專利名稱：人pct的b細胞表位肽段及其單克隆抗體的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，特別涉及細胞表位肽段抗原及其單克隆抗體的應用。
背景技術：
細菌性感染只要能夠早期發(fā)現、早期診斷、針對性的早期治療，大多預后良好。否貝U，可能發(fā)展成為重度菌血癥或/和嚴重膿毒癥。根據美國CDC的報告，目前膿毒癥已經成為非心臟ICU死亡的主要原因OV Engl J Med. 2003;348: 1546-1554),因此感染性炎癥的早期診斷極為重要。另外，隨著細菌耐藥性、重癥感染患者的增加，如何指導臨床用藥也顯得愈發(fā)重要。 降I丐素原(procalcitonin, PCT)是上世紀九十年代才發(fā)現的細菌、真菌性感染的特異性標志物，是一種無激素活性的降鈣素前肽，有116個氨基酸組成，I 57為N-殘端，60 91為降鈣素，96 116為降鈣蛋白。分子量為13kD，由位于11號染色體(11ρ1514)上的CALC-I基因編碼，半衰期為25 30小時，在體內外穩(wěn)定性好，不會降解為降鈣素，亦不受體內激素水平的影響，實驗室檢測快速簡便，有利于臨床特別是急診廣泛開展應用。在嚴重全身性細菌、真菌、寄生蟲、急性瘧疾感染、系統(tǒng)炎性反應綜合癥(SIRS)、多器官功能衰竭綜合癥(MODS)的診斷方面，PCT是一個具有高靈敏度、特異性的新指標。PCT主要是在細菌毒素和炎性細胞因子的刺激下產生，而在非感染性炎癥狀態(tài)下血清PCT —般不升高，感染性炎癥過程中，PCT的生成非常快，對內毒素刺激反應2 6小時內即升高，嚴重全身感染者血PCT在24 h內可升高達1000倍。PCT作為一種新的感染性炎性標志物目前已被廣泛認可。不僅能早期鑒別細菌與非細菌感染，更是敗血癥的預警和診斷指標，且PCT與細菌感染的程度成正相關，它的上升或下降直接反應疾病惡化或好轉的趨勢，因此，PCT的檢測在細菌性感染、敗血癥、MODS的鑒別診斷、預后判斷、療效觀察及合理指導應用抗菌藥等均有重要參考價值?，F有技術對PCT的制備方法多直接取自組織細胞，如甲狀旁腺組織，成本高，制備過程復雜，獲得產品量低，制約了對PCT的研究及應用開發(fā)。利用基因工程方法制備PCT重組蛋白是一種簡單、經濟、可靠的方法，可大量制備PCT蛋白，并且在此基礎上可進一步制備抗PCT抗體，以進行PCT免疫檢測。免疫檢測的首要關鍵問題是如何獲得特異性針對PCT的抗體，而且最好獲得針對不同抗原決定簇的特異性抗體，所以進行預測選擇PCT的B細胞免疫表位尤為重要。目前還沒有相應的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供B細胞表位肽段及其衍生物，其能作為降鈣素原單克隆抗體的抗原。本發(fā)明的目的之二在于提供一種雜交瘤細胞，其能特異性的分泌降鈣素原單克隆抗體。同時，本發(fā)明還提供所述一種單克隆抗體，其可作為加檢測降鈣素原的試劑。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為I、人PCT的B細胞表位肽段，人PCT的B細胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。2、含有I所述人PCT的B細胞表位肽段的衍生物，所述人PCT的B細胞表位肽段的衍生物為所述人PCT的B細胞表位肽段偶聯有載體蛋白BSA或KLH。3、根據I所述人PCT的B細胞表位肽段，所述人PCT的B細胞表位肽段在N末端引入半胱氨酸。4、1-3任一項所述人PCT的B細胞表位肽段制備的單克隆抗體雜交瘤細胞。5、根據4所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞，單克隆抗體的雜交瘤細胞的生物保藏號為 CCTCC NO C201138o6、5所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。 本發(fā)明的目的還在于提供上述單克隆抗體的制備方法，該方法操作簡單，適用于大規(guī)模生產該單克隆抗體。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案在于
所述的單克隆抗體的制備方法用如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的人PCT的B細胞表位肽段為抗原，免疫所得的血清效價大于1:3200的動物的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株分泌得單克隆抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供所述單克隆抗體的應用，該應用為檢測降鈣素原提供了新思路。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案在于
所述的單克隆抗體在制備用于檢測降鈣素原的診斷試劑中的應用。進一步，所述單克隆抗體與PCT重組蛋白的特異性多克隆抗體聯合用于制備檢測降鈣素原的診斷試劑中的應用。進一步，所述PCT重組蛋白為如SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列所編碼的蛋白。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明制備的人降鈣素原是高純度的PCT重組蛋白(rhPCT)，該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時可以作為建立PCT定量檢測時的校準品；
通過PCT蛋白序列的B細胞表位肽段免疫小鼠制備的單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測純度>98%)、效價高(ELISA效價達I :512000)、特異性好、可大批量制備等優(yōu)點；
