專利名稱：使用轉(zhuǎn)座和重組以操作和測(cè)序核酸分子的方法
背景技術(shù)：
相關(guān)領(lǐng)域位點(diǎn)特異性重組酶位點(diǎn)特異性重組酶是許多微生物(例如病毒和細(xì)菌)中存在的蛋白質(zhì)，其特征在于具有內(nèi)切核酸酶和連接酶性質(zhì)。這些重組酶(在某些情況下與相關(guān)的蛋白質(zhì)一起)識(shí)別DNA中的堿基特異序列并使位于那些區(qū)段側(cè)翼的DNA區(qū)段發(fā)生交換。重組酶和相關(guān)蛋白質(zhì)共同被稱作“重組蛋白質(zhì)”(見(jiàn)例如，Landy，A.，Current Opinion in Biotechnology 3699-707(1993))。
不同生物的許多重組系統(tǒng)已有描述。見(jiàn)例如，Hoess等，NucleicAcids Research 14(6)2287(1986)；Abremski等，J.Biol.Chem.261(1)391(1986)；Campbell，J.Bacteriol.174(23)7495(1992)；Qian等，J.Biol.Chem.267(11)7794(1992)；Araki等，J.Mol.Biol.225(1)25(1992)；Maeser和Kahnmann，Mol.Gen.Genet.230170-176(1991)Esposito等，Nucl.Acids Res.25(18)3605(1997)。這些中的許多屬于重組酶的整合酶家族(Argos等，EMBO J.5433-440(1986)；Vaziyanov等，Nucl.Acids Res.27930(1990))。其中研究最好的可能是λ噬菌體的整合酶/att系統(tǒng)(Landy，A.Current Opinions inGenetics and Devel.3699-707(1993))、P1噬菌體的Cre/loxP系統(tǒng)(Hoess和Abremski(1990)，Nucleic Acids and Molecular Biology，第4卷，編Eckstein和Lilley，Berlin-HeidelbergSperinger-Verlag；第90-109頁(yè))、和釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)2μ環(huán)狀質(zhì)粒的FLP/FRT系統(tǒng)(Broach等，Cell 29227-234(1982))。轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子是可動(dòng)遺傳因子。轉(zhuǎn)座子在結(jié)構(gòu)上是可變的，被描述為簡(jiǎn)單型或復(fù)合型，但典型地編碼一個(gè)轉(zhuǎn)座催化酶，術(shù)語(yǔ)稱作轉(zhuǎn)座酶，該酶兩側(cè)為以倒轉(zhuǎn)方向組織的DNA序列。對(duì)于轉(zhuǎn)座子特性的更為完全的討論，可以參考Mobile Genetic Elements，D.J.Sherratt編，OxfordUniversity出版(1995)和Mobile DNA，D.E.Berg和M.M.Howe編，American Soceity fot Microbiology(1989)，Washington，DC，兩本書均特此并入本文作為參考。
轉(zhuǎn)座子已被用于將DNA插入靶DNA序列中。作為一般原則，轉(zhuǎn)座子在靶DNA的插入是隨機(jī)事件。該原則的一個(gè)例外是轉(zhuǎn)座子Tn7的插入。作為生命周期的一個(gè)部分，轉(zhuǎn)座子Tn7可以將自身整合到大腸桿菌(E.coli)基因組的特異位點(diǎn)中(Stellwagen，A.E.和Craig，N.L.Trends inBiochemical Sciences 23，486-490，1998，特此并入本文作為參考)。該位點(diǎn)特異性插入已被用于體內(nèi)操作桿狀病毒的基因組(Lucklow等，J.Virol.674566-4579(1993)，特此并入本文作為參考)。對(duì)于其特點(diǎn)為向受體DNA分子中的隨機(jī)位置移動(dòng)的可轉(zhuǎn)座元件而言，Tn7的位點(diǎn)特異性是非典型的。為了本申請(qǐng)的目的，除非另行指出，轉(zhuǎn)座將用于指隨機(jī)或半隨機(jī)的移動(dòng)，而重組將用于指位點(diǎn)特異性重組事件。因此，Tn7在attTn7位點(diǎn)中的位點(diǎn)特異性插入將被稱作重組事件，而Tn7的隨機(jī)插入將被稱作轉(zhuǎn)座事件。
York等(Nucleic Acids Research，26(8)1927-1933，(1998))公開(kāi)了基于使用Tn5在質(zhì)粒分子內(nèi)的轉(zhuǎn)座事件制備嵌套缺失的體外方法。含有側(cè)翼為兩個(gè)19堿基對(duì)的Tn5轉(zhuǎn)座酶識(shí)別序列及靶DNA序列的卡那霉素抗性基因的載體，在存在純化的轉(zhuǎn)座酶蛋白質(zhì)的情況下作體外孵育。在使用低DNA濃度的條件下，有利于分子內(nèi)轉(zhuǎn)座反應(yīng)發(fā)生，該反應(yīng)被成功用于在靶DNA中制備一套嵌套缺失。這些作者提出，通過(guò)將終止信號(hào)包括在識(shí)別序列相鄰的所有三種閱讀框中，該系統(tǒng)可以用于在靶DNA編碼的蛋白質(zhì)中產(chǎn)生C端截短。此外，這些作者提出，將His標(biāo)簽和激酶區(qū)域包含在內(nèi)可以用于制備N端缺失蛋白質(zhì)以便作進(jìn)一步分析。
Devine等(Nucleic Acids Research，223765-3772(1994)和美國(guó)專利5,677,170和5,843,772，所有均特此并入本文作為參考)公開(kāi)了用于體外將DNA區(qū)段插入受體DNA分子中的人工轉(zhuǎn)座子的構(gòu)建。該系統(tǒng)利用酵母YT1病毒樣顆粒的插入催化酶作為轉(zhuǎn)座酶活性的來(lái)源。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，將目的DNA區(qū)段克隆在轉(zhuǎn)座子樣元件TY1兩末端間。當(dāng)存在TY1插入催化酶時(shí)，所獲元件將隨機(jī)整合至第二靶DNA分子中。重組位點(diǎn)由以上提及的重組蛋白介導(dǎo)的重組反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵特征是DNA分子上參與重組反應(yīng)的常稱作“重組位點(diǎn)”的識(shí)別序列。這些重組位點(diǎn)是參加的核酸分子上被重組蛋白質(zhì)在重組過(guò)程中識(shí)別和結(jié)合的不連續(xù)DNA部分或區(qū)段。例如，Cre重組酶的重組位點(diǎn)是34個(gè)堿基對(duì)序列的loxP，該序列由位于8堿基對(duì)核心序列側(cè)翼的兩個(gè)13堿基對(duì)反向重復(fù)(充當(dāng)重組酶識(shí)別位點(diǎn))組成。見(jiàn)Sauer，B.，Curr.Opin.Biotech.5521-527(1994)的


圖1。識(shí)別序列的其它例子包括重組蛋白1 Int所識(shí)別的attB、attP、attL、和attR序列。attB為含有兩個(gè)9堿基對(duì)核心型Int結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)7堿基對(duì)重疊區(qū)的約25堿基對(duì)序列，而attP為含有核心型Int結(jié)合位點(diǎn)和臂型Int結(jié)合位點(diǎn)以及輔助蛋白質(zhì)即整合宿主因子(IHF)、FIS和外切酶(Xis)的位點(diǎn)的約240個(gè)堿基對(duì)序列。見(jiàn)Landy，Curr.Opin.Biotech.3699-707(1993)。核酸測(cè)序歷史上，使用兩種主要技術(shù)測(cè)序核酸。第一種方法以其共開(kāi)發(fā)者命名為“Maxam和Gilbert測(cè)序”(Maxam，A.M.和Gilbert，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74560-564，1997)，在該方法中DNA被放射性標(biāo)記，之后被分成四個(gè)樣品，并用選擇性破壞DNA中特異核苷酸堿基和在破壞位點(diǎn)切割分子的化學(xué)藥品進(jìn)行處理。通過(guò)利用凝膠電泳將所獲片段分離為離散條帶并將凝膠暴露于X光片，可以從該膠片上讀出最初DNA分子的序列。已使用該技術(shù)測(cè)定了某些復(fù)雜DNA分子的序列，包括靈長(zhǎng)類動(dòng)物病毒SV40(Fiers，W.等，Nature 273113-120，1978；Reddy，V.B.等，Science 200494-502，1978)和細(xì)菌質(zhì)粒pBR322(Sutcliffe，G.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.4377-90，1979)的序列。測(cè)序的另一技術(shù)以其開(kāi)發(fā)者命名為“Sanger測(cè)序”(Sanger，F(xiàn).和Coulson，A.R.，J.Mol.Biol.94444-448，1975)，該技術(shù)也是傳統(tǒng)使用的。該方法使用DNA聚合酶的DNA聚合活性，當(dāng)與終止反應(yīng)的雙脫氧核苷三磷酸(Sanger，F(xiàn).等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463-5467，1977)和一短引物(可以對(duì)兩者中的一個(gè)作可檢測(cè)標(biāo)記)的混合物合并后，該DNA聚合酶產(chǎn)生一系列特異終止在四個(gè)脫氧堿基之一的新合成DNA片段。然后通過(guò)凝膠電泳分離這些片段，并按以上Maxam和Gilbert測(cè)序中所描述的方法確定序列。通過(guò)實(shí)施四個(gè)不同的反應(yīng)(一個(gè)使用一種ddNTP)，可以快速地確定甚至相當(dāng)復(fù)雜的DNA分子的序列(Sanger，F(xiàn).等，Nature265678-695，1977；Barnes，W.，Meth.Enzymol.152538-556，1987)。
盡管已使用了多年，但Maxam/Gilbert和Sanger測(cè)序常是耗時(shí)、昂貴的，而且在序列確定中易產(chǎn)生錯(cuò)誤。更近來(lái)，使用基于擴(kuò)增的方法測(cè)定核酸分子的核苷酸序列?？赡苓@些方法中最常用的依賴于對(duì)Mullis和同事描述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(見(jiàn)美國(guó)專利4,683,195和4,683,202)的使用，尤其是使用在自動(dòng)PCR方法學(xué)所用的相對(duì)高溫度下仍保持活性的熱穩(wěn)定酶如DNA聚合物(見(jiàn)Saiki，R.K.等，Science 239487-491(1988)；美國(guó)專利4,889,818和4,965,188)?；跀U(kuò)增的核酸測(cè)序方法，尤其是自動(dòng)雙脫氧測(cè)序方法如“循環(huán)測(cè)序”，利用PCR應(yīng)用中所用的熱穩(wěn)定聚合酶和溫度循環(huán)以及單個(gè)引物和ddNTP，導(dǎo)致從每個(gè)模板合成多種雙脫氧終止的寡核苷酸，這與標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序中產(chǎn)生的單一寡核苷酸是不同的。除了由每個(gè)模板合成多種寡核苷酸造成的靈敏度增加外，自動(dòng)測(cè)序中較高變性溫度的使用也提高了測(cè)序效率(即，發(fā)生較少的錯(cuò)誤摻入)并允許對(duì)GC豐富或含有顯著二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板進(jìn)行測(cè)序。
標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序方法和基于擴(kuò)增的技術(shù)的關(guān)鍵要求是測(cè)序引物雜交位點(diǎn)的DNA序列的信息。盡管可以使用與目的片段相鄰的載體中的引物位點(diǎn)對(duì)已知載體中的小片段進(jìn)行測(cè)序，但較大片段的測(cè)序則稍成問(wèn)題。
克服該問(wèn)題的一種可能方法是合成具有與最初測(cè)序反應(yīng)所確定的序列互補(bǔ)的序列的新引物。該技術(shù)常稱作目的基因“步行”。
目的基因“步行”的一個(gè)替代方法是在目的DNA分子中構(gòu)建一套嵌套缺失(見(jiàn)Henikoff，Gene 28(3)351-9，1984)。在插入片段和載體的一個(gè)連接處切開(kāi)含有插入片段的載體。然后所獲線性DNA分子與外切核酸酶一起孵育，以從插入片段末端起去除堿基。通過(guò)改變孵育時(shí)間，可以改變從插入片段上去除的堿基數(shù)目，獲得一系列含有進(jìn)行性缺失的插入片段的DNA。對(duì)核酸酶處理的DNA進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化后，可以分離出大量在載體的引物位點(diǎn)相鄰處具有新序列的克隆，由此允許使用與消化位點(diǎn)相鄰的載體序列雜交的引物對(duì)整個(gè)插入片段進(jìn)行測(cè)序。
在近來(lái)發(fā)展的技術(shù)中，轉(zhuǎn)座子被用于將已知序列的小DNA分子插入未知序列的較大DNA分子中。該已知序列可以用作為引物識(shí)別位點(diǎn)，由此可以使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法確定與該插入的轉(zhuǎn)座子相鄰的較大DNA分子的DNA序列。Strathmann等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881247-1250，1990)描述了一個(gè)這樣的系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用了gd轉(zhuǎn)座子向靶DNA的體內(nèi)插入。將目的DNA克隆至“小質(zhì)?！敝校员闶罐D(zhuǎn)座子偏向于插入靶DNA中而非載體DNA中。
Devine等在美國(guó)專利5,728,551(特此并入本文作為參考)中描述了一個(gè)用于測(cè)序應(yīng)用的體外轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)。使稱作“引物島(primerisland)”人工轉(zhuǎn)座子(PART)的人工轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶存在時(shí)與含有靶DNA的載體反應(yīng)。篩選所獲群體以鑒定在靶DNA中含有PART的分子，并對(duì)PART在靶中的定位進(jìn)行作圖。選擇PART在靶DNA中被適當(dāng)?shù)亻g隔的載體群，并使用與PART中序列雜交的引物確定靶的DNA序列。
盡管可以將轉(zhuǎn)座子插入靶DNA分子中，但基于該技術(shù)的測(cè)序方法仍受到顯著的限制。轉(zhuǎn)座子在含有靶DNA的載體中插入的隨機(jī)本質(zhì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子在載體中的同樣頻繁的插入。因此，目前的方法需要繁瑣的分揀程序(例如通過(guò)限制性作圖)以鑒定在靶DNA中含有適當(dāng)插入片段的克隆，或接受載體的重復(fù)測(cè)序。兩種方法都相當(dāng)大地增加了測(cè)序計(jì)劃的勞動(dòng)量和費(fèi)用。
因此，在本領(lǐng)域中需要另一種測(cè)序系統(tǒng)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的方法的缺陷，并為更快速、有效和經(jīng)濟(jì)地確定核酸分子的核苷酸序列提供條件。本發(fā)明滿足了這種需要和其它需要。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明一般涉及包含至少一個(gè)整合序列和至少一個(gè)重組位點(diǎn)的核酸分子(DNA或RNA)，其中該重組位點(diǎn)可以定位在整合序列內(nèi)和/或外(如鄰近整合序列)。根據(jù)本發(fā)明，整合序列可以包括通過(guò)重組或整合成為目的核酸分子一部分的任何核酸分子。整合序列的例子包括，但不限于，轉(zhuǎn)座子、插入序列、整合病毒、返巢內(nèi)含子(homing intron)、或其它整合元件，或它們的各種組合。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明整合序列可以是插入序列或轉(zhuǎn)座子或它們的衍生物。一方面，將至少兩個(gè)重組位點(diǎn)(它們可以相同或不同)包含在整合序列外的核酸分子中，并且使它們優(yōu)選位于整合序列的兩側(cè)。另一方面，將至少兩個(gè)重組位點(diǎn)(它們可以相同或不同)包含在整合序列中。本發(fā)明特別提供了包含側(cè)翼為重組位點(diǎn)的靶核酸序列和至少一個(gè)插在靶序列中的整合序列的核酸分子(優(yōu)選載體)。根據(jù)本發(fā)明，重組位點(diǎn)可以用于使序列和目的分子發(fā)生交換、從目的分子中缺失序列、將序列摻入目的分子中，或以其它方式用于鑒定、操作、分析和/或選擇目的分子。
另一方面，利用同源重組的多種策略可以提供一種替代轉(zhuǎn)座子的方法用于使目的DNA區(qū)段整合至靶序列中。這些策略可以在體內(nèi)或在體外實(shí)現(xiàn)。Yu等(Proc.Natl.Sci.USA 2000年5月23；97(11)5978-83)顯示，與靶序列有同源性的DNA區(qū)段可以有效地被整合至預(yù)先確定的DNA序列中?？梢允褂眠@些方法將重組位點(diǎn)、選擇標(biāo)記、功能性元件整合至靶序列的確定座位中。類似地，利用體外異源雙鏈形成和修復(fù)反應(yīng)的幾個(gè)報(bào)道也已被用于將基因和其它DNA區(qū)段插入靶序列中(Volkov AA等，Nucl.Acids.Res.1999年9月15；27(18)e18)。因此可以使用重組位點(diǎn)側(cè)翼的寡核苷酸所確定的完全或部分同源性，以制備含有定向、部分定向或隨機(jī)插入的重組位點(diǎn)的靶序列群。
