基于EIAV和HIV的慢病毒載體生產使用整聯(lián)蛋白-修飾的293細胞的轉瓶培養(yǎng)而可以實現(xiàn)大規(guī)模高效價的載體生產的可能性被研究。在這些研究中，不同的方法被測試用于使用轉瓶產生慢病毒載體。一些實施例在表3中示出。在一個實施例中，αvβ3修飾的B-241輔助細胞的轉瓶培養(yǎng)物，該輔助細胞穩(wěn)定表達EIAV gag-pol基因，被編碼嘌呤霉素抗性基因和VSV-G包膜基因的EIAV載體(ESIN6.1CpuroW)共轉染。1000倍濃縮之后，以1.2×109感染單位/ml的效價制備的載體被獲得。這個水平的載體生產與在組織培養(yǎng)板中生長的未修飾細胞產生的載體產生水平相比較是有利的(表1)。
在第二實施例中，以EIAV lacZ基因穩(wěn)定轉染的BiG-45 EIAV包裝細胞系被誘導以產生濃縮后具有2×109效價的病毒。第三實施例顯示了該過程可以被擴大以產生適用于動物研究的數(shù)量的載體。在這種情況下，目標是產生用于離體基因轉移到犬造血干細胞所需的載體數(shù)量(＞3×109總感染單位)。含有αvβ3修飾的293T細胞的12轉瓶的三日質粒轉染被執(zhí)行以產生HIV-1載體。載體(90ml/轉瓶)在從轉染后48h開始的連續(xù)三天中被收集?？偣?240ml被收集并被濃縮近似550倍至6ml?？偖a量是1.4×1010感染載體顆粒，多于實施動物研究所需的量。
人胚腎細胞(HEK 293)是最廣泛使用的用于產生病毒基因轉移載體的細胞類型。他們用編碼病毒蛋白的質粒DNAs是高度可轉染的，使用許多轉染試劑和試驗設計以瞬時表達重組病毒。許多穩(wěn)定的基于293的包裝細胞系還已經產生用于病毒生產。根據非靈長類慢病毒馬傳染性貧血病毒(EIAV)的基因轉移系統(tǒng)已經被開發(fā)，其利用穩(wěn)定的基于293細胞的可誘導包裝細胞系(BiG-45)用于高效價病毒生產。使用293細胞的載體的大規(guī)模生產通常是困難的，由于它們易于從規(guī)則的組織培養(yǎng)板分離。通過使細胞在懸浮培養(yǎng)中生長，這個問題可以被克服，但是這可以導致病毒效價的顯著損失。可替換的，培養(yǎng)物可以在容器中生長，所述容器以諸如纖維結合蛋白或聚賴氨酸等細胞連接基質處理。但是，兩個策略顯著增加大規(guī)模載體生產的費用。
在這個研究中，通過修飾它們的整聯(lián)蛋白表達分布而增加293細胞的粘連特性的新策略被測試。首先被測試的是整聯(lián)蛋白β3亞基單獨或與它的已知結合配偶體αv或αIIb組合的過度表達的影響。所述細胞粘連試驗涉及在基于293的EIAV包裝細胞中瞬時表達整聯(lián)蛋白亞基，所述包裝細胞表達綠色熒光蛋白。所述細胞以2-4×105個細胞/孔的密度被板在未經處理的多孔板上。鋪板后1h通過測量洗滌細胞之前和之后的細胞熒光，所述細胞的鋪板效率被測定。被觀察到的是，與未修飾細胞相比，在293細胞中的β3整聯(lián)蛋白亞基的過度表達導致對未經處理組織培養(yǎng)板的細胞粘連的顯著增加。αv但不是αIIb的共表達進一步增加293細胞粘連。來自整聯(lián)蛋白-修飾的293細胞的基于HIV和EIAV二者的慢病毒載體的產生也被研究。作為這種修飾的結果，在靶細胞中的載體效價和報道基因表達不被損害，并且這導致在轉瓶中載體產生的擴大，其用于產生用于體內試驗中的載體。
總而言之，293細胞中的αv和β3的過度表達增加了對規(guī)則的未經處理的組織培養(yǎng)皿的粘連，并不危害病毒載體產生。
前述僅看作發(fā)明原理的說明。此外，由于本領域技術人員易于想到許多修改和變化，將發(fā)明限制到本文示出和描述的精確的構造和操作不是被期望的。因此，相應的所有適合的修改和等同物落入本發(fā)明的范圍內。
本文所引用的所有公開出版物、專利申請、專利和其它文獻被以其整體引入本文，以參考與該引用所出現(xiàn)的句子和/或段落相關的教導。

1B-241細胞以含有指明的人整聯(lián)蛋白cDNAs的表達載體修飾。
2細胞以編碼嘌呤霉素抗性的EIAV載體質粒和VSV-G包膜表達載體共轉染。轉染后48h所產生病毒的效價被給出為每毫升未濃縮組織培養(yǎng)上清液的抗嘌呤霉素的菌落。
3相對于未修飾細胞的效價。

1B-241細胞用編碼αvβ3人整聯(lián)蛋白cDNAs的表達載體修飾。
2未修飾的細胞(1×106/6-孔板的35-mm孔)或αvβ3整聯(lián)蛋白修飾細胞(4.5×105/6-孔板的35-mm孔)以80％融合鋪板，并且用編碼嘌呤霉素抗性的EIAV載體質粒和VSV-G包膜表達載體共轉染。轉染后48h產生的載體總產量(在2ml組織培養(yǎng)上清液中)被給出為每細胞載體的抗嘌呤霉素的菌落(感染單位)。結果代表兩個獨立實驗的平均值。