人PCT蛋白中B細胞表位肽段化學合成時在其N端引入半胱氨酸，提高了其與KLH或BSA交聯率(>50%)，可獲得優(yōu)質免疫原；
通過本發(fā)明制備的單克隆抗體、多克隆抗體可用于病人血液PCT含量的檢測，如可采用“雙抗體夾心"ELISA反應模式，即酶標記人抗PCT單抗、酶標板包被抗PCT多抗和被測樣品PCT抗原形成“雙抗體夾心”結構進行測定。


圖I為抗PCT單克隆抗體的純化色譜圖，其中UV :紫外吸收光譜；cond:電導率。培養(yǎng)物保藏本發(fā)明中雜交瘤細胞株4-PCT 1-F2送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC N0:C201138，地址位于中國武漢武漢大學，保存日期為2011年7月3日，保藏的培養(yǎng)物名稱為雜交瘤細胞株4-PCT 1-F2。
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆實驗手冊(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)和現代免疫學實驗技術(沈關心周汝麟主編)中所述的條件或制造商建議的條件進行或配置，未注明來源的產品均可通過市場途徑獲得。實施例I PCT重組蛋白的制備 從GENBANK獲取PCT編碼基因的基礎上，進行密碼子偏嗜性改造，化學合成編碼基因片段，克隆入原核表達載體經DNA測序鑒定后誘導蛋白表達，經性質鑒定后，大量純化制備PCT重組蛋白，該蛋白可用于抗體制備的免疫原及篩選原，同時可以作為后續(xù)實驗中建立PCT定量檢測時的校準品，具體的
一 PCT重組蛋白基因克隆
從GENBANK獲得人PCT蛋白的基因序列(登錄號為NM_004102)，將其遞交于Graphicalcodon usage analyzer (http://guca. schoedl. del),分析其密碼子偏性情況；具體的,將人PCT基因密碼子在大腸桿菌中使用率〈10%的同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，使其更加各易在大腸桿囷中表達，優(yōu)化后的核昔Ife序列為如SEQ ID NO: I所不
gcaccattca ggtctgccct ggagagcagc ccagcagacc cggccacgct cagtgaggacgaagcgcgcc tcctgctggc tgcactggtg caggactatg tgcagatgaa ggccagtgag ctggagcaggagcaagagag agagggctcc agcctggaca gccccagatc taagcggtgc ggtaatctga gtacttgcatgctgggcaca tacacgcagg acttcaacaa gtttcacacg ttcccccaaa ctgcaattgg ggttggagcacctggaaaga aaagggatat gtccagcgac ttggagagag accatcgccc tcatgttagc atgccccagaatgccaacta atag
相應的多肽序列如SEQ ID N0:2所示，具體為
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser GluAsp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala SerGlu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys ArgCys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe HisThr Phe Pro Gln Thr Ala He Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser SerAsp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro Gln Asn Ala Asn上述胺基酸的中英文對照如下
谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G ;絲氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hr T ;纈氨酸vaI V ;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸t(yī)yr Y ;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨酸pro P ;天冬酰胺asn N ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸IysK ;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R;天冬氨酸Asp D為進行有效表達及純化，在該序列的5'-及:T-端分別添加Sal I、BamH I酶切位點，其中BamH I位點后加入GATGATGATGATAAG序列，其編碼Asp-Asp-Asp-Asp-Lys多肽序列為EK酶的識別位點。然后委托上海英駿生物工程有限公司進行全基因合成。合成的過程為常規(guī)基技術，可參考分子克隆實驗手冊一書。二 pET42a_PCT重組質粒構建