本發(fā)明中使用的重組位點(diǎn)可以是核酸分子上參與重組反應(yīng)的任何重組蛋白識(shí)別序列。在本發(fā)明那些利用一個(gè)以上重組位點(diǎn)的實(shí)施方案中，這些重組位點(diǎn)可以相同或不同，并可以彼此重組或可以不或基本上不彼此重組。本發(fā)明所考慮的重組位點(diǎn)也包括野生型或天然存在的重組位點(diǎn)的突變體、衍生物或變體。優(yōu)選的重組位點(diǎn)修飾包括那些增加重組的修飾，該增加基本上選自(i)促進(jìn)整合重組；(ii)促進(jìn)切除重組；(iii)降低對(duì)宿主因子的需要；(iv)增加共合體或產(chǎn)物形成的效率；和(v)增加共合體和/或產(chǎn)物形成的特異性。優(yōu)選的修飾包括增加重組特異性的修飾、允許重組位點(diǎn)或其部分(或包含重組位點(diǎn)或其部分的核酸分子)充當(dāng)擴(kuò)增(例如通過(guò)PCR)的引物位點(diǎn)的修飾、去除一或多個(gè)終止密碼子的修飾、和/或避免發(fā)夾形成的修飾。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選重組位點(diǎn)包括att位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)和lox位點(diǎn)，或它們的突變體、衍生物、片段、部分和變體(或它們的組合)。本發(fā)明考慮的重組位點(diǎn)也包括這些重組位點(diǎn)的部分。
本發(fā)明的整合序列可以包含一個(gè)或多個(gè)元件和/或功能性序列和/或位點(diǎn)(或它們的組合)，這包括一或多個(gè)與一或多個(gè)目的測(cè)序或擴(kuò)增引物互補(bǔ)的序列(例如測(cè)序引物位點(diǎn)或擴(kuò)增引物位點(diǎn))、一或多個(gè)選擇標(biāo)記(例如，毒性基因、抗生素抗性基因等)、一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄或翻譯位點(diǎn)或信號(hào)、一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄或翻譯終止位點(diǎn)、一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一或多個(gè)重組位點(diǎn)(或其部分)等。一個(gè)實(shí)施方案中，整合序列可以包含一或多個(gè)重組位點(diǎn)(或其部分)和一或多個(gè)選擇標(biāo)記。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以使用整合序列將一或多個(gè)重組位點(diǎn)(或其部分)或其它目的位點(diǎn)或序列摻入任何核酸分子中。根據(jù)本發(fā)明可以通過(guò)體外或體內(nèi)裝配來(lái)引入整合序列。本發(fā)明的方法可以利用一或多個(gè)可以相同或不同的整合序列。因此，具有不同功能性位點(diǎn)或信號(hào)的不同整合序列的用途也是本發(fā)明所考慮的。
本發(fā)明還提供將整合序列插入靶核酸序列中的方法，該方法包含將側(cè)翼為重組位點(diǎn)的目的靶序列和至少一個(gè)整合序列，在足以使至少一個(gè)所述整合序列整合或插入到所述靶序列中的條件下進(jìn)行孵育，和任選地篩選含有所述至少一個(gè)整合序列的所述靶序列。根據(jù)本發(fā)明，這些靶序列優(yōu)選包含在載體中，并且優(yōu)選的整合序列是一或多個(gè)轉(zhuǎn)座子?？梢詢?yōu)選地通過(guò)使用位于目的靶序列側(cè)翼的重組位點(diǎn)來(lái)選擇含有至少一個(gè)整合序列的靶序列。在一個(gè)優(yōu)選方面，使用重組克隆以轉(zhuǎn)移和選擇含有整合序列的靶序列。根據(jù)本發(fā)明，該方法優(yōu)選包括(a)從第一核酸分子上將含有至少一個(gè)整合序列或其部分并且側(cè)翼為重組位點(diǎn)或其部分的靶序列轉(zhuǎn)移至第二核酸分子上；和(b)選擇含有側(cè)翼為重組位點(diǎn)或其部分的所述靶序列的所述第二核酸分子。
在一個(gè)優(yōu)選方面，該第一和/或第二核酸分子是載體。例如，可以通過(guò)使用整合序列和/或靶序列所包含的一或多個(gè)選擇標(biāo)記，選擇所述第二核酸分子。也可以在根據(jù)本發(fā)明的篩選策略中利用第二核酸分子所包含的一或多個(gè)選擇標(biāo)記。作為替代，或者此外，還可以使用負(fù)選擇以選擇除去不含目的靶序列的第二核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選方面，利用重組克隆將含有至少一個(gè)整合序列的靶序列轉(zhuǎn)移至載體中。優(yōu)選地，聯(lián)合使用載體和整合序列所包含的選擇標(biāo)記，以選擇含有靶序列/整合序列的期望載體產(chǎn)物。以此方式，可以選擇除去不需要的產(chǎn)物，例如含有未插入整合序列的靶序列的載體。
在本發(fā)明再一方面，將所選擇的含有整合序列的靶序列用于對(duì)靶序列的進(jìn)一步操作中。在此方面，本發(fā)明使得可以通過(guò)整合序列的隨機(jī)整合隨機(jī)插入期望序列，這可以用于操作或分析靶序列。例如，整合序列所包含的測(cè)序引物位點(diǎn)在靶序列中的隨機(jī)插入使得可以對(duì)靶序列的各個(gè)部分或全部進(jìn)行測(cè)序。一方面，可以利用來(lái)自靶的部分序列信息通過(guò)分析和比較這些部分序列的序列重疊，確定靶的完整核酸序列?；蛘?，整合序列所包含的擴(kuò)增引物位點(diǎn)在靶序列中的隨機(jī)插入使得可以對(duì)靶序列的部分或全部進(jìn)行擴(kuò)增，而整合序列所包含的轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)序列的隨機(jī)插入使得可以從靶序列的各部分或全部表達(dá)出蛋白質(zhì)或多肽。同樣，基因或基因部分(例如GUS、GST、GFP等)的隨機(jī)插入也使得可以構(gòu)建一群目的靶序列的基因融合物。此外，整合序列所包含的重組位點(diǎn)(或其部分)的隨機(jī)插入還使得可以構(gòu)建一群目的靶序列的缺失突變體。任選地，可以克隆靶序列的缺失部分。因此，本發(fā)明涉及操作或分析(例如測(cè)序、擴(kuò)增、缺失、突變、表達(dá)分析等)全部或部分靶核酸分子的方法，該方法包含(a)選擇含有至少一個(gè)整合序列或其部分并且側(cè)翼為重組位點(diǎn)或其部分的靶序列，和(b)對(duì)含有所述整合序列的所述靶序列的至少一部分進(jìn)行操作或分析(例如測(cè)序、擴(kuò)增、突變、表達(dá)分析等)。
在一個(gè)優(yōu)選方面，這些操作或分析通過(guò)整合序列所包含的一或多個(gè)位點(diǎn)來(lái)起始或完成。
根據(jù)本發(fā)明，測(cè)序步驟可以包含(a)將待測(cè)序的核酸分子和一或多個(gè)引物、一或多個(gè)核苷酸及一或多個(gè)終止試劑混合，以形成混合物；(b)在足以合成一群與所述待測(cè)分子的全部或部分互補(bǔ)的分子的條件下，孵育所述混合物；和(c)分離所述群體以確定所述待測(cè)分子的全部或部分核苷酸序列。
更具體地，本發(fā)明測(cè)序方法可以包含(a)使引物與第一核酸分子雜交；(b)使所述分子與一或多個(gè)核苷酸及一或多個(gè)終止試劑接觸；(c)在足以合成一群與所述第一核酸分子的全部或部分互補(bǔ)的核酸分子的條件下，孵育步驟(b)的混合物，其中所述合成分子的長(zhǎng)度較所述第一分子的短而且所述合成分子在其3’末端包含終止試劑；和(d)按大小分離所述合成分子，以便可以確定所述第一分子的至少一部分核苷酸序列。
本發(fā)明還提供在目的核酸分子中制備缺失的方法，該方法包括使包含至少第一重組位點(diǎn)的核酸分子和包含至少第二重組位點(diǎn)的整合序列在一定條件下接觸以便至少一個(gè)所述整合序列插入所述核酸分子中；和使至少所述第一和所述第二重組位點(diǎn)重組，籍此造成所述核酸分子的至少一個(gè)部分缺失。在一些實(shí)施方案中，可以克隆靶核酸分子的缺失部分。在一個(gè)優(yōu)選方面，將在缺失點(diǎn)處產(chǎn)生一個(gè)新的重組位點(diǎn)。例如，attP和attB之間的重組可以在缺失點(diǎn)處產(chǎn)生一個(gè)attL或attR位點(diǎn)。然后可以使用這些新重組位點(diǎn)對(duì)含有這些新重組位點(diǎn)的靶或載體序列作進(jìn)一步操作。在一個(gè)優(yōu)選方面，目的核酸分子可以是包含靶序列的載體。在此方面，靶序列和/或載體序列可以包含所述第一重組位點(diǎn)，而整合序列(在某些實(shí)施方案中為轉(zhuǎn)座子)包含第二重組位點(diǎn)。在此方面，可以首先將靶序列插入含有至少第一重組位點(diǎn)的載體中。另一方面，可以將第一和第二重組位點(diǎn)通過(guò)一或多個(gè)整合序列摻入靶序列和/或載體中。將整合序列插入靶序列內(nèi)的一或多個(gè)位置后，可以通過(guò)允許兩個(gè)重組位點(diǎn)之間發(fā)生重組來(lái)制備一群缺失突變體。其它不同大小和不同位置的缺失可以通過(guò)在目的靶序列和/或載體內(nèi)的不同位置包括其它的重組位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，可以將第三、第四和/或第五重組位點(diǎn)插在靶或載體序列內(nèi)的不同位置(例如通過(guò)含有這些不同重組位點(diǎn)的其它整合序列)。在這些位點(diǎn)間造成重組將允許進(jìn)一步缺失靶或載體序列。例如，可以通過(guò)首先在第一和第二重組位點(diǎn)間造成重組以產(chǎn)生第一缺失和一個(gè)位于缺失點(diǎn)處的新重組位點(diǎn)(例如一個(gè)第三重組位點(diǎn))，在靶或載體序列中插入一個(gè)第四重組位點(diǎn)(優(yōu)選地通過(guò)插入含有一或多個(gè)重組位點(diǎn)的整合序列)，并在所述第三和第四重組位點(diǎn)間造成重組以產(chǎn)生第二缺失并在缺失點(diǎn)處創(chuàng)造一個(gè)新的重組位點(diǎn)(例如一個(gè)第五重組位點(diǎn))，從而相繼地在靶或載體序列中造成缺失。該過(guò)程可以重復(fù)許多次以在目的靶和/或載體序列中產(chǎn)生許多缺失。
本發(fā)明提供置換或交換目的核酸分子中的序列的方法。該方法包括使包含至少第一重組位點(diǎn)的核酸分子和包含至少第二重組位點(diǎn)的整合序列在一定條件下接觸，以便至少一個(gè)所述整合序列插入所述核酸分子中；和用側(cè)翼為重組位點(diǎn)的至少第二核酸分子置換所述分子中側(cè)翼為所述第一和第二重組位點(diǎn)的一或多個(gè)序列。在一些實(shí)施方案中，靶序列和第二核酸分子編碼肽、多肽或蛋白質(zhì)，而重組事件將使這些編碼的肽、多肽或蛋白質(zhì)置于同一個(gè)閱讀框中。該第二分子可以含有一或多個(gè)基因或基因的部分。在一個(gè)優(yōu)選方面，用于該置換的目的核酸分子是包含靶序列的載體。在此方面，靶序列和/或載體序列包含所述第一重組位點(diǎn)，而整合序列(優(yōu)選轉(zhuǎn)座子)包含第二重組位點(diǎn)。在此方面，可以首先將靶序列插入含有至少一個(gè)第一重組位點(diǎn)的載體中。另一方面，第一和第二重組位點(diǎn)可以通過(guò)一或多個(gè)整合序列摻入靶序列和/或載體中。將整合序列插入靶序列內(nèi)的一或多個(gè)位置后，可以通過(guò)允許側(cè)翼為重組位點(diǎn)的一群第二核酸分子置換側(cè)翼為所述第一和第二重組位點(diǎn)的分子，制備一群融合物。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，可以通過(guò)以下方法向目的核酸分子中添加一或多個(gè)重組位點(diǎn)，該方法包括(a)使一或多個(gè)包含一或多個(gè)重組位點(diǎn)或其部分的整合序列和一或多個(gè)核酸分子接觸；和(b)在足以使所述含有重組位點(diǎn)的整合序列摻入所述核酸分子中的條件下，孵育所述混合物。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，在體外使一或多個(gè)核酸分子和一或多個(gè)整合序列接觸。
一旦該一或多個(gè)重組位點(diǎn)(和/或其部分)摻入目的核酸分子后，可以使用這些重組位點(diǎn)轉(zhuǎn)移側(cè)翼為這些重組位點(diǎn)的核酸分子。因此，根據(jù)本發(fā)明，含有重組位點(diǎn)或其部分的整合序列的隨機(jī)插入使得可以將許多重組位點(diǎn)(或其部分)摻入目的分子中。通過(guò)重組克隆，這些重組位點(diǎn)的使用為將側(cè)翼有重組位點(diǎn)的分子部分轉(zhuǎn)移至一或多個(gè)載體中提供了方法。例如，將側(cè)翼為第一和第二重組位點(diǎn)(它們優(yōu)選不彼此重組)的一或許多目的分子和包含第三和第四重組位點(diǎn)(它們優(yōu)選不彼此重組)的載體，在足以允許第一重組位點(diǎn)和第三重組位點(diǎn)重組而第二重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)重組的條件下，進(jìn)行混合。然后可以根據(jù)本發(fā)明選擇包含載體和側(cè)翼為重組位點(diǎn)的核酸分子的期望產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選方面，可以通過(guò)將許多目的分子轉(zhuǎn)移至一或多個(gè)載體中，制備一群分子。因此，本發(fā)明使得可以構(gòu)建可以代表起始遺傳材料的所有或部分的文庫(kù)。在一個(gè)優(yōu)選方面，該文庫(kù)可以使用本發(fā)明從cDNA、基因組或染色體遺傳材料制備。
在另一方面，可以直接使摻入目的核酸分子中的重組位點(diǎn)進(jìn)行重組，而不需要轉(zhuǎn)移至不同的核酸分子或載體上。由此，側(cè)翼為重組位點(diǎn)的分子可以在重組位點(diǎn)的重組后環(huán)化。優(yōu)選地，該環(huán)狀分子在重新環(huán)化位點(diǎn)處含有一個(gè)新的重組位點(diǎn)。由此，通過(guò)使位于目的核酸分子內(nèi)的第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)重組，可以創(chuàng)造一個(gè)新的環(huán)化分子，其包含最初側(cè)翼為重組位點(diǎn)的核酸分子。在一個(gè)優(yōu)選方面，該環(huán)化分子含有至少一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以便該分子可以在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或在宿主細(xì)胞中起載體的作用。該環(huán)化分子還可以含有一或多個(gè)選擇標(biāo)記。一方面，可以由一或多個(gè)整合序列提供一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和/或選擇標(biāo)記。因此，重組后，該分子優(yōu)選將包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)、至少一個(gè)選擇標(biāo)記、目的核酸分子和復(fù)制起點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供了方法，通過(guò)該方法可以使用重組位點(diǎn)構(gòu)建一個(gè)或一群包含目的原始核酸分子的部分的載體。以此方式，本發(fā)明使得可以從起始遺傳材料如cDNA、基因組或染色體DNA有效地制備文庫(kù)。
在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明提供了方法，通過(guò)該方法可以借助待環(huán)化分子內(nèi)至少第一和第二重組位點(diǎn)的重組使線性核酸分子環(huán)化。優(yōu)選地，該第一和第二重組位點(diǎn)位于線性分子的末端或近末端。在一個(gè)優(yōu)選方面，通過(guò)銜接子(其包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)或其部分)與線性分子的一或兩個(gè)末端的連接、和/或通過(guò)用包含一個(gè)重組位點(diǎn)或其部分的引物擴(kuò)增線性分子，將重組位點(diǎn)加在線性分子的末端或近末端。或者，可以使用包含共價(jià)連接的拓?fù)洚悩?gòu)酶的DNA區(qū)段，以將接頭(例如包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)或其部分的接頭)或其它DNA區(qū)段和其它線性DNA區(qū)段的末端連接在一起(Shuman，S.，J.Biol.Chem.26932678(1994))。另一方面，可以將添加銜接子及用引物進(jìn)行擴(kuò)增組合起來(lái)使用以便將重組位點(diǎn)摻入分子的末端。以此方式，可以構(gòu)建以下線性分子，在該線性分子的第一末端處或鄰近處含有第一重組位點(diǎn)而在該線性分子的第二末端處或鄰近處含有第二重組位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，這些重組位點(diǎn)的重組將產(chǎn)生環(huán)狀分子。優(yōu)選地，該環(huán)狀分子在再環(huán)化的位點(diǎn)處含有一個(gè)新的重組位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選方面，該環(huán)狀分子包含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和/或至少一個(gè)選擇標(biāo)記。一方面，可以將一或多個(gè)含有一或多個(gè)功能位點(diǎn)如復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄信號(hào)等的整合序列整合入此線性或環(huán)化分子中，為該分子提供功能性序列。另一方面，整合序列(優(yōu)選是轉(zhuǎn)座子)使復(fù)制起點(diǎn)和任選地至少一個(gè)選擇標(biāo)記摻入到該線性或環(huán)狀分子中。
本發(fā)明還涉及實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，尤其是用于擴(kuò)增和測(cè)序核酸、構(gòu)建缺失體、構(gòu)建突變體、和將重組位點(diǎn)插入目的核酸分子中的試劑盒。這些試劑盒可以包含一或多個(gè)本發(fā)明核酸分子如整合序列和/或本發(fā)明載體。這些試劑盒可以任選地包含選自下組的一或多種其它成分一或多種核苷酸、一或多種聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶、一或多種適合的緩沖液、一或多種引物和一或多種終止劑(例如一或多種雙脫氧核苷酸)。