3加入CaPO4-DNA轉染混合物后4小時，培養(yǎng)基被去除，并且培養(yǎng)物以5ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌一次。所述細胞在室溫下以15％(v/v)的丙三醇在HEPES-緩沖鹽水(50mM HEPES(pH7.1)，280mMNaCl和1.5mM Na2HPO4)中處理2分鐘。丙三醇溶液被除去，并且培養(yǎng)物以PBS洗滌一次。常規(guī)生長培養(yǎng)基被加入，并且所述細胞被送回到37℃保溫箱。
4加入CaPO4-DNA轉染混合物后4小時，培養(yǎng)基被除去，并且培養(yǎng)物以5ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌一次。所述細胞在室溫下以PBS中的10％(v/v)的DMSO處理2.5分鐘。DMSO溶液被除去并且培養(yǎng)物以PBS洗滌兩次。常規(guī)生長培養(yǎng)基被加入并且所述細胞被送回到37℃保溫箱。

1在2-質粒和3-轉染后，在轉染的B-241細胞和293T細胞中載體分別被產生。來自BiG-45/8Z-20細胞的載體產生，其挾帶整合的EIAV lacZ基因轉移載體，通過以10mM丁酸鈉和1.5μg/ml脫氧土霉素處理而被誘導。
2病毒載體以高速離心分離法而被濃縮以使編碼嘌呤霉素抗性的病毒(100,000×g-小時，在4℃)EIAV載體質粒和VSV-G包膜表達載體成球狀。轉染后48小時產生的病毒的效價被給出為每毫升組織培養(yǎng)上清液的抗嘌呤霉素菌落。
3載體轉導單位/ml。
序列表<110>University of North Carolina at Chapel Hill<120>增強細胞粘連特性的方法和組合物<130>5470-412WO<150>US60/566,613<151>2004-04-29<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>1tttggcgcgc caggtaagat gggagaccct ttgac35<210>2<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2ctacttgatc cttctccttg ac 2權利要求
1.一種修飾細胞，與未修飾細胞的粘連特性相比，其具有增加到至少三倍的粘連特性，其包括選自由以下組成的組的重組核酸a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何組合。
2.一種293.01細胞，其包括選自由以下組成的組的重組核酸a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何組合。
3.一種293.101細胞，其包括編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的重組核酸和編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的重組核酸。
4.一種細胞群體，包括權利要求1、2或3所述的細胞。
5.一種培養(yǎng)容器，其包括權利要求4的所述群體。
6.如權利要求5所述的培養(yǎng)容器，其中所述容器選自由燒瓶、瓶子、轉瓶、皿、載玻片、試管、蓋玻片、板及其任何組合所組成的組。
7.如權利要求2所述的細胞，其中所述細胞選自由BiG-45細胞、293.101細胞、B-241細胞、293T細胞、HEK293細胞、Dami細胞、中國倉鼠卵巢細胞、雜交瘤細胞、HUVEC細胞、和MS-5細胞所組成的組。
8.如權利要求1、2或3所述的細胞，還包括可操作連接到所述重組核酸的啟動子，其中所述啟動子選自由以下組成的組CMV立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、延伸因子1α、β-肌動蛋白、真核起始因子4A1、復合CMV增強子/β-肌動蛋白啟動子(CAG)、復合延伸因子1α啟動子/HTLV5′非翻譯區(qū)域、復合SV40增強子/人鐵蛋白重鏈-延伸因子1α啟動子、復合CMV增強子/人鐵蛋白輕鏈延伸因子1α啟動子以及復合CMV啟動子/四環(huán)素操縱基因。
9.一種將細胞粘連到培養(yǎng)容器表面的方法，包括在所述細胞可以借以粘連到所述培養(yǎng)容器的所述表面的條件下，將所述細胞與所述培養(yǎng)容器的所述表面接觸，其中所述細胞包括選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何組合。
10.一種產生被修飾細胞的方法，所述被修飾細胞具有的粘連特性與未修飾細胞的所述粘連特性相比增加到至少三倍，所述方法包括向所述細胞中引入選自由以下組成的組的重組核酸a)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；b)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；c)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及d)(a)、(b)和(c)的任何組合。