將pET42a載體與合成基因經Sal I、BamH I酶切4小時后用T4DNA連接酶4°C過夜連接。將制備好的感受態(tài)DH5a菌200 μ 1，冰浴，吸取1μ I連接產物加入管中，轉化DH5 a菌，輕拍混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴90秒，取出離心管再冰浴2分鐘，加入800 μ I室溫的2ΧΥΤ培養(yǎng)液混勻，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)I小時，分別將50μ 1、200μ I及剩下的全部轉化菌涂于3個含卡那霉素抗性的2 X YT培養(yǎng)板上，37 °C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑去白素菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用堿裂解法提取質粒，取質粒用Sal I、BamH I雙酶切4 小時，酶切體系為pET42a-PCT 質粒 DNA 10 μ 1，Sal I I μ I, BamH I I μ 1，IOX 緩沖液 K
2μ 1，ddH20 6 μ 1，并取酶切產物10 μ I行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見與設計值378bp一致的片段。三PCT重組蛋白誘導表達
將轉化pET42a-PCT的細菌擴大培養(yǎng)及誘導表達，測細菌OD值達O. 6-0. 8時加入IPTG(至終濃度I mmol/L)誘導表達6 h。培養(yǎng)后每克濕菌以10倍體積的PBS緩沖液(pH
7.3)重懸，混勻后超聲破菌，破菌完全后于4 V 10,000 rpm離心15 min，上清以O. 45 μ m微孔濾膜過濾。分別取少量上清與沉淀SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白可溶性，經鑒定表達蛋白破菌后幾乎都存在上清中，為可溶性表達。四PCT重組蛋白純化
上清經過濾后用Amersham的AKTAprime上柱純化,Binding buffer平衡后用Elutionbuffer線性洗脫，收集主洗脫峰，用His-Binding buffer稀釋10倍后進行HisTrap HP再次純化，純化后的產物用PBS平衡過的分子篩，收集蛋白。將獲得的蛋白用HiTrap Desalting置換緩沖體系為EK切割buffer(50 mmol/L Tris-HCl，PH8. 0)，按EK酶與蛋白I :1000的質量比加入EK酶,4°C搖床60rpm切割24h。切割后用His- Binding buffer稀釋后HisTrapHP純化，15% SDS-PAGE電泳鑒定，PCT重組蛋白分子量為13Kda左右。IPTG未誘導的重組菌作陰性對照，誘導6h的重組菌為陽性對照，純化后目的蛋白純度達到95%以上。五PCT重組蛋白濃度、純度測定
ILowry法測定PCT蛋白含量 制備標準曲線
權利要求
1.人PCT的B細胞表位肽段，其特征在于 人PCT的B細胞表位肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
2.含有權利要求I所述人PCT的B細胞表位肽段的衍生物，其特征在于所述人PCT的B細胞表位肽段的衍生物為所述人PCT的B細胞表位肽段偶聯有載體蛋白BSA或KLH。
3.根據權利要求2所述人PCT的B細胞表位肽段，其特征在于所述人PCT的B細胞表位肽段在N末端引入半胱氨酸。
4.權利要求1-3任一項所述人PCT的B細胞表位肽段制備的單克隆抗體雜交瘤細胞。
5.根據權利要求4所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，單克隆抗體雜交瘤細胞的生物保藏號為CCTCC NO :C201138。
6.權利要求4所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
7.權利要求5所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟用如SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的B細胞表位肽段為抗原，免疫所得的血清效價大于1:3200的動物的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，經篩選克隆獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株分泌得單克隆抗體。
8.權利要求6所述的單克隆抗體在制備用于檢測降鈣素原的診斷試劑中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述單克隆抗體與PCT重組蛋白的特異性多克隆抗體聯合用于制備檢測降鈣素原的診斷試劑中的應用。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述PCT重組蛋白為如SEQID NO: I所示的核苷酸序列所編碼的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學中的免疫學領域，特別涉及人PCT(降鈣素原)的B細胞表位肽段及其單克隆抗體的應用，所述表位肽段如SEQ ID NO:3所示，其可用于制備雜交瘤細胞并分泌相應的單克隆抗體；該單克隆抗體可用于制備檢測降鈣素原的診斷試劑；本單克隆抗體具有純度高>98%，效價高達1512000，且特異性好、可大批量制備等優(yōu)點；通過本發(fā)明制備的單克隆抗體、多克隆抗體可用于病人血液PCT含量的檢測，如可采用雙抗體夾心ELISA反應模式，即酶標記人抗PCT單抗、酶標板包被抗PCT多抗和被測樣品PCT抗原形成“雙抗體夾心”結構進行測定。
文檔編號C07K19/00GK102643332SQ20111027339
公開日2012年8月22日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權日2011年9月15日
發(fā)明者姚靜, 張憲, 易維京, 石延賓, 胡偉, 陳安, 魏勇, 黃洪濤 申請人:重慶業(yè)為基生物科技有限公司