本發(fā)明組合物、方法和試劑盒優(yōu)選使用λ噬菌體位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)并最優(yōu)選地使用GATEWAYTM重組克隆技術(shù)(可從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division(Rockville，MD)獲得)來(lái)制備和實(shí)施。
根據(jù)本領(lǐng)域已知知識(shí)、根據(jù)以下附圖和發(fā)明詳述，以及根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)于普通技術(shù)人員將是明了的。
附圖簡(jiǎn)述
圖1是本發(fā)明重組反應(yīng)的示意圖。
圖2示意性表現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子在靶核酸分子和/或載體核酸分子中的插入。
圖3示意性表現(xiàn)了可以如何使用本發(fā)明通過(guò)在轉(zhuǎn)座反應(yīng)后實(shí)施重組克隆步驟以選擇包含插入序列的靶核酸分子。
圖4A是使用含有重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子克隆基因組DNA的示意圖。
圖4B是使用含有經(jīng)定向以允許生產(chǎn)性和非生產(chǎn)性重組反應(yīng)得以發(fā)生的重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子，克隆基因組DNA的示意圖。
圖5示意性顯示了設(shè)計(jì)用于通過(guò)重組轉(zhuǎn)移選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子。
圖6是使用包含毒性基因的轉(zhuǎn)座子克隆基因組DNA的示意圖。
圖7是使用包含復(fù)制起點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子和包含選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子克隆基因組DNA的示意圖。
圖8A是使用本發(fā)明組合物和方法構(gòu)建亞克隆的示意圖。
圖8B是使用本發(fā)明組合物和方法置換一部分靶序列的示意圖。
圖9是使用含有復(fù)制起點(diǎn)的插入序列根據(jù)本發(fā)明方法構(gòu)建亞克隆的示意圖。
圖10是使用本發(fā)明組合物和方法從PCR產(chǎn)物構(gòu)建基因?qū)蜉d體的示意圖。
圖11是使用本發(fā)明組合物和方法在靶DNA分子中構(gòu)建缺失的示意圖。
圖12是使用本發(fā)明組合物和方法克隆靶分子的缺失部分的示意圖。
圖13是使用本發(fā)明組合物和方法制備附著于固相基質(zhì)上的核酸分子群的示意圖。
在這些圖中，RS指示重組位點(diǎn)并通過(guò)數(shù)字下標(biāo)區(qū)分這些重組位點(diǎn)，SM和數(shù)字下標(biāo)指示選擇標(biāo)記。兩個(gè)相容性重組位點(diǎn)的反應(yīng)產(chǎn)物由RS指明，而下標(biāo)指出發(fā)生重組的這兩個(gè)位點(diǎn)。
發(fā)明詳述定義在以下描述中，我們廣泛利用大量在分子生物學(xué)中使用的術(shù)語(yǔ)。為了清晰一致地理解說(shuō)明書和權(quán)利要求(包括指定的范圍)，我們提供以下定義。
擴(kuò)增本文所用擴(kuò)增是指借助一或多種具有聚合酶活性的多肽(例如一或多種核酸聚合酶或一或多種逆轉(zhuǎn)錄酶)、用于增加核苷酸序列拷貝數(shù)的任何體外方法。核酸擴(kuò)增導(dǎo)致核苷酸插入DNA和/或RNA分子或引物中，籍此形成一個(gè)新的與模板互補(bǔ)的核酸分子。所形成的核酸分子和其模板可以用作模板以合成其它核酸分子。正如本文所用，一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)可以由多輪核酸復(fù)制組成。DNA擴(kuò)增反應(yīng)包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。一個(gè)PCR反應(yīng)可以由5-100個(gè)循環(huán)的DNA分子變性及合成組成。
基因本文所用基因是指含有多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的信息的核酸序列。它包括啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)基因以及其它參與該蛋白質(zhì)表達(dá)的序列。
宿主本文所用宿主是指作為可復(fù)制表達(dá)載體、克隆載體或任何核酸分子的受體的任何原核或真核生物。該核酸分子可以包含，但不限于，結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻遏子等)和/或復(fù)制起點(diǎn)(ori)。正如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主”、“宿主細(xì)胞”、“重組宿主”和“重組宿主細(xì)胞”可以互換使用。對(duì)于這些宿主的例子，參見(jiàn)Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，紐約(1982)。
雜交本文所用術(shù)語(yǔ)雜交和進(jìn)行雜交是指兩個(gè)互補(bǔ)單鏈核酸分子(RNA和/或DNA)的堿基配對(duì)以給出雙鏈分子。正如本文所用，即使堿基配對(duì)并不完全互補(bǔ)，兩個(gè)核酸分子也可以雜交。因此，只要使用適當(dāng)?shù)臈l件(這是本領(lǐng)域熟知的)，錯(cuò)配的堿基并不妨礙兩個(gè)核酸分子的雜交。一些方面，“雜交”是在“嚴(yán)緊條件”下進(jìn)行?！皣?yán)緊條件”在本文中用于指42℃在以下溶液中孵育過(guò)夜，該溶液包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，150mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt氏溶液、10％葡聚糖硫酸酯、和20g/ml經(jīng)剪切的變性鮭精DNA，之后在0.1×SSC中于約65℃洗滌濾膜。
摻入本文作用摻入是指成為核酸(如DNA)分子或引物的一個(gè)部分。
插入片段本文所用插入片段是指作為較大核酸分子的一個(gè)部分的一段期望核酸區(qū)段。根據(jù)本發(fā)明，插入片段可以是靶核酸分子。
插入片段供體本文所用插入片段供體是指帶有插入片段的本發(fā)明的兩個(gè)親本核酸分子(例如RNA或DNA)中的一個(gè)。插入片段供體包含兩側(cè)均被重組位點(diǎn)包圍的插入片段。插入供體可以是線性的或環(huán)狀的。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，插入片段供體是環(huán)狀DNA分子而且在重組信號(hào)之外還包含一段克隆載體序列(見(jiàn)
圖1)。當(dāng)使用一群插入片段或一群核酸區(qū)段制備插入供體時(shí)，將獲得一群插入供體，而且這些供體可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用。
整合序列本文所用整合序列是指能夠隨機(jī)插入靶核酸分子中的任何核苷酸序列。整合序列在本領(lǐng)域中又稱作可動(dòng)遺傳因子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何整合序列均可以用于實(shí)施本發(fā)明，它們包括但不限于轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(可轉(zhuǎn)座元件)、整合病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)、IS元件、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)座子、果蠅(Drosophila)的P元件、細(xì)菌的毒力因子、或真核生物的可動(dòng)遺傳因子如mariner、Tc1和Sleeping Beauty。根據(jù)本發(fā)明也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它可動(dòng)遺傳因子。
文庫(kù)本文所用文庫(kù)是指核酸分子(環(huán)狀或線性)的集合。在一個(gè)實(shí)施方案中，文庫(kù)可以包含大量(即兩個(gè)或多個(gè))核酸分子，這些核酸分子可以或可以不來(lái)自于共同的生物、器官、組織或細(xì)胞來(lái)源。在另一實(shí)施方案中，文庫(kù)代表生物核酸含量的全部或部分或一個(gè)顯著部分(“基因組”文庫(kù))，或是代表細(xì)胞、組織、器官或生物所表達(dá)核酸分子的全部或部分或一個(gè)顯著部分的一套核酸分子(cDNA文庫(kù))。在其它實(shí)施方案中，文庫(kù)可以包含在靶中不同位置含有插入片段的靶DNA分子。文庫(kù)還可以包含通過(guò)一或多個(gè)序列的從頭合成、誘變等制備的隨機(jī)序列。這些文庫(kù)可以或可以不被包含在一或多個(gè)載體中。
核苷酸本文所用核苷酸是指堿基-糖-磷酸的組合。核苷酸是核酸分子(DNA和RNA)的單體單位。術(shù)語(yǔ)核苷酸包括核糖核苷三磷酸ATP、UTP、CTP、GTP及脫氧核糖核苷三磷酸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP，或它們的衍生物。這些衍生物包括，例如，[αS]dATP、7-脫氮dGTP和7-脫氮dATP。術(shù)語(yǔ)核苷酸在本文中還指雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)和它們的衍生物。雙脫氧核糖核苷三磷酸的舉例說(shuō)明性例子包括，但不限于，ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。根據(jù)本發(fā)明，“核苷酸”可以不標(biāo)記，或可以通過(guò)熟知技術(shù)作可檢測(cè)標(biāo)記?？蓹z測(cè)標(biāo)記物包括，例如，放射性同位素、熒光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、生物發(fā)光標(biāo)記物和酶標(biāo)記物。
寡核苷酸本文所用寡核苷酸是包含一段共價(jià)連接的核苷酸序列的合成或天然分子，所述核苷酸通過(guò)一個(gè)核苷酸的戊糖的3’位和相鄰核苷酸的戊糖的5’位之間的磷酸二酯鍵連接在一起。
引物本文所用引物是指在核酸分子(例如DNA分子)的擴(kuò)增或聚合過(guò)程通過(guò)核苷酸單體的共價(jià)鍵合而延伸的單鏈或雙鏈寡核苷酸。一方面，引物可以是測(cè)序引物(例如通用測(cè)序引物)。另一方面，引物可以包含重組位點(diǎn)或其部分。
產(chǎn)物本文所用產(chǎn)物是指重組克隆程序的過(guò)程中第二次重組事件后產(chǎn)生的、包含A和D序列的其中一個(gè)期望的子代分子(見(jiàn)
圖1)。產(chǎn)物包含待克隆或亞克隆的核酸。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)使用一群插入片段供體時(shí)，所獲產(chǎn)物分子群將含有該插入片段供體群的插入片段的所有或部分，而且優(yōu)選將含有插入供體的原始分子的代表群。
啟動(dòng)子本文所用啟動(dòng)子是指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的一個(gè)例子，具體地是指一般被描述為位于起始密碼子近端的基因5’區(qū)的DNA序列。鄰近DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)錄起始于啟動(dòng)子區(qū)。阻抑型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)阻抑劑而降低。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑將增加。組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率不受到特異的調(diào)節(jié)，盡管它可以在一般代謝條件的影響下發(fā)生改變。
識(shí)別序列本文所用識(shí)別序列是指蛋白質(zhì)、化學(xué)化合物、DNA或RNA分子(例如限制性內(nèi)切酶、修飾性甲基化酶、或重組酶)所識(shí)別和接合的一段特定序列。本發(fā)明中，識(shí)別序列通常是指重組位點(diǎn)。例如，Cre重組酶的識(shí)別序列是loxP，它是由位于一段8堿基對(duì)核心序列兩側(cè)的兩個(gè)13堿基對(duì)的反向重復(fù)(充當(dāng)重組酶結(jié)合位點(diǎn))組成的一段34個(gè)堿基對(duì)的序列。見(jiàn)Sauer，B.，Current Opinion in Biotechnology 5521-527(1994)的
圖1。識(shí)別序列的其它例子有重組酶1整合酶所識(shí)別的attB、attP、attL、和attR序列。attB是含有兩個(gè)9堿基對(duì)核心型Int結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)7堿基對(duì)重疊區(qū)的約25堿基對(duì)的序列。attP是含有核心型Int結(jié)合位點(diǎn)和臂型Int結(jié)合位點(diǎn)以及輔助蛋白質(zhì)整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)的位點(diǎn)的一段約240個(gè)堿基對(duì)的序列。見(jiàn)Landy，CurrentOpinion in Biotechnology 3699-707(1993)。根據(jù)本發(fā)明還可以對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行改造以增強(qiáng)本發(fā)明方法中產(chǎn)物的產(chǎn)量。當(dāng)經(jīng)改造的該位點(diǎn)缺少的P1或H1域以使得重組反應(yīng)不可逆轉(zhuǎn)時(shí)(例如attR或attP)，這些位點(diǎn)可以被稱作attR’或attP’，以顯示這些位點(diǎn)的這些域已通過(guò)某種方式而被修飾。
重組蛋白本文所用重組蛋白包括切除性或整合性蛋白質(zhì)、酶、輔因子或參與涉及一或多個(gè)重組位點(diǎn)的重組反應(yīng)的相關(guān)因子，重組蛋白可以是野生型蛋白質(zhì)(見(jiàn)Landy，Current Opinion in Biotechnology3699-707(1993))、或其突變體、衍生物、片段和變體。
重組位點(diǎn)本文所用重組位點(diǎn)是指核酸分子上參與整合/重組反應(yīng)的重組蛋白質(zhì)識(shí)別序列。重組位點(diǎn)是該參與的核酸分子上被位點(diǎn)特異性重組蛋白質(zhì)在整合或重組初期識(shí)別和結(jié)合的不連續(xù)核酸片段或區(qū)段。例如，Cre重組酶的重組位點(diǎn)是loxP，它是由位于一段8堿基對(duì)核心序列兩側(cè)的兩個(gè)13堿基對(duì)的反向重復(fù)(充當(dāng)重組酶結(jié)合位點(diǎn))組成的一段34個(gè)堿基對(duì)的序列。見(jiàn)Sauer，B.，Current Opinion in Biotechnology5521-527(1994)的
圖1。識(shí)別序列的其它例子包括此處所述attB、attP、attL、和attR序列，及它們的突變體、片段、變體和衍生物，這些識(shí)別序列被重組蛋白1 Int和被輔助蛋白質(zhì)整合宿主因子(IHF)、FIS和切除酶(Xis)所識(shí)別。見(jiàn)Landy，Current Opinion in Biotechnology3699-707(1993)。
重組克隆(Recombinational Cloning)本文所用重組克隆是指例如描述于美國(guó)專利5,888,732(其內(nèi)容完整地并入本文作為參考)中的一種方法，通過(guò)該方法核酸分子或這些分子群體的區(qū)段可以在體外或體內(nèi)被交換、插入、置換、替代或修飾。優(yōu)選地，該克隆方法是一種體外方法。
抑制盒本文所用抑制盒是指存在于亞克隆載體中含有阻遏子或選擇標(biāo)記的一段核酸區(qū)段。
選擇標(biāo)記本文所用選擇標(biāo)記是指通常在特定條件下，允許選出或選擇除去含有它的分子(如復(fù)制子)或細(xì)胞的一段核酸區(qū)段。這些標(biāo)記可以編碼一種活性，例如，但不限于，產(chǎn)生RNA、肽或蛋白質(zhì)；或可以提供RNA、肽、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)和有機(jī)化合物或組合物等的結(jié)合位點(diǎn)。選擇標(biāo)記的例子包括但不限于(1)所編碼產(chǎn)物提供對(duì)抗毒性化合物的抗性(如抗生素)的DNA區(qū)段；(2)所編碼產(chǎn)物為受體細(xì)胞中否則將缺少的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(例如tRNA基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記)；(3)所編碼產(chǎn)物抑制基因產(chǎn)物活性的DNA區(qū)段；(4)所編碼產(chǎn)物可以容易地得到鑒別(例如，表型標(biāo)記如β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)、和細(xì)胞表面蛋白)的DNA區(qū)段；(5)與否則將有害于細(xì)胞生存和/或功能的產(chǎn)物結(jié)合的DNA區(qū)段；(6)抑制以上1-5項(xiàng)所述任何DNA區(qū)段的活性的DNA區(qū)段(例如反義寡核苷酸)；(7)與修飾底物的產(chǎn)物(例如限制性內(nèi)切酶)結(jié)合的DNA區(qū)段；(8)能夠用于分離或鑒定期望分子的DNA區(qū)段(例如特異蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn))；(9)編碼可能是非功能性的特異核苷酸序列(例如，用于分子亞群的PCR擴(kuò)增)的DNA區(qū)段；(10)當(dāng)缺少時(shí)，將直接或間接地賦予對(duì)特定化合物的抗性或敏感性的DNA區(qū)段；和/或(11)所編碼產(chǎn)物在受體細(xì)胞中具有毒性的DNA區(qū)段。