11.一種在培養(yǎng)容器中的細胞中產生病毒顆粒的方法，包括在病毒顆粒借以被產生的條件下，向所述培養(yǎng)容器的細胞中引入感染性病毒顆粒，其中所述細胞包括選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何組合。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述病毒顆粒是選自由以下組成的組的病毒的顆粒慢病毒、逆轉錄病毒、副黏病毒、正黏病毒、黃病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、桿狀病毒、微小核糖核酸病毒、α病毒、冠狀病毒、皰疹病毒、乳頭狀瘤多型空泡形病毒和纖絲病毒。
13.如權利要求9、10或11所述的方法，其中所述細胞選自由BiG-45細胞、293.101細胞、B-241細胞、293T細胞、HEK293細胞、Dami細胞、中國倉鼠卵巢細胞、雜交瘤細胞、HUVEC細胞、和MS-5細胞所組成的組。
14.如權利要求9或11所述的方法，其中所述容器選自由燒瓶、瓶子、轉瓶、皿、載玻片、試管、蓋玻片、板及其任何組合所組成的組。
15.一種在培養(yǎng)容器的細胞中產生重組慢病毒顆粒的方法，包括在重組病毒顆粒借以被產生的條件下，向所述培養(yǎng)容器的所述細胞中引入，其中所述細胞包括選自由以下組成的組的重組核酸i)編碼整聯(lián)蛋白β3亞基的核酸；ii)編碼整聯(lián)蛋白αv亞基的核酸；iii)編碼整聯(lián)蛋白αIIb亞基的核酸；及iv)(i)、(ii)和(iii)的任何組合，I)第一載體，包括編碼至少一種慢病毒結構蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述載體(1)包括在編碼慢病毒結構蛋白的至少一個基因中的至少一個缺陷，以及(2)包括缺陷包裝信號；II)第二載體，包括慢病毒核酸序列，所述序列包括所述載體基因組逆轉錄所需的順式作用序列元件，其中所述載體包括活性包裝信號，以及III)第三載體，包括病毒核酸序列，其中所述第三載體(1)表達病毒包膜蛋白；以及(2)包括缺陷包裝信號。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述第二載體對于表達至少一種慢病毒結構蛋白是缺陷的。
17.如權利要求15所述的方法，其中所述細胞是293.101細胞。
18.如權利要求15所述的方法，其中所述第一載體是gag-pol表達載體，以及其中所述載體包括env基因中的缺陷。
19.如權利要求18所述的方法，其中在所述env基因中的所述缺陷是缺失突變。
20.如權利要求15所述的方法，其中所述第一載體和所述第二載體各包括在env基因中的缺陷。
21.如權利要求15所述的方法，其中所述第三載體編碼病毒包膜蛋白，其不是慢病毒包膜蛋白。
22.如權利要求21訴述的方法，其中所述第三載體編碼水泡性口膜炎病毒G糖蛋白。
23.如權利要求15所述的方法，其中所述第二載體包括異源核酸。
24.如權利要求15所述的方法，其中所述慢病毒是非靈長類慢病毒。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述非靈長類慢病毒是馬傳染性貧血病毒(EIAV)。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述第一載體是質粒pEV53B；所述第二載體是質粒pESIN6.lCpuroW，以及所述第三載體是質粒pCl-VSV-G。
27.如權利要求15所述的方法，其中所述容器選自由燒瓶、瓶子、轉瓶、皿、載玻片、試管、蓋玻片、板及其任何組合所組成的組.
28.一種制造包裝細胞的方法，包括以包括慢病毒核酸序列的載體轉染權利要求1、2或3所述的細胞，其中所述載體包括缺陷包裝信號。
29.如權利要求28所述的方法，其中所述載體是gag-pol表達載體。
30.如權利要求28所述的方法，其中所述載體是質粒pEV53B。
31.一種包括權利要求1、2或3所述的細胞的包裝細胞，其包括編碼至少一種慢病毒結構蛋白的慢病毒核酸序列，其中所述核酸序列是包裝信號缺陷的，如此所述細胞自身產生至少一種慢病毒結構蛋白，但不產生能夠復制的感染性病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供修飾細胞，其具有的粘連特性與未修飾細胞的粘連特性相比是增加的，其包括a)編碼整聯(lián)蛋白β
文檔編號C12N15/11GK1980955SQ200580013798
公開日2007年6月13日 申請日期2005年4月28日 優(yōu)先權日2004年4月29日
發(fā)明者J·C·奧爾森, M·帕特爾, D·A·威爾科克斯 申請人:北卡羅來納-查佩爾山大學, Mcw研究基金會公司