選擇方案本文所用選擇方案是指允許從混合物中選出、富集、或鑒定一種或多種期望產(chǎn)物或一種或多種分子的任何方法。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇方案導(dǎo)致僅選出、富集一或多種期望產(chǎn)物或分子。正如此處所定義的，選擇DNA分子包括(a)選擇或富集期望DNA分子的存在量，和(b)選擇除去或減少不屬于期望DNA分子的DNA分子的存在量。
一個(gè)實(shí)施方案中，選擇方案(可以逆向進(jìn)行)可以采取三種形式中的一種，這將參照
圖1來(lái)進(jìn)行討論。此處以選擇標(biāo)記和針對(duì)它的阻遏子來(lái)舉例，第一種選出含有區(qū)段D和缺少區(qū)段C的分子。第二種選擇除去含有區(qū)段C的分子并選出含有區(qū)段D的分子。第二種形式的可能實(shí)施方案將具有帶有對(duì)于體外反應(yīng)產(chǎn)物待導(dǎo)入的細(xì)胞而言有毒性的基因的DNA片段。毒性基因可以是表達(dá)為毒性基因產(chǎn)物(毒性蛋白質(zhì)或RNA)的DNA，或可以是本身自然就具有毒性。(后一情況中，毒性基因應(yīng)理解為帶有其“可遺傳性狀”的典型定義。)這些毒性基因產(chǎn)物的例子是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于限制性內(nèi)切酶(如DpnI)、胸苷激酶(TK)基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(如ASK1或bcl-2/ced-9家族成員)、逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因包括人免疫缺陷病毒(HIV)的那些基因、防衛(wèi)素如NP-1、反向重復(fù)或成對(duì)的回文DNA序列、噬菌體的裂解基因如來(lái)自fX174或噬菌體T4的那些；抗生素敏感性基因如rpsL、抗微生物劑敏感性基因如pheS、質(zhì)粒致死基因(Killer gene)、所產(chǎn)生的基因產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞有毒的真核轉(zhuǎn)錄載體基因如GATA-1、和在缺少抑制功能時(shí)殺死宿主的基因如kicB、ccdB、fx174E(Liu，Q.等，Curr.Biol.81300-1309(1998))、及負(fù)面影響復(fù)制子穩(wěn)定性和/或復(fù)制的其它基因?；蛘?，毒性基因可以是在體外可選擇的，例如限制性位點(diǎn)。
可操作地與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子連接的、編碼限制性內(nèi)切酶的許多基因是已知，可以將它們用于本發(fā)明。見(jiàn)，如美國(guó)專利4,960,707(DpnI和DpnII)；5,000,333、5,082,784和5,192,675(KpnI)；5,147,800(NgoAIII和NgoAI)；5,179,015(FspI和HaeIII)；5,200,333(HaeII和TaqI)；5,248,605(HpaII)；5,312,746(ClaI)；5,231,021和5,304,480(XhoI和XhoII)；5,334,526(AluI)；5,470,740(NsiI)；5,534,428(SstI/SacI)；5,202,248(NcoI)；5,139,942(NdeI)；和5,098,839(PacI)。也參見(jiàn)Wilson，G.G.，Nucl.Acids Res.192539-2566(1991)；和Lunnen，K.D.等，Gene 7425-32(1988)。
在第二種形式中，區(qū)段D帶有選擇標(biāo)記。該毒性基因?qū)⑶宄性撦d體供體、共合體和副產(chǎn)物分子的轉(zhuǎn)化體，同時(shí)選擇標(biāo)記可以用于選出含有產(chǎn)物的細(xì)胞和選擇除去僅含有插入片段供體的細(xì)胞。
第三種形式選出在同一分子上順式含有區(qū)段A和D的細(xì)胞，而非在不同分子上反式含有這兩個(gè)區(qū)段的細(xì)胞。這可以通過(guò)分成兩個(gè)無(wú)活性片段(分別在區(qū)段A和D上)的選擇標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些片段相對(duì)重組位點(diǎn)按一定方式排列，以致當(dāng)這些區(qū)段被重組事件帶到一起時(shí)，它們可以重新構(gòu)成一個(gè)功能性選擇標(biāo)記。例如，重組事件可以將啟動(dòng)子和結(jié)構(gòu)核酸分子(例如基因)連接在一起，可以將一個(gè)結(jié)構(gòu)核酸分子的兩個(gè)片段連接在一起，或可以將編碼存活所需異二聚體基因產(chǎn)物的核酸分子連接在一起，或可以將一個(gè)復(fù)制子的各部分連接在一起。
位點(diǎn)特異性重組酶本文所用位點(diǎn)特異性重組酶是指一類典型具有至少以下4種活性(或其組合)的重組酶(1)識(shí)別一或兩個(gè)特異核酸序列；(2)切割所述序列；(3)參與鏈交換的拓?fù)洚悩?gòu)酶活性；和(4)重新縫合切割的核酸鏈的連接酶活性。見(jiàn)Sauer，B.，Current Opinions inBiotechnology 5521-527(1994)。保守性位點(diǎn)特異性重組不同于同源重組和轉(zhuǎn)座，因?yàn)樗鼘?duì)于兩個(gè)參加者具有高度特異性。鏈交換機(jī)制涉及特異DNA序列的切割和重新連接，而沒(méi)有DNA的合成(Landy，A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58913-949)。
結(jié)構(gòu)基因正如本文所用，結(jié)構(gòu)基因是指可以被轉(zhuǎn)錄為隨后可翻譯成特異多肽所特征性的氨基酸序列的信使RNA的核酸序列。
亞克隆載體本文所用，亞克隆載體是指包含一個(gè)環(huán)狀或線性核酸分子的克隆載體，其優(yōu)選包括一個(gè)適當(dāng)?shù)膹?fù)制子。本發(fā)明中，亞克隆載體(
圖1中區(qū)段D)還可以含有期望摻入終產(chǎn)物中作用于克隆的DNA插入片段(
圖1中區(qū)段A)或與克隆的DNA插入片段一起作用的功能性和/或調(diào)節(jié)元件。亞克隆載體還可以含有選擇標(biāo)記。
靶核酸分子正如本文所用，靶核酸分子是指使用本發(fā)明所作用的目的核酸區(qū)段(優(yōu)選DNA)。
模板正如本文所用，模板是指待擴(kuò)增、合成或測(cè)序的雙鏈或單鏈核酸分子。對(duì)于雙鏈DNA分子，在可以對(duì)這些分子進(jìn)行擴(kuò)增、合成或測(cè)序之前將其雙鏈變性以形成第一和第二鏈，或可以直接使用該雙鏈分子作為模板。對(duì)于單鏈模板，和模板的至少一個(gè)部分互補(bǔ)的引物在適合的條件下進(jìn)行雜交，然后具有聚合酶活性的一或多種多肽(例如DNA聚合酶和/或逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄酶)可以合成與該模板的全部或部分互補(bǔ)的分子。或者，對(duì)于雙鏈模板，可以聯(lián)合使用一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(例如一或多個(gè)啟動(dòng)子)和一或多個(gè)聚合酶，以制備與模板的全部或部分互補(bǔ)的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，新合成的分子可以和最初模板等長(zhǎng)或比最初模板短。在新合成分子的合成或延伸過(guò)程中的錯(cuò)配摻入或鏈滑移(strand slippage)可以導(dǎo)致一或多個(gè)錯(cuò)配堿基。因此，合成的分子不一定完全和模板互補(bǔ)。此外，可以在合成或擴(kuò)增過(guò)程中使用一群核酸模板以產(chǎn)生一群典型地代表初始模板群的核酸分子。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列本文所用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是指核酸分子上所包含的以任何構(gòu)型或幾何形狀存在的功能性核苷酸鏈，該序列的作用是調(diào)節(jié)一或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因向信使RNA的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括，但不限于，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻遏子等。“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”、“轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)”和“轉(zhuǎn)錄信號(hào)”可以互換使用。
載體正如本文所用，載體是指給插入片段提供有用的生物學(xué)或生物化學(xué)性質(zhì)的核酸分子(優(yōu)選DNA)。例子包括質(zhì)粒、噬菌體、自主復(fù)制序列(ARS)、著絲粒、和能夠在體外或在宿主細(xì)胞中復(fù)制或被復(fù)制、或能夠?qū)⑵谕怂釁^(qū)段遞送至宿主細(xì)胞內(nèi)的期望位置的其它序列。載體可以具有一或多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，在該位點(diǎn)處序列可以以可確定的方式被切開(kāi)而不喪失載體的基本生物功能，而且可以在此位點(diǎn)處拼接入核酸片段以便造成其復(fù)制和克隆。載體還可以提供引物位點(diǎn)(例如為PCR)、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始和/或調(diào)節(jié)位點(diǎn)、重組信號(hào)、復(fù)制子、選擇標(biāo)記等。明顯地，根據(jù)本發(fā)明，還可以應(yīng)用不要求使用同源重組、轉(zhuǎn)座或限制性酶的插入期望核酸片段的方法(例如，但不限于，PCR片段的UDG克隆(美國(guó)專利5,334,575，完整地并入本文作為參考)、TA克隆等)，以將片段克隆至待使用的克隆載體中。克隆載體還可以含有一或多個(gè)適用于鑒定轉(zhuǎn)化了克隆載體的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。
載體供體正如本文所用，載體供體是指本發(fā)明兩個(gè)親本核酸分子(例如RNA或DNA)之一，其帶有包含了將成為期望產(chǎn)物一部分的載體的區(qū)段。載體供體包含亞克隆載體D(或如果插入片段供體沒(méi)有已經(jīng)含有克隆載體，則可以將其稱作克隆載體)和重組位點(diǎn)包圍的區(qū)段C(見(jiàn)
圖1)。區(qū)段C和/或D可以含有按上述選擇方案有助于選擇期望子代產(chǎn)物分子的元件。重組信號(hào)可以相同或不同，并可以被相同或不同的重組酶作用。此外，載體供體可以是線性或環(huán)狀。
本文所用的重組DNA技術(shù)和分子及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中使用的其它術(shù)語(yǔ)一般可以被適用領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解。概要本發(fā)明涉及通過(guò)將至少一個(gè)整合序列(例如轉(zhuǎn)座子)插入靶核酸分子中、隨后采用重組克隆將該修飾的靶核酸分子轉(zhuǎn)移至載體，對(duì)核酸分子(RNA或DNA)進(jìn)行的構(gòu)建。根據(jù)本發(fā)明，重組克隆使得可以有效篩選和鑒定含有包含了整合序列的全部或部分的靶序列的分子(尤其是載體)。因此，可以將目的位點(diǎn)或序列(整合序列所包含的)插入靶序列中，以便對(duì)靶核酸分子作進(jìn)一步操作。待導(dǎo)入靶核酸分子內(nèi)的本發(fā)明整合序列可以包含任何數(shù)量或組合的功能性序列，例如引物位點(diǎn)(如引物如測(cè)序引物或擴(kuò)增引物可以與之雜交以起始核酸合成、擴(kuò)增或測(cè)序的序列)、轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)或調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、實(shí)現(xiàn)翻譯的序列如Kozak和Shine-Delgarno序列、起始密碼子、復(fù)制起點(diǎn)、終止信號(hào)如終止密碼子、重組位點(diǎn)(或其部分)、選擇標(biāo)記、和構(gòu)建(例如N端或羧基端)蛋白質(zhì)融合物的基因或基因的部分如GST、GUS、GFP和它們的組合。插入這些目的序列后，可以一各種方式操作這些分子，這些方法包括對(duì)靶序列的全部或部分進(jìn)行測(cè)序或擴(kuò)增(即，通過(guò)使用整合序列所導(dǎo)入的至少一或多個(gè)引物位點(diǎn))、突變靶序列(即，通過(guò)插入、缺失或替代靶序列)、和從靶序列或部分表達(dá)蛋白質(zhì)(即，通過(guò)插入翻譯和/或轉(zhuǎn)錄信號(hào))。
本發(fā)明還涉及通過(guò)在分子中插入含重組位點(diǎn)的整合序列以及進(jìn)行重組克隆或造成插入的重組位點(diǎn)的重組，來(lái)克隆核酸分子(例如基因組DNA或cDNA)。因此，可以將一或多個(gè)包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)的整合序列插入目的分子內(nèi)，以便允許重組克隆或克隆該分子或其部分。在此方面，整合序列還可以包含其它目的功能性序列(例如引物位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)、終止信號(hào)、選擇標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)等，見(jiàn)上述)，以允許對(duì)通過(guò)本發(fā)明方法獲得的分子作進(jìn)一步操作。
用于本發(fā)明的重組位點(diǎn)可以是參與重組反應(yīng)的任何識(shí)別序列。這些重組位點(diǎn)可以相同或不同，并可以是野生型或天然存在的重組位點(diǎn)或是修飾的或突變的重組位點(diǎn)。本發(fā)明所用重組位點(diǎn)的例子包括，但不限于，λ噬菌體的重組位點(diǎn)(如attP、attB、attL和attR及它們的突變體或衍生物)和來(lái)自其它噬菌體如P1、phi80、P22、P2、186、P4和P1的重組位點(diǎn)(包括lox位點(diǎn)如loxP和loxP511)。根據(jù)本發(fā)明可以使用這些系統(tǒng)的相應(yīng)重組蛋白以及指明的重組位點(diǎn)。提供用于本發(fā)明的重組位點(diǎn)和重組蛋白的其它系統(tǒng)包括釀酒酵母的FLP/FRT系統(tǒng)、解離酶家族(例如gd、Tn3解離酶、Hin、Gin和Cin)、和IS231和其它蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的可轉(zhuǎn)座元件。本發(fā)明所用的優(yōu)選重組蛋白質(zhì)和突變或修飾的重組位點(diǎn)包括描述于以下文獻(xiàn)中的那些美國(guó)專利5,888,732、共同待決的美國(guó)申請(qǐng)09/438,358(1991年11月12日提交)和共同待決的美國(guó)申請(qǐng)09/517,466(2000年3月2日提交)，以及與可從Invitrogen Corporation，Life Technologies Division(Rockville，MD)獲得的GATEWAYTM克隆技術(shù)有關(guān)的那些。整合序列本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何整合序列均可以用于實(shí)施本發(fā)明。整合序列在本領(lǐng)域中又稱作可動(dòng)遺傳因子。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，整合序列可以是轉(zhuǎn)座子(可轉(zhuǎn)座元件)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何轉(zhuǎn)座子序列均可以適合用于本發(fā)明。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子包括，但不限于，Tn3家族轉(zhuǎn)座子、Tn3、TnA、gd、Tn1000、Tn5、Tn1721、Tn7、Tn9、Tn10和它們的衍生物和突變體。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，整合序列可以是整合性病毒。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，整合性病毒可以是λ類噬菌體。λ類噬菌體被發(fā)現(xiàn)包括，但不限于，大腸桿菌噬菌體如1、21、434、f80和HK022以及沙門氏菌(Salmonella)噬菌體如P22。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，整合性病毒可以是與l無(wú)關(guān)的噬菌體，如Mu-1、P2和P4。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它整合性病毒也可以用于實(shí)施本發(fā)明。
在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，整合序列可以是IS元件如IS1、IS2、IS4、IS5和它們的衍生物和突變體。在其它實(shí)施方案中，整合序列可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)座子、果蠅的P元件、細(xì)菌毒力因子或真核生物的可動(dòng)遺傳因子如mariner、Tc1和Sleeping Beauty。根據(jù)本發(fā)明，也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它可動(dòng)遺傳因子。復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)(ori)是核酸分子中核酸分子起始復(fù)制處的核酸序列。正如本文所用，注意詞復(fù)制起點(diǎn)包括可定義的復(fù)制起點(diǎn)以及核酸分子復(fù)制所必需的一或多個(gè)相鄰控制元件。復(fù)制過(guò)程中DNA合成的可定義起始點(diǎn)和相鄰控制元件或多個(gè)元件的這種組合也可以被稱作復(fù)制子。適合用于本發(fā)明的復(fù)制子包括，但不限于，pMB1復(fù)制子、p15A復(fù)制子、pSC101復(fù)制子、ColE1復(fù)制子、R6K復(fù)制子、F復(fù)制子、P1復(fù)制子、Rts1復(fù)制子、pColV-K30復(fù)制子、ldv復(fù)制子、pIP522復(fù)制子、R1162/RSF1010復(fù)制子、RK2復(fù)制子、pSa復(fù)制子和RA1復(fù)制子。適于實(shí)施本發(fā)明的復(fù)制子并不限于那些在大腸桿菌中起作用的復(fù)制子。在其它生物中起作用的復(fù)制子包括，但不限于，PS10復(fù)制子、pCTTI復(fù)制子、pWV02復(fù)制子、pF3A復(fù)制子和pIP404復(fù)制子。適用于真核細(xì)胞，包括但不限于昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞或下述的所有宿主細(xì)胞，的復(fù)制子可以聯(lián)合本發(fā)明使用。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明一或多個(gè)核酸分子或載體，尤其是此處描述的那些核酸分子和載體，的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明此方面可以使用的代表性宿主細(xì)胞包括，但不限于，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、和動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括埃希氏菌屬(Escherichiaspp.)細(xì)胞(尤其是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，最尤其是大腸桿菌菌株DH10B、Stbl2、DH5α、DB3、DB3.1(優(yōu)選大腸桿菌LIBRARY EFFICIENCYDB3.1TM感受態(tài)細(xì)胞；Invitrogen Corporation，Life TechnologiesDivision，Rockville，MD)、DB4和DB5(參見(jiàn)2000年3月2日提交的美國(guó)申請(qǐng)518,188，其公開(kāi)文本完整地并入本文作為參考)、大腸桿菌W菌株如1999年6月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/139,889描述的那些)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)細(xì)胞(尤其是枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)細(xì)胞)、鏈霉菌屬(Streptomyces spp.)細(xì)胞、歐文氏桿菌屬(Erwinia spp.)細(xì)胞、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella spp.)細(xì)胞、沙雷氏菌屬(Serratia spp.)細(xì)胞(尤其是粘質(zhì)沙雷氏菌(S.marcessans)細(xì)胞)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)細(xì)胞(尤其是銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)細(xì)胞)、和沙門氏菌屬(Salmonella spp.)細(xì)胞(尤其是鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和傷寒沙門氏菌(S.typhi)細(xì)胞)。優(yōu)選的動(dòng)物宿主細(xì)胞包括昆蟲(chóng)細(xì)胞(最尤其是Drosophila melanogaster細(xì)胞、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)Sf9和Sf21細(xì)胞、及粉紋夜蛾(Trichoplusa)High-Five細(xì)胞)、線蟲(chóng)細(xì)胞(尤其是C.elegans細(xì)胞)、鳥(niǎo)類細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞(尤其是滑爪蟾(Xenopus laevis)細(xì)胞)、爬行動(dòng)物細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(最尤其是CHO、COS、VERO、BHK和人細(xì)胞)。優(yōu)選的酵母細(xì)胞包括釀酒酵母細(xì)胞和巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)細(xì)胞。這些和其它適合的宿主細(xì)胞均可以從商業(yè)途徑獲得，例如從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division(Rockville，Mayland)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Virginia)、和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL；Peoria，Illinois)購(gòu)買獲得。
向此處所述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的核酸分子和/或載體，以產(chǎn)生包含本發(fā)明一或多個(gè)核酸分子和/或載體的方法將是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的。例如，可以使用感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的熟知技術(shù)，向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明核酸分子和/或載體?；蛘撸梢砸猿恋淼男问嚼缌姿徕}沉淀的形式，或和脂形成復(fù)合物的形式，向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明核酸分子和/或載體。也可以使用電穿孔將本發(fā)明核酸分子和/或載體導(dǎo)入宿主中。同樣，可以將此類分子導(dǎo)入化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，尤其是大腸桿菌W細(xì)胞。如果載體是病毒，則可以體外對(duì)其進(jìn)行包裝或?qū)⑵鋵?dǎo)入包裝細(xì)胞中，然后可以將包裝病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞中。因此，根據(jù)本發(fā)明的此方面，適于將本發(fā)明核酸分子和/或載體導(dǎo)入細(xì)胞中的廣泛多種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的和常規(guī)的。在以下文獻(xiàn)中對(duì)這些技術(shù)作了詳細(xì)的綜述Sambrook，J.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)第2版，Cold Spring Hatbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press，第16.30-16.55頁(yè)(1989)；Watson J.D.等，重組DNA(Recombinant DNA)第2版，紐約W.H.Freeman and Co.，第213-234頁(yè)(1992)；和Winnacker，E.-L.，從基因到克隆(From Genes to Clones)，紐約VCH Publishers(1987)，這些是詳細(xì)描述這些技術(shù)的許多實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)的例子，為了它們的相關(guān)公開(kāi)，將它們完整地并入本文作為參考。聚合酶本發(fā)明所用聚合酶包括但不限于聚合酶(DNA和RNA聚合酶)和逆轉(zhuǎn)錄酶。DNA聚合酶包括，但不限于，嗜熱杠熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neopolitana)(Tne)DNA聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis(Tli或VENTTM)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶、DEEPVENTTMDNA聚合酶、Pyrococcus woosii(Pwo)DNA聚合酶、火球菌屬物種(Pyrococcus sp)KOD2(KOD)DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus sterothermophilus)(Bst)DNA聚合酶、Bacilluscaldophilus(Bca)DNA聚合酶、酸熱硫化熱菌(Sulfolobusacidoaldarius)(Sac)DNA聚合酶、嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)(Tac)DNA聚合酶、黃棲熱菌(Thermus flavus)(Tfl/Tub)DNA聚合酶、紅棲熱菌(Thermus ruber)(Tru)DNA聚合酶、Thermusbrockianus(DYNAZYMETM)DNA聚合酶、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth)DNA聚合酶、分枝桿菌屬(mycobacterium)DNA聚合酶(Mtb，Mlep)、大腸桿菌pol I DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、和一般的pol I型DNA聚合酶和它們的突變體、變體和衍生物。RNA聚合酶例如T3、T5和SP6及它們的突變體、變體和衍生物也均可以用于本發(fā)明。
本發(fā)明所用核酸聚合酶可以是中溫的或嗜熱的，優(yōu)選嗜熱的。優(yōu)選的中溫DNA聚合酶包括可以從以下生物分離的所有DNA聚合酶的Pol I家族(和它們相應(yīng)的Klenow片段)如大腸桿菌、流感嗜血桿菌(H.influenzae)、D.radiodurans、H.pylori、C.auratiacus、R.prowazekii、T.pallidum、Synechocystis sp.、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、L.lactis、S.pneumoniae、M.tuberculosis、M.leprae、M.smegmatis、噬菌體L5、phi-C31、T7、T3、T5、SP01、SP02、釀酒酵母(S.cerevisiae)MIP-1、和真核生物C.elegans及D.melanogaster(Astatke，M.等，1998，J.Mol.Biol.278，147-165)的線粒體；分離自任何來(lái)源的pol III型DNA聚合酶，以及它們的突變體、衍生物或變體，等。可以在本發(fā)明方法和組合物中使用的優(yōu)選熱穩(wěn)定DNA聚合酶包括Taq、Tne、Tma、Pfu、KOD、Tfl、Tth、Stoffel片段、VENTTM及DEEPVENTTMDNA聚合酶、和它們的突變體、變體和衍生物(美國(guó)專利5,436,149；美國(guó)專利4,889,818；美國(guó)專利4,965,188；美國(guó)專利5,079,352；美國(guó)專利5,614,365；美國(guó)專利5,374,553；美國(guó)專利5,270,179；美國(guó)專利5,047,342；美國(guó)專利5,512,462；WO92/06188；WO92/06200；WO96/10640；WO97/09451；Barnes，W.M.，Gene，11229-35(1992)；Lawyer，F(xiàn).C.等，PCR Meth.Appl.2275-287(1993)；Flaman，J.M.等，Nucl.Acids Res.22(15)3259-3260(1994))。
用于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶包括任何具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶。這些酶包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶、乙型肝炎病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、花椰菜花葉病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶、細(xì)菌的逆轉(zhuǎn)錄酶、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(Saiki，R.K.等，Science 239487-491(1988)；美國(guó)專利4,889,818和4,965,188)、Tne DNA聚合酶(WO96/10640和WO97/09451)、Tma DNA聚合酶(美國(guó)專利5,374,553)和它們的突變體、變體或衍生物(參見(jiàn)例如WO97/09451和WO98/47912)。用于本發(fā)明的優(yōu)選酶包括RNase H活性降低、基本上降低或消除了的那些酶?！癛NaseH活性基本降低”的酶是指該酶具有相應(yīng)野生型或RNase H+酶(如野生型Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)、禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)或Rous肉瘤病毒(RSV)逆轉(zhuǎn)錄酶)的RNase H活性的不到約20％、更優(yōu)選不到約15％、10％或5％、最優(yōu)選不到約2％。任何酶的RNase H活性均可以通過(guò)多種測(cè)試方法來(lái)確定，這些方法例如描述于如美國(guó)專利5,244,797；Kotewicz，M.L.等，Nucl.Acids.Res.16265(1988)；和Gerard，G.F.等，F(xiàn)OCUS14(5)91(1992)中的那些，所有這些文獻(xiàn)的公開(kāi)文本均完整地并入本文作為參考。用于本發(fā)明的尤其優(yōu)選多肽包括，但不限于，M-MLVH-逆轉(zhuǎn)錄酶、RSVH-逆轉(zhuǎn)錄酶、AMVH-逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV(Rous相關(guān)病毒)H-逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV(成髓細(xì)胞瘤相關(guān)病毒)H-逆轉(zhuǎn)錄酶、HIVH-逆轉(zhuǎn)錄酶。(參見(jiàn)美國(guó)專利5,244,797和WO98/47912)。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，能夠從核糖核酸分子產(chǎn)生DNA分子(即具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性)的任何酶均可以同等地用于本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒中。
用于本發(fā)明的具有聚合酶活性的酶可以從商業(yè)途徑獲得，例如從Invitrogen Corporation，Life Technologies Division(Rockville，Maryland)；Perkin-Elmer(Branchburg，New Jersey)；New EnglandBiolabs(Beverly，Massachusetts)；或Boehringer MannheimBiochemicals(Indianapolis，Indiana)獲得。用于本發(fā)明的具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶可以從商業(yè)途徑獲得，例如從Invitrogen Corporation，Life Technologies Division(Rockville，Maryland)；Pharmacia(Piscataway，New Jersey)；Sigma(Saint Louis，Missouri)；或Boehringer Mannheim Biochemicals(Indianapolis，Indiana)獲得?；蛘?，可以根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的分離和純化天然蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)程序(參見(jiàn)例如Houts，G.E.等，J.Virol.29517(1979))，從其天然病毒或細(xì)菌來(lái)源分離具有聚合酶活性的聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。此外，這些聚合酶/逆轉(zhuǎn)錄酶可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的重組DNA技術(shù)來(lái)制備(參見(jiàn)例如Kotewicz，M.L.等，Nucl.Acids Res.16265(1988)；美國(guó)專利5,244,797；WO98/47912；Soltis，D.A.和Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853372-3379(1988))。具有聚合酶活性和逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶的例子包括本申請(qǐng)中描述的所有那些。核酸合成、擴(kuò)增和測(cè)序的方法本發(fā)明可以聯(lián)合涉及核酸分子如DNA(包括cDNA)和RNA分子合成的任何方法一起應(yīng)用。這些方法包括，但不限于，核酸合成方法、核酸擴(kuò)增方法和核酸測(cè)序方法。
根據(jù)本發(fā)明的此方面，核酸合成方法可以包含一或多個(gè)步驟。例如，本發(fā)明提供合成核酸分子的方法，其包括(a)將核酸模板(例如，包含整合序列的靶分子)和一或多個(gè)引物和一或多個(gè)具有聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶活性的酶混合，以形成混合物；和(b)在足以產(chǎn)生和模板的全部或部分互補(bǔ)的第一核酸分子的條件下，溫育該混合物。根據(jù)本發(fā)明的此方面，核酸模板可以是DNA分子如cDNA分子或文庫(kù)，或RNA分子如mRNA分子。足以允許合成發(fā)生的條件如pH、溫度、離子強(qiáng)度和孵育時(shí)間可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)優(yōu)化。
根據(jù)本發(fā)明，可以從獲自天然來(lái)源如各種細(xì)胞、組織、器官或生物的核酸分子制備靶或模板核酸分子或文庫(kù)。可以用作核酸分子來(lái)源的細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(細(xì)菌細(xì)胞，包括埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、葡萄球菌屬(Staphlococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、衣原體(Chlamydia)、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、密螺旋體屬(Treponema)、支原體(Mycoplasma)、疏螺旋體屬(Borrelia)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、螺桿菌屬(Helicobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、和鏈霉菌屬(Streptomyces)的物種的那些細(xì)胞)，或真核細(xì)胞(包括真菌(特別是酵母的)、植物、原生動(dòng)物及其它寄生物、和動(dòng)物包括昆蟲(chóng)(尤其是果蠅屬細(xì)胞)、線蟲(chóng)(尤其是Caenorhabditis elegans的細(xì)胞)、和哺乳動(dòng)物(尤其是人細(xì)胞)的細(xì)胞)。
當(dāng)然，可以有利地使用的其它核酸合成技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是易于明了的。
在本發(fā)明其它方面，本發(fā)明可以聯(lián)合擴(kuò)增或測(cè)序核酸分子的方法一起應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的此方面，核酸擴(kuò)增方法可以包括在本領(lǐng)域一般已知稱為一步(例如一步RT-PCR)或兩步(例如兩步RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄酶-擴(kuò)增反應(yīng)的方法中，應(yīng)用一或多個(gè)具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的多肽。對(duì)于長(zhǎng)核酸分子(即長(zhǎng)度大于約3-5Kb)的擴(kuò)增，可以使用DNA聚合酶的組合，參見(jiàn)WO98/06736和WO95/16028。
根據(jù)本發(fā)明，擴(kuò)增方法可以包含一或多個(gè)步驟。例如，本發(fā)明提供用于擴(kuò)增核酸分子的方法，包含(a)將一或多個(gè)具有聚合酶活性的酶與一或多個(gè)核酸模板(例如包含整合序列的靶分子)混合；和(b)在足以允許具有聚合酶活性的酶擴(kuò)增與模板的全部或部分互補(bǔ)的一或多個(gè)核酸分子的條件下，孵育該混合物。本發(fā)明還提供通過(guò)這些方法擴(kuò)增的核酸分子。
擴(kuò)增和分子核酸分子或片段的一般方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,683,195；4,683,202；和4,800,159；Innis，M.A.等編，PCR實(shí)驗(yàn)指南方法和應(yīng)用的指導(dǎo)(PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications)，San Diego，CaliforniaAcademic Press，Inc.(1990)；Griffin，H.G.和Griffin，A.M.編，PCR技術(shù)當(dāng)前的創(chuàng)新(PCR TechnologyCurrent Innovations)，Boca Raton，F(xiàn)lorida；CRCPress(1994))。例如，根據(jù)本發(fā)明可以使用的擴(kuò)增方法包括PCR(美國(guó)專利4,683,195和4,683,292)、鏈置換擴(kuò)增(SDA；美國(guó)專利5,455,166；EP0684315)、和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA；美國(guó)專利5,409,818；EP0329822)。
典型地，這些擴(kuò)增方法包括(a)將一或多個(gè)具有聚合酶活性的酶與核酸樣品在存在一或多個(gè)引物序列的情況下混合；和(b)優(yōu)選通過(guò)PCR或等價(jià)的自動(dòng)擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增該核酸樣品以產(chǎn)生大量擴(kuò)增的核酸片段。
通過(guò)本發(fā)明方法進(jìn)行擴(kuò)增或合成后，可以分離擴(kuò)增的或合成的核酸片段作進(jìn)一步使用或表征。該步驟通?？梢酝ㄟ^(guò)借助大小或任何物理或生物化學(xué)方法包括凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、層析(包括分子篩、親和和免疫層析)、密度梯度離心和免疫吸附，分離擴(kuò)增的或合成的核酸片段來(lái)完成。尤其優(yōu)選通過(guò)凝膠電泳分離核酸片段，因?yàn)樗峁┝丝焖俸透咧貜?fù)性地靈敏分離許多核酸片段的手段、并允許直接同時(shí)地比較幾個(gè)核酸樣品中的這些片段。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，可以擴(kuò)展該方法以分離和表征這些片段或任何通過(guò)本發(fā)明方法擴(kuò)增或合成的核酸片段。因此，本發(fā)明還指向通過(guò)本發(fā)明擴(kuò)增或合成方法產(chǎn)生的分離的核酸分子。
在該實(shí)施方案中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如電洗脫或物理切除，從用于鑒定的凝膠(見(jiàn)上)上取出一或多個(gè)擴(kuò)增的或合成的核酸片段。然后將這些分離的單一核酸片段插入適于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化多種原核(細(xì)菌)或真核(酵母、植物或動(dòng)物包括人和其它哺乳動(dòng)物)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)載體包括表達(dá)載體中。或者，還可以通過(guò)例如測(cè)序(即，確定核酸片段的核苷酸序列)、通過(guò)以下描述的方法和本領(lǐng)域的其它標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)指向DNA測(cè)序方法的美國(guó)專利4,962,022和5,498,523)，表征本發(fā)明方法所制備的核酸分子。
根據(jù)本發(fā)明，核酸測(cè)序方法可以包含一或多個(gè)步驟。例如，本發(fā)明可以和用于測(cè)序核酸分子的方法聯(lián)合應(yīng)用。該方法包含(a)將具有聚合酶活性的酶和待測(cè)序的核酸分子、一或多個(gè)引物、一或多個(gè)核苷酸、及一或多個(gè)終止劑(例如雙脫氧核苷酸)混合，以形成混合物；(b)在足以合成和待測(cè)序的分子的全部或部分互補(bǔ)的一群分子的條件下，孵育該混合物；和(c)分離該群體以確定待測(cè)序分子的全部或部分核苷酸序列。
可以使用的核酸測(cè)序技術(shù)包括例如描述于美國(guó)專利4,962,022和5,498,523公開(kāi)的那些雙脫氧測(cè)序方法。試劑盒另一方面，本發(fā)明提供可以和本發(fā)明一起使用的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明此方面的試劑盒可以包含一或多個(gè)容器，這些容器可以含有選自下組的一或多個(gè)成分一或多個(gè)本發(fā)明的核酸分子或載體、一或多個(gè)聚合酶、一或多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶、一或多個(gè)插入催化酶、一或多個(gè)重組蛋白(或其它實(shí)施本發(fā)明方法的酶)、一或多個(gè)緩沖液、一或多個(gè)去污劑、一或多個(gè)限制性內(nèi)切酶、一或多個(gè)核苷酸、一或多個(gè)終止劑(例如ddNTP)、一或多個(gè)轉(zhuǎn)染劑、焦磷酸酶等。本發(fā)明試劑盒還可以包含實(shí)施本發(fā)明的說(shuō)明書。
相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了，依據(jù)普通技術(shù)人員已知的知識(shí)從本文所包含的本發(fā)明描述出發(fā)，對(duì)本文所述方法和應(yīng)用的其它適合修改和改變將是十分明了的，而且可以進(jìn)行這些適合修改和改變而不偏離本發(fā)明范圍或它的任何實(shí)施方案。目前我們已詳細(xì)描述了本發(fā)明，通過(guò)參考以下實(shí)施例可以更清楚地理解本發(fā)明，由此為了舉例說(shuō)明的目的包括這些實(shí)施例，它們并不旨在限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建含轉(zhuǎn)座子的靶DNA分子根據(jù)GATEWAYTM克隆系統(tǒng)的方法和程序(參見(jiàn)美國(guó)專利5,888,732、美國(guó)專利申請(qǐng)09/438,358和09/517,466，和題為GATEWAYTM克隆技術(shù)的說(shuō)明書手冊(cè)(第1和2版本)，所有這些均完整地并入本文作為參考)，按照所述，將靶分子克隆至適于重組克隆的第一載體中。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將靶DNA分子插入適當(dāng)載體中以便靶分子被重組位點(diǎn)包圍。在一些方案中，重組位點(diǎn)不能夠彼此重組。使含有靶的第一載體與如下溶液接觸，該溶液含有整合序列如轉(zhuǎn)座子、適當(dāng)?shù)妮o因子如緩沖鹽、離子等、及催化整合序列插入靶DNA分子中的酶?；蛘?，可以在體內(nèi)反應(yīng)中將轉(zhuǎn)座子插入靶DNA，例如Strathmann等(Proceedings of the National Academy ofSciences，USA，881247-1250，1991，特此并入本文作為參考)描述的為了插入基于gd的轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移。盡管本實(shí)施例指向體外在靶DNA中插入轉(zhuǎn)座子，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法體外實(shí)施相應(yīng)的反應(yīng)。這些相應(yīng)的方法被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。轉(zhuǎn)座子的DNA序列將包括充當(dāng)插入催化酶底物的末端序列，而該酶將催化此轉(zhuǎn)座子插入靶DNA分子中。正如以上討論的，插入催化酶也將催化轉(zhuǎn)座子插入載體中。轉(zhuǎn)座反應(yīng)的結(jié)果是一群在載體和靶分子內(nèi)的不同位置插有轉(zhuǎn)座子的分子，見(jiàn)圖2所示。靶DNA序列為兩個(gè)重組位點(diǎn)(RS1和RS2)所包圍。整合序列顯示包含選擇標(biāo)記(SM2)和位于兩末端的引物結(jié)合序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，修飾這些特性和包含其它特性都屬于本發(fā)明的范圍。因?yàn)椴迦敕磻?yīng)是隨機(jī)的，如所示，整合序列可以既插入靶中又插入載體中。
適用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子可以包含一或多個(gè)選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)座子可以包含毒性基因。毒性基因可以是自殺基因，即只要該基因表達(dá)它對(duì)于易感性生物就是致死性的，或者毒性基因可以是條件致死性的，即僅在該基因表達(dá)和存在某種其它因素時(shí)它對(duì)于易感性生物才是致死性的。此外，適用于本發(fā)明測(cè)序方法的轉(zhuǎn)座子可以包含一或多個(gè)適于結(jié)合引物的序列?？梢岳靡锎_定鄰近轉(zhuǎn)座子的靶DNA分子的序列，或可以將引物用于其它目的如PCR。適合的序列可以是任何長(zhǎng)度的，只要引物與待測(cè)序DNA一起孵育時(shí)形成的引物DNA雙鏈體足夠穩(wěn)定以允許隨后的反應(yīng)(即測(cè)序或PCR)進(jìn)行就可以。引物結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)際核苷酸序列并不是關(guān)鍵的，只要已知即可。適合引物結(jié)合序列的選擇和隨后反應(yīng)的適當(dāng)反應(yīng)條件的確定是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)任務(wù)。
適于插入DNA靶分子中以便克隆部分靶的轉(zhuǎn)座子可以包含一或多個(gè)重組位點(diǎn)或其部分。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)座子將含有可以相同或不同的兩個(gè)重組位點(diǎn)。這兩個(gè)位點(diǎn)可以彼此以相反方向存在。
適于克隆應(yīng)用的轉(zhuǎn)座子可以包含復(fù)制起點(diǎn)。一些實(shí)施方案中，可以選擇復(fù)制起點(diǎn)，以便其與用于實(shí)施本發(fā)明的載體的一或多個(gè)的復(fù)制起點(diǎn)相容。這將允許包含來(lái)源于轉(zhuǎn)座子的復(fù)制起點(diǎn)的核酸分子可以在還含有載體的細(xì)胞中穩(wěn)定地維持。在其它實(shí)施方案中，可以選擇復(fù)制起點(diǎn)以便其與載體中的復(fù)制起點(diǎn)不相容。這將有利于將載體和含有核酸分子的轉(zhuǎn)座子分離開(kāi)。復(fù)制起點(diǎn)的序列和特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。適合的復(fù)制起點(diǎn)的例子可以參見(jiàn)Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編，John Wiley and Sons，1994，該文獻(xiàn)特此并入本文作為參考。其它適合的復(fù)制起點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并屬于本發(fā)明的范圍。用于本發(fā)明的復(fù)制起點(diǎn)可以指導(dǎo)含有它們的核酸分子在多種生物中復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，復(fù)制起點(diǎn)可以在原核宿主細(xì)胞如前面討論的那些細(xì)胞中發(fā)揮作用。在其它實(shí)施方案中，復(fù)制起點(diǎn)可以在真核宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用。
適用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子可以含有包括一或多個(gè)充當(dāng)一或多個(gè)限制性酶的底物的位點(diǎn)的DNA序列。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子可以包含充當(dāng)具有罕見(jiàn)切割位點(diǎn)的限制性酶(又稱作“稀有切割酶(rare cutter)”)的底物的位點(diǎn)。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，載體供體還可以為稀有切割酶提供一或多個(gè)位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，可以提供具有兩個(gè)稀有切割酶位點(diǎn)的載體供體，這兩個(gè)位點(diǎn)可以相同或不同而且與重組位點(diǎn)相鄰。
本發(fā)明轉(zhuǎn)座子可以包含以上討論的一個(gè)以上特征。例如，轉(zhuǎn)座子可以包含復(fù)制起點(diǎn)以及重組位點(diǎn)，并還可以包含一或多個(gè)引物結(jié)合序列、選擇標(biāo)記和/或自殺基因。其它有用的特征組合對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是易于明了的，并屬于本發(fā)明范圍。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子與含靶的第一載體在轉(zhuǎn)座反應(yīng)中的摩爾比為從約25∶1至約1∶25。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該摩爾比將從約10∶1至約1∶10。可以改變此摩爾比以便確保將一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入DNA靶中。當(dāng)?shù)谝惠d體的大小比靶大時(shí)，則可能期望具有較高的轉(zhuǎn)座子∶載體比例，以使反應(yīng)偏向于在每個(gè)含靶的第一載體中進(jìn)行多點(diǎn)插入，以便實(shí)現(xiàn)在靶DNA中的插入。相反地，當(dāng)靶DNA的大小比載體大時(shí)，可能期望降低轉(zhuǎn)座子∶載體比例。
典型的體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)物可以含有轉(zhuǎn)座子、含靶的第一載體、離子、緩沖劑等。適合的反應(yīng)條件可以是約100-500ng轉(zhuǎn)座子和約1mg含靶的第一載體。反應(yīng)可以含有濃度在約0.5mM至約250mM的二價(jià)金屬離子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，MgCl2可以是二價(jià)金屬離子的來(lái)源并可以以約1mM至約50mM、更優(yōu)選約5mM至約20mM的濃度存在。反應(yīng)溶液還可以含有濃度在約1mM至約100mM、更優(yōu)選約5mM至約50mM、最優(yōu)選約10mM至約25mM的緩沖劑。適合的緩沖劑是Tris。反應(yīng)溶液還可以含有濃度約0.1mM至約5mM，優(yōu)選約1mM的還原劑如β-巰基乙醇(β-ME)、二巰蘇糖醇(DTT)或二硫赤蘚糖醇(DTE)。反應(yīng)溶液的pH可以從約6.5至約8.5，優(yōu)選約7.5。反應(yīng)溶液可以含有濃度在約1mM至約100mM、優(yōu)選約5mM至約25mM、最優(yōu)選約10mM的一價(jià)陽(yáng)離子。適合的一價(jià)陽(yáng)離子來(lái)源包括KCl和NaCl。一組適合的反應(yīng)條件是15mM MgCl2、10mM Tris·HCl(pH 7.5)、10mM KCl、1mM DTT和充足的插入催化酶活性以催化插入反應(yīng)。適合的反應(yīng)條件將根據(jù)整合序列/插入催化酶對(duì)的來(lái)源而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，已知的各種插入催化酶在對(duì)各酶而言特殊的條件下具有最佳活性。為指定的酶確定和優(yōu)選反應(yīng)條件可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)完成。反應(yīng)條件可以基于轉(zhuǎn)座子和載體的大小、及插入催化酶制劑的活性而改變。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座反應(yīng)可以在存在可增加反應(yīng)中存在的核酸種類的有效濃度的試劑下進(jìn)行。屬于此類的適合試劑是聚乙二醇(PEG)。適合的PEG是PEG8000?？梢栽谶m當(dāng)溫度下，例如約20℃至約37℃下孵育反應(yīng)混合物一段適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，例如約15分鐘至約16小時(shí)。對(duì)于給定的轉(zhuǎn)座子、靶和插入催化酶制劑，最佳溫度和孵育期可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
在孵育轉(zhuǎn)座反應(yīng)物后，可以就此使用該DNA，或可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式對(duì)其進(jìn)行純化。當(dāng)不經(jīng)純化使用時(shí)，可以通過(guò)例如65℃加熱20分鐘，失活插入催化酶。從轉(zhuǎn)座反應(yīng)物中純化該DNA的適當(dāng)方法包括酚/氯仿抽提和乙醇沉淀、使用硅石(例如可從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division，Rockville，MD獲得的CONCERTTM系統(tǒng))提取、或本領(lǐng)域技術(shù)人員使用的任何其它純化方案。
當(dāng)轉(zhuǎn)座反應(yīng)足夠有效率時(shí)，將產(chǎn)生足夠多的包含有含轉(zhuǎn)座子的靶DNA分子的第一載體分子以充當(dāng)隨后重組反應(yīng)的底物。在其它情況下，可能必需用轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)生的分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主生物并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化生物以擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化生物可以培養(yǎng)在適合的選擇劑如抗生素存在的情況下，以便確保在生長(zhǎng)的生物體中存在位于轉(zhuǎn)座子上的選擇標(biāo)記。擴(kuò)增步驟是本領(lǐng)域常規(guī)的，并且無(wú)需進(jìn)行過(guò)多的試驗(yàn)，技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)纳锖娃D(zhuǎn)化條件并分離擴(kuò)增的反應(yīng)產(chǎn)物。實(shí)施例2含轉(zhuǎn)座子的靶分子和載體供體的重組可以使用重組克隆，將第一載體中含轉(zhuǎn)座子的靶DNA分子轉(zhuǎn)移至第二載體中。正如圖3所示，可以將前一實(shí)施例中討論的插入反應(yīng)的產(chǎn)物與稱作載體供體的第二載體混合。載體供體包含重組位點(diǎn)，在圖3中標(biāo)示為RS3和RS4，這些重組位點(diǎn)和第一載體中存在的重組位點(diǎn)是相容的。當(dāng)混合物和適當(dāng)?shù)闹亟M蛋白質(zhì)接觸后，靶DNA分子被轉(zhuǎn)移至第二載體上。在圖3所示實(shí)施方案中，載體供體在兩個(gè)重組位點(diǎn)之間包含毒性基因并在重組位點(diǎn)外含有一個(gè)選擇標(biāo)記(SM3)。適當(dāng)載體供體分子的制備見(jiàn)Hartley等提交的美國(guó)專利5,888,732，以及可從InvitrogenCorporation，Life Technologies Division(Rockville，MD)獲得的題為GATEWAYTM克隆技術(shù)的說(shuō)明書手冊(cè)(第1和2版)。
在適當(dāng)緩沖液中孵育第一和第二載體?？梢葬槍?duì)所用具體載體和重組蛋白質(zhì)優(yōu)化反應(yīng)條件。反應(yīng)溶液可以含有能夠維持期望pH的濃度的緩沖劑。緩沖劑的濃度可以從約1mM至約100mM。優(yōu)選地，從約10mM至約50mM。適合的緩沖劑是Tris。反應(yīng)溶液的pH可以根據(jù)所用重組酶的最適pH而改變。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反應(yīng)溶液的pH在約6.5至約8.5、更優(yōu)選約7.0至8.0、最優(yōu)選7.5。反應(yīng)溶液可以含有濃度在約1mM至約100mM、優(yōu)選從約5mM至約50mM、最優(yōu)選約20mM至約35mM的一價(jià)陽(yáng)離子。適當(dāng)?shù)囊粌r(jià)陽(yáng)離子來(lái)源是NaCl。反應(yīng)溶液還可以含有濃度約0.1mM至約10mM，優(yōu)選約1mM至約5mM的亞精胺。反應(yīng)溶液還可以含有濃度約50mg/ml至約5mg/ml、優(yōu)選約100mg/ml至約1mg/ml、最優(yōu)選約500mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)。反應(yīng)溶液還可以含有濃度約0.1mM至約10mM、優(yōu)選約1mM至約5mM的螯合劑。一組適合的反應(yīng)條件是50mM Tris·HCl(pH7.5)、33mM NaCl、5mM亞精胺·HCl和500mg/ml牛血清白蛋白。當(dāng)重組位點(diǎn)是attL和attR衍生物時(shí)，則反應(yīng)條件可以包括25mM Tris·HCl(pH7.5)、22mM NaCl、5mM EDTA、5mM亞精胺·HCl和1mg/ml牛血清白蛋白。反應(yīng)混合物在約25℃孵育60分鐘，再與蛋白酶如蛋白酶K一起孵育10分鐘以失活重組蛋白。在重組反應(yīng)前將載體線性化可以增加重組反應(yīng)的效率。這可以通過(guò)用適合的限制性酶消化來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘撸梢栽谥亟M反應(yīng)物中加入拓?fù)洚悩?gòu)酶I。在重組反應(yīng)后，可以使用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主生物。轉(zhuǎn)化的宿主可以培養(yǎng)在適合選擇劑存在的情況下以確保存在期望反應(yīng)產(chǎn)物。例如，在轉(zhuǎn)座子編碼針對(duì)一種抗生素的抗性而第二載體編碼針對(duì)另一抗生素的抗性的那些實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)化宿主的培養(yǎng)基可以包含兩種抗生素。在圖3所示實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子帶有選擇標(biāo)記SM2，而載體供體帶有SM3。在此情況下，第一載體可以編碼針對(duì)第三種抗生素即SM1的抗性。生長(zhǎng)條件將選出缺少毒性基因的情況。能夠在這些條件下生長(zhǎng)的任何生物將含有來(lái)自轉(zhuǎn)座子的選擇標(biāo)記和來(lái)自第二載體的選擇標(biāo)記，并將不含有毒性基因。這些分子是第一載體和第二載體之間重組和共合中間體拆分的結(jié)果。正如圖3所示，產(chǎn)物分子含有包含插入片段并被重組位點(diǎn)包圍的靶DNA，其中的重組位點(diǎn)是載體供體中的位點(diǎn)和最初的兩側(cè)位點(diǎn)的重組(標(biāo)示為RS1+3和RS2+4)的產(chǎn)物。例如，如果最初的兩側(cè)位點(diǎn)是attL1和attL2，而載體供體中的位點(diǎn)是attR1和attR2，則根據(jù)位點(diǎn)相對(duì)靶序列的取向，產(chǎn)物分子將含有由一側(cè)的attB1或attP1和另一側(cè)的attB2或attP2包圍的靶核酸。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)物分子可以含有被獨(dú)特的突變attB位點(diǎn)包圍的靶核酸。
或者，在重組反應(yīng)后，可以將混合物體外用于進(jìn)一步操作該靶可以使用與轉(zhuǎn)移有含轉(zhuǎn)座子的DNA區(qū)段的載體互補(bǔ)的寡核苷酸和與轉(zhuǎn)座子互補(bǔ)的寡核苷酸，以制備一群從載體延伸至轉(zhuǎn)座子插入片段位置的擴(kuò)增子?？梢詫?duì)這些區(qū)段克隆(例如，如果寡核苷酸含有重組位點(diǎn)、或如果載體被拓?fù)洚悩?gòu)酶作用后)和進(jìn)一步操作或測(cè)序。在另一此方面，擴(kuò)增前，還可以分離、擴(kuò)增該群體的各成員，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，籍此省去克隆和增殖該DNA區(qū)段的需要。
在一些實(shí)施方案中，靶DNA可以具有當(dāng)導(dǎo)入適當(dāng)宿主細(xì)胞后導(dǎo)致一或多個(gè)目的生物活性表達(dá)的序列。例如，靶DNA序列的導(dǎo)入可以導(dǎo)致某一特定酶活性的表達(dá)。在這些實(shí)施方案中，可能期望針對(duì)缺少目的生物學(xué)活性來(lái)篩選用重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，由此鑒定出其中轉(zhuǎn)座子已插入了生物活性表達(dá)所必需的序列中的克隆。這提供了關(guān)于編碼該活性的序列在此較大靶DNA序列中的位置的信息。對(duì)于大的靶序列例如當(dāng)靶序列是粘粒、BAC、YAC或基因組片段時(shí)，這將是尤其有用的。
含轉(zhuǎn)座子的靶DNA分子的序列可以通過(guò)靶DNA分子和結(jié)合部分轉(zhuǎn)座子序列的引物接觸，然后實(shí)施本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)序操作方案來(lái)確定。
重要的是應(yīng)注意，對(duì)于測(cè)序應(yīng)用，本發(fā)明克服了轉(zhuǎn)座子插入載體序列而非插入靶DNA或在插入靶DNA之外還插入載體序列中所造成的障礙。為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，圖2僅描述在含靶的載體分子中的單個(gè)插入；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，多個(gè)插入也是可能的。在轉(zhuǎn)座反應(yīng)完成后將靶DNA移入第二載體中的重組步驟，有效地消除了對(duì)測(cè)序載體的擔(dān)心，因?yàn)闆](méi)有從重組反應(yīng)回收第一載體序列。這與現(xiàn)有技術(shù)是不同的，現(xiàn)有技術(shù)中在載體中的插入將使得必需重復(fù)測(cè)序載體或?qū)嵤┓爆嵉暮Y選程序以消除轉(zhuǎn)座子插在載體中的克隆。在轉(zhuǎn)座子插在載體和靶序列中的那些情況下，所獲分子不能在現(xiàn)有技術(shù)的方法中使用，因?yàn)樵诖郎y(cè)序的同一分子中存在的兩個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)將造成難以理解的混合產(chǎn)物。由于本發(fā)明方法除去了起始DNA分子含轉(zhuǎn)座子的載體部分，所以可以從指定的轉(zhuǎn)座反應(yīng)中回收到更多能夠被測(cè)序的分子。實(shí)施例3使用插入和重組操作大核酸分子正如圖4A所示，本發(fā)明方法可以用于克隆大DNA分子例如基因組DNA的區(qū)段。除了基因組DNA外，本發(fā)明方法還允許克隆任何較大DNA分子的區(qū)段。因此，盡管本發(fā)明的此實(shí)施方案是以基因組DNA為例的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以使用這些方法克隆任何大DNA分子的區(qū)段。例如，大DNA分子可以是YAC、BAC或任何分離的染色體或它們的部分。
從目的生物分離基因組DNA并與包含一或多個(gè)重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子及插入催化酶在引起轉(zhuǎn)座子向基因組DNA中整合的條件下進(jìn)行接觸。然后將基因組DNA與具有和轉(zhuǎn)座子中重組位點(diǎn)相容的重組位點(diǎn)的載體供體接觸(圖4A)?；蛘?，可以使轉(zhuǎn)座子和載體供體中的重組位點(diǎn)取一定方向，以便轉(zhuǎn)座子單獨(dú)不能和載體供體產(chǎn)生生產(chǎn)性的反應(yīng)(圖4B)。在存在適當(dāng)重組蛋白質(zhì)時(shí)進(jìn)行孵育后，可以使用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細(xì)胞。在選出載體供體上選擇標(biāo)記和選擇除去毒性基因的條件下，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，可以修飾轉(zhuǎn)座子，以便重組事件使基因組DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移至載體供體上。轉(zhuǎn)座子的此構(gòu)型顯示在圖5中。
適于涉及基因組DNA克隆的實(shí)施方案的轉(zhuǎn)座子可以包含兩個(gè)重組位點(diǎn)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，重組位點(diǎn)具有相同序列并且取向相反，即反向重復(fù)。圖6顯示了使用該實(shí)施方案克隆基因組DNA的示意圖。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子可以包含編碼毒性基因的DNA序列。此類轉(zhuǎn)座子可用于防止轉(zhuǎn)座子或在提供用于克隆的重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子間還有一個(gè)轉(zhuǎn)座子的基因組片段的重組克隆。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，重組位點(diǎn)可以具有不同序列并取向相反。在轉(zhuǎn)座子插入后，使基因組DNA和具有與轉(zhuǎn)座子的那些重組位點(diǎn)相容的重組位點(diǎn)的載體供體、及適當(dāng)?shù)闹亟M蛋白質(zhì)，在導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子上的重組位點(diǎn)和載體供體上的重組位點(diǎn)間發(fā)生重組的條件下進(jìn)行接觸。轉(zhuǎn)化和篩選可以按上述方式進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，可能期望在載體供體上包括一或多個(gè)和用于轉(zhuǎn)座子和載體供體重組的那些重組位點(diǎn)有不同特異性的其它重組位點(diǎn)(圖6)。這些其它位點(diǎn)可以用于進(jìn)一步操作克隆的DNA。例如，可能期望將克隆的DNA轉(zhuǎn)移至不同的載體上，而這可以使用這些其它的重組位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，用于基因組克隆的轉(zhuǎn)座子可以包含復(fù)制起點(diǎn)。將包含一或多個(gè)重組位點(diǎn)并還包含復(fù)制起點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子插入基因組DNA中。存在于轉(zhuǎn)座子上的重組位點(diǎn)可以和存在相鄰轉(zhuǎn)座子上的重組位點(diǎn)重組，導(dǎo)致兩個(gè)重組位點(diǎn)間的片段被切除。由于該切除的分子是具有復(fù)制起點(diǎn)的環(huán)狀分子，故該切除分子能夠穩(wěn)定地維持在宿主細(xì)胞中。為了有利于篩選切除分子，本發(fā)明的轉(zhuǎn)座子可以選擇性包含一或多個(gè)選擇標(biāo)記。在此類一些實(shí)施方案中，可能期望將兩個(gè)不同群體的轉(zhuǎn)座子整合入基因組DNA中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，一個(gè)群體可以包含一個(gè)重組位點(diǎn)和一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，而另一個(gè)轉(zhuǎn)座子可以包含選擇標(biāo)記和一個(gè)重組位點(diǎn)。存在于兩個(gè)相鄰轉(zhuǎn)座子上的這兩個(gè)重組位點(diǎn)間的重組產(chǎn)生了含有復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記以及目的DNA的DNA分子?？梢詫⒃摲肿愚D(zhuǎn)化至適當(dāng)宿主細(xì)胞系中并使用一或多個(gè)選擇標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行選擇。這示意性地顯示在圖7中。
整合反應(yīng)中存在的基因組DNA的濃度和轉(zhuǎn)座子的濃度的比可以發(fā)生變動(dòng)，以便控制轉(zhuǎn)移至載體供體中的基因組DNA片段的大小。通過(guò)增加轉(zhuǎn)座子的濃度，可以降低此基因組DNA片段的平均大小。實(shí)施例4使用轉(zhuǎn)座和重組構(gòu)建亞克隆可以使用含有轉(zhuǎn)座子的靶DNA構(gòu)建含有少于靶DNA完整序列的克隆。這些較小的克隆一般被稱作亞克隆?？梢詫⑥D(zhuǎn)座子插入含有重組位點(diǎn)或被重組位點(diǎn)所包圍的靶DNA中，以產(chǎn)生圖8A頂圖顯示的分子。該轉(zhuǎn)座子可以含有不同于靶分子的重組位點(diǎn)的一或多個(gè)重組位點(diǎn)，并還可以含有一或多個(gè)選擇標(biāo)記。然后將此分子和一或多個(gè)含有將與轉(zhuǎn)座子和靶上位點(diǎn)重組的重組位點(diǎn)的載體供體接觸。在一些實(shí)施方案中，可以提供具有額外重組位點(diǎn)的含有靶DNA的載體，而載體供體含有與這些額外位點(diǎn)重組的重組位點(diǎn)。進(jìn)行重組，然后將重組反應(yīng)產(chǎn)生的核酸插入宿主細(xì)胞中。通過(guò)將部分轉(zhuǎn)化反應(yīng)物鋪在各種選擇性培養(yǎng)上，可以分離出期望的亞克隆，見(jiàn)圖8A所示。
在一些實(shí)施方案中，例如圖8B中所示的那些，可以置換靶DNA的區(qū)段。例如，可以使由RS1和RS2包圍的靶DNA區(qū)段和置換序列交換。因此，靶DNA大區(qū)段和小置換序列的交換將導(dǎo)致缺失部分靶序列。該置換序列可以向靶DNA中引入任何期望的特征，包括但不限于，期望生物活性的表達(dá)。
在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，包含重組位點(diǎn)、復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子被整合到靶分子中。選擇轉(zhuǎn)座子上存在的重組位點(diǎn)，以便其與包含靶DNA分子的載體上存在的重組位點(diǎn)相容。插入轉(zhuǎn)座子后，在沒(méi)有載體供體的情況下進(jìn)行重組。結(jié)果是切除了轉(zhuǎn)座子上存在的重組位點(diǎn)和載體上存在的重組位點(diǎn)之間的DNA。因?yàn)榘蠨NA的切除部分包含復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，可以將該切除部分插入宿主細(xì)胞并且其將獲得穩(wěn)定的維持。結(jié)果是亞克隆了靶DNA的此切除部分。這示意性地顯示在圖9中。實(shí)施例5使用轉(zhuǎn)座和重組克隆PCR片段本發(fā)明方法可以用于克隆PCR片段。含有重組序列(或其部分)的引物被用于擴(kuò)增靶DNA序列(參見(jiàn)1997年10月24日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/065,930和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)09/177,387)?；蛘?，例如，通過(guò)包括限制性酶的識(shí)別序列，PCR引物可以具有允許產(chǎn)生可連接末端的序列。所獲被重組位點(diǎn)(或可連接末端)包圍的線性片段與含有選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子反應(yīng)。轉(zhuǎn)座子整合后，進(jìn)行重組反應(yīng)(或連接反應(yīng))。結(jié)果是具有復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記的環(huán)狀分子?；蛘?，可以首先將該分子環(huán)化，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)座子的整合?？梢詫⒋谁h(huán)狀分子環(huán)化至感受態(tài)宿主細(xì)胞中并進(jìn)行維持。該方法對(duì)于構(gòu)建基因?qū)蜉d體將尤其有用。在此類一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)座子可以包含賦予新霉素抗性的選擇標(biāo)記。并可以用G-418篩選包含該選擇標(biāo)記的細(xì)胞。
圖10顯示了該方法的示意圖。在
圖10所示實(shí)施方案中，靶DNA分子使用含有標(biāo)示為RS1和RS2的重組位點(diǎn)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。將整合序列插入擴(kuò)增產(chǎn)物中，然后通過(guò)重組事件使之環(huán)化。在其它實(shí)施方案中，可以使含有整合序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和含有與擴(kuò)增產(chǎn)物中的那些重組位點(diǎn)相容的重組位點(diǎn)的另一核酸分子反應(yīng)。實(shí)施例6在靶DNA分子中構(gòu)建缺失使含有被兩個(gè)非相互作用的不同重組位點(diǎn)包圍的靶DNA分子的載體和轉(zhuǎn)座子及插入催化酶，在引起轉(zhuǎn)座子插入靶分子或載體或兩者中的條件下進(jìn)行接觸。構(gòu)建轉(zhuǎn)座子以含有和位于靶DNA分子側(cè)翼的重組位點(diǎn)之一相容的重組位點(diǎn)以及測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)。此外，轉(zhuǎn)座子可以含有編碼選擇標(biāo)記的序列和編碼毒性基因的序列，這些序列的分布如
圖11所示。
轉(zhuǎn)座子插入包含靶DNA分子的載體中后，可以在轉(zhuǎn)座子上存在的重組位點(diǎn)和載體上存在的相容重組位點(diǎn)之間進(jìn)行重組反應(yīng)。參照
圖11，這將是RS3和RS2之間的重組。使用該重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化對(duì)該毒性基因敏感的感受態(tài)宿主細(xì)胞，使用轉(zhuǎn)座子上存在的選擇標(biāo)記和載體上存在的選擇標(biāo)記，將轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞鋪在含有適合篩選試劑的平板上。轉(zhuǎn)座子在載體序列中的插入或轉(zhuǎn)座子在靶DNA中的插入致使轉(zhuǎn)座子中重組位點(diǎn)相對(duì)載體中的同源重組位點(diǎn)取向相反時(shí)，將導(dǎo)致保留毒性基因并因此在轉(zhuǎn)化后不產(chǎn)生菌落的分子。當(dāng)將轉(zhuǎn)座子插入靶DNA中以致轉(zhuǎn)座子中重組位點(diǎn)與載體上重組位點(diǎn)具有相同方向時(shí)，將缺失掉一部分靶DNA和含有毒性基因的轉(zhuǎn)座子部分。所獲缺失質(zhì)粒將在轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生菌落。可以從陽(yáng)性菌落回收質(zhì)粒并通過(guò)凝膠電泳確定回收的質(zhì)粒的大小以便分析缺失了多少靶DNA。任選地，可以使用常規(guī)技術(shù)通過(guò)限制性作圖分析這些質(zhì)粒。
或者，可以按
圖12所示回收缺失的序列。將含有一或多個(gè)重組位點(diǎn)的插入元件插入含有重組位點(diǎn)的分子的靶區(qū)域中。當(dāng)與載體供體接觸時(shí)，插入元件上的重組位點(diǎn)和靶分子上的重組位點(diǎn)之間的區(qū)域被轉(zhuǎn)移到載體供體上，導(dǎo)致克隆了最初靶的缺失部分。實(shí)施例7在固相支持物上制備核酸分子群本發(fā)明方法還可以用于制備附著在固相支持物上的分子群。該方法可以被用于分離該群體的成員，提供核酸分子，該核酸分子可以充當(dāng)擴(kuò)增模板或可以用作進(jìn)一步添加和操作DNA區(qū)段的底物、或可以用于系統(tǒng)例如體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)及用作產(chǎn)生探針的模板。在
圖13所示意性描述的一個(gè)這樣的方面，靶DNA與含有至少一個(gè)重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子反應(yīng)。在本發(fā)明該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶DNA和轉(zhuǎn)座子是線性的，但也可以使用其它構(gòu)型和結(jié)構(gòu)(例如環(huán)狀、超螺旋、發(fā)夾等)的這些分子。含有重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)(或定向)整合將產(chǎn)生一群均含有重組位點(diǎn)的分子。還可以將該群體和固定在固相基質(zhì)上的重組位點(diǎn)反應(yīng)，以便該重組反應(yīng)導(dǎo)致靶DNA和固定化重組位點(diǎn)產(chǎn)生共價(jià)鍵合。這樣，固定化基質(zhì)的每個(gè)部件將含有該群體的一個(gè)成員。
這些固定化群體有許多用途例如，可以進(jìn)一步使用各個(gè)部件作為底物使用與轉(zhuǎn)座子和靶DNA末端互補(bǔ)的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)使用轉(zhuǎn)座子作為移動(dòng)引物位點(diǎn)測(cè)序該群體的幾個(gè)成員，可以確定大DNA區(qū)段的全部序列。相似地，從該部件上的成員產(chǎn)生的擴(kuò)增子可以用于制備探針、表達(dá)蛋白質(zhì)區(qū)段、定位域(DNA或蛋白質(zhì))等。應(yīng)當(dāng)注意，如果期望的話，可以使用含有重組位點(diǎn)和與靶DNA末端相容的一個(gè)末端的載體，克隆或在擴(kuò)增后克隆每個(gè)群體的成員。
為了清晰理解我們已通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例一定程度地詳細(xì)描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將明了，可以通過(guò)在條件、配方和其它參數(shù)的寬的等同范圍內(nèi)修改或改變本發(fā)明而不影響本發(fā)明或其任何具體實(shí)施方案的范圍，并且這些修飾或改變將被包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
在該說(shuō)明書中提及的所有公開(kāi)出版物、專利、專利申請(qǐng)表現(xiàn)出本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平，在此將它們并入作為參考，這就等同于將每個(gè)公開(kāi)文本、專利或?qū)＠暾?qǐng)具體地個(gè)別地并入作為參考。
權(quán)利要求
1.包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)或其部分的整合序列。
2.權(quán)利要求1的整合序列，其中所述整合序列還含有至少一個(gè)選自下組的元件一或多個(gè)引物位點(diǎn)、一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)或調(diào)節(jié)序列、一或多個(gè)終止信號(hào)、一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一或多個(gè)選擇標(biāo)記和一或多個(gè)基因或基因的部分。
3.側(cè)翼有至少第一重組位點(diǎn)和至少第二重組位點(diǎn)的靶核酸序列，其中所述靶核酸序列包含至少一個(gè)整合序列。
4.權(quán)利要求3的靶核酸序列，其中所述整合序列還包含至少一個(gè)選自下組的元件一或多個(gè)引物位點(diǎn)、一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)或調(diào)節(jié)序列、一或多個(gè)終止信號(hào)、一或多個(gè)重組位點(diǎn)或其部分、一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一或多個(gè)選擇標(biāo)記和一或多個(gè)基因或基因的部分。
5.選擇包含至少一個(gè)整合序列的靶核酸分子的方法，其包括使側(cè)翼有重組位點(diǎn)的目的靶序列和至少一個(gè)整合序列，在足以導(dǎo)致至少一個(gè)所述整合序列整合入所述靶序列的條件下，進(jìn)行孵育；和選擇所述靶序列。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述選擇包括將所述靶序列轉(zhuǎn)移至載體中。
7.選擇靶核酸分子的方法，包括將側(cè)翼有重組位點(diǎn)并包含至少一個(gè)整合序列的靶序列自第一核酸分子轉(zhuǎn)移至第二核酸分子上；和選擇含有側(cè)翼為重組位點(diǎn)的所述靶序列的所述第二核酸分子。
8.確定核酸分子的序列的方法將側(cè)翼有重組位點(diǎn)并含有至少一個(gè)整合序列的靶序列自第一核酸分子轉(zhuǎn)移至第二核酸分子；和確定所述靶序列的至少一個(gè)部分的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述整合序列含有至少一個(gè)引物位點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述轉(zhuǎn)移是通過(guò)重組克隆來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述轉(zhuǎn)移是在體外或在體內(nèi)進(jìn)行的。
12.在核酸分子中制備一或多個(gè)缺失的方法，包括使包含至少第一重組位點(diǎn)的核酸分子和包含至少第二重組位點(diǎn)的整合序列在一定條件下接觸，以致至少一個(gè)所述整合序列被插入所述核酸分子中；和使至少所述第一和所述第二重組位點(diǎn)發(fā)生重組，籍此導(dǎo)致所述核酸分子的至少一個(gè)部分缺失。
13.在核酸分子中制備一或多個(gè)缺失的方法，其包括獲得包含至少第一和第二重組位點(diǎn)的所述核酸分子；和使所述第一和所述第二重組位點(diǎn)重組，籍此導(dǎo)致所述核酸分子的至少一個(gè)部分缺失。
14.克隆核酸分子或核酸分子群的方法，包括將一或多個(gè)包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)的整合序列插入至少一個(gè)核酸分子中；和將一或多個(gè)側(cè)翼為重組位點(diǎn)的核酸分子通過(guò)重組克隆方式轉(zhuǎn)移至一或多個(gè)載體上。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述核酸分子是基因組、染色體或cDNA。
16.克隆核酸分子或核酸分子群的方法，其包括將一或多個(gè)包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)的整合序列插入至少一個(gè)核酸分子中，籍此導(dǎo)致所述核酸分子包含至少第一和第二重組位點(diǎn)；和使所述至少第一和第二重組位點(diǎn)重組。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一和第二重組位點(diǎn)的重組導(dǎo)致產(chǎn)生環(huán)狀分子。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述第一和第二重組位點(diǎn)被所述核酸分子的至少一個(gè)部分分開(kāi)。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述整合序列包含至少一個(gè)選自下組的元件一或多個(gè)引物位點(diǎn)、一或多個(gè)轉(zhuǎn)錄或翻譯信號(hào)或調(diào)節(jié)序列、一或多個(gè)終止信號(hào)、一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一或多個(gè)選擇標(biāo)記和一或多個(gè)基因或基因的部分。
20.權(quán)利要求16的方法，其中所述整合序列包含一或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和/或一或多個(gè)選擇標(biāo)記。
21.使線性核酸分子環(huán)化的方法，其包括獲得包含至少第一和第二重組位點(diǎn)的線性核酸分子；和使所述第一和第二重組位點(diǎn)重組。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述重組位點(diǎn)位于所述線性核酸分子的兩端或兩端附近。
23.權(quán)利要求21的方法，其中通過(guò)用一或多個(gè)包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)或其部分的引物進(jìn)行擴(kuò)增，將所述第一和/或第二重組位點(diǎn)添加至所述線性核酸分子上。
24.權(quán)利要求21的方法，其中通過(guò)添加一或多個(gè)包含至少一個(gè)重組位點(diǎn)或其部分的銜接子，將所述第一和/或第二重組位點(diǎn)添加在所述線性核酸分子上。
25.權(quán)利要求21的方法，其還包括使所述線性核酸分子和至少一個(gè)整合序列在足以導(dǎo)致至少一個(gè)所述整合序列插入所述線性核酸分子中的條件下進(jìn)行孵育。
26.權(quán)利要求21的方法，其還包括使所述環(huán)化核酸分子和至少一個(gè)整合序列在足以使至少一個(gè)所述整合序列插入所述環(huán)化分子中的條件下進(jìn)行孵育。
27.權(quán)利要求16的方法，其中所述核酸分子是基因組、染色體或cDNA。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述核酸分子是基因組、染色體或cDNA。
29.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述第一和所述第二重組位點(diǎn)在體外發(fā)生重組。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及用于操作核酸分子，尤其是用于克隆、測(cè)序、擴(kuò)增和突變所述分子，的方法、試劑盒和組合物。具體地，本發(fā)明涉及重組位點(diǎn)和重組克隆在操作、選擇和分析目的核酸分子中的用途。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1399684SQ00816196
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年10月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月25日
發(fā)明者M·A·布拉什, J·L·哈特利, G·F·坦普勒 申請(qǐng)人:茵維特羅根公司