專利名稱：用于重組生產(chǎn)抗融合肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于重組生產(chǎn)抑制病毒與靶細(xì)胞膜融合的肽的方法。特別地，本發(fā)明涉及重組生產(chǎn)慢病毒屬如人免疫缺陷病毒(HIV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(MEV)，流感病毒如呼吸道合胞病毒(RSV)或人副流感病毒(HPV)的肽抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
對于有包膜病毒如HIV-I，HIV-II，RSV，麻疹病毒，流感病毒，副流感病毒，埃-巴二氏病毒和肝炎病毒進(jìn)入到細(xì)胞，病毒與細(xì)胞膜的融合是一個(gè)必需步驟。在已進(jìn)入細(xì)胞后可以引發(fā)導(dǎo)致病毒感染的病毒復(fù)制級聯(lián)。
HIV是慢病毒屬的一種，所述慢病毒屬包括擁有復(fù)雜基因組和顯示圓錐狀衣殼核心顆粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒。慢病毒屬的其它實(shí)例包括猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，腦膜腦炎病毒和馬傳染性貧血病毒(EIAV)。類似所有逆轉(zhuǎn)錄病毒，HIV的基因組是由RNA編碼，其在進(jìn)入新宿主細(xì)胞后由病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)逆轉(zhuǎn)錄為病毒DNA。Bullough，P.A.，等，Nature371(1994)37-43；Carr，C.M.，和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；和Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373描述了流感病毒和它們的細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制。
所有慢病毒屬是由源于宿主細(xì)胞膜的脂雙層包裹。通過與跨膜蛋白質(zhì)(TM，gp41)的相互作用將曝露的表面糖蛋白(SU，gp120)錨定給病毒。脂雙層還含有幾種源于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白，包括主要組織相容性抗原，肌動(dòng)蛋白和遍在蛋白質(zhì)(Arthur，L.O.，等，Science 258(1992)1935-1938)。一種含有大約2000個(gè)拷貝基質(zhì)蛋白(MA，p17)的基質(zhì)殼排列在病毒膜的內(nèi)表面，并且一種含有大約2000個(gè)拷貝衣殼蛋白(CA，p24)的圓錐狀衣殼核心顆粒位于病毒的中心。衣殼顆粒包裹兩個(gè)拷貝未剪接的病毒基因組，其被穩(wěn)定成一種具有大約2000個(gè)拷貝核衣殼蛋白(NC，p7)的核糖核蛋白復(fù)合體，并且還含有三種基本的病毒編碼的酶蛋白酶(PR)，逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN)。病毒顆粒還包裝輔助蛋白，Nef，Vif和Vpr。似乎不包裝在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的另外三種輔助蛋白，Rev，Tat和Vpu。
在HIV的情形中，病毒進(jìn)入是與HIV包膜表面糖蛋白相關(guān)(Lawless，M.K.，等，Biochemistry 35(1996)13697-13708；和Turner，B.G.，和Summers，M.F.，J.Mol.Biol.285(1999)1-32)。在HIV-1的情形中，該表面蛋白是作為一種單個(gè)的160kD的前體蛋白被合成，所述前體蛋白被一種細(xì)胞蛋白酶切割成兩種糖蛋白gp-41和gp-120。gp-41是一種跨膜蛋白質(zhì)，gp-120是一種保持與gp-41以三聚體或多聚體形式的非共價(jià)結(jié)合的胞外蛋白(Hammarskjld，M.-L.，等，Biochim.Biophys.Acta 989(1989)269-280)。由于CD4表面蛋白充當(dāng)HIV-I病毒的細(xì)胞受體，因此HIV靶向CD4+淋巴細(xì)胞。病毒進(jìn)入細(xì)胞取決于與細(xì)胞CD4+受體分子結(jié)合的gp-120而gp-41將包膜糖蛋白復(fù)合體錨定在病毒膜中并介導(dǎo)膜融合(McDougal，J.S.，等，Science 231(1986)382-385；和Maddon，P.J.，等，Cell 47(1986)333-348)。
gp41是介導(dǎo)病毒和細(xì)胞膜融合的跨膜亞單位。gp41胞外域核心是一個(gè)由三個(gè)螺旋狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成的六螺旋束，每個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)由與反向平行的C螺旋成對的N螺旋組成(Chan，D.C.，等，Cell 89(1997)263-273；Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430；Tan，K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)12303-12308)。該N螺旋形成一個(gè)具有三個(gè)保守疏水溝的內(nèi)部三聚體卷曲螺旋；一個(gè)C螺旋填充于這些溝的每一個(gè)之中。該結(jié)構(gòu)可能相當(dāng)于gp41融合-活性狀態(tài)的核心。依照Chan，D.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617，有證據(jù)表明在1類HIVgp41的卷曲螺旋中的顯著的空腔是有吸引力的藥物目標(biāo)。
據(jù)假設(shè)gp-41介導(dǎo)膜融合的機(jī)制可能涉及一種卷曲螺旋三聚體的形成，其被認(rèn)為是推動(dòng)從靜止到融合狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，如例如對于流感血凝素的描述(Wilson，I.A.，等，Nature 289(1981)366-373；Carr，C.M.和Kim，P.S.，Cell 73(1993)823-832；Bullough，P.A.，等，Nature 371(1994)37-43)。
有包膜病毒的C肽(對應(yīng)于C螺旋的肽)，如DP178和C34，有效地抑制HIV-1的適合實(shí)驗(yàn)室的毒株和原始分離株的膜融合(Malashkevich，V.N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)9134-9139；Wild，C.T.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國91(1994)9770-9774)。使用C肽DP178的I期臨床試驗(yàn)提示它具有導(dǎo)致病毒負(fù)荷減少的體內(nèi)抗病毒活性(Kilby，J.M.，等，Nature Medicine 4(1998)1302-1307)。gp41核心的結(jié)構(gòu)特征暗示這些肽通過一種優(yōu)勢的一負(fù)(dominant-negative)調(diào)節(jié)機(jī)制作用，其中C肽結(jié)合于gp41中心卷曲螺旋并導(dǎo)致它的失活(Chan，D.C.，等，Cell 93(1998)681-684)。
在每個(gè)卷曲螺旋界面內(nèi)部是一個(gè)由一串在N螺旋卷曲螺旋中的殘基形成的深腔，其已被提出成為用于開發(fā)抗病毒化合物有吸引力的目標(biāo)。源于C螺旋的三個(gè)殘基(Trp-628，Trp-631，和Ile-635)插入到該空腔中并造成廣泛的疏水接觸。突變分析說明包含該空腔的N-螺旋殘基中的兩個(gè)(Leu-568和Trp-571)對于膜融合活性是關(guān)鍵性的(Cao，J.，等，J.Virol.67(1993)2747-2755)。因此，以高親和力與該空腔結(jié)合并抑制正常的N和C螺旋配對的化合物可能是有效的HIV-1抑制劑。在不同的HIV-1分離株中該空腔中的殘基是高度保守的。而且，含有空腔結(jié)合區(qū)域的C肽比缺少該區(qū)域的DP178對抗性病毒的進(jìn)化更不敏感得多(Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-993)。這些觀察暗示以高度保守的卷曲螺旋表面，尤其它的空腔為目標(biāo)的高親和性配體將具有對不同HIV分離株的廣泛活性并更不可能被逃避藥物的突變體回避。
從流感病毒，莫洛尼鼠類白血病病毒和猿猴免疫缺陷病毒(在Chan，D.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)15613-15617中引證)，人呼吸道合胞病毒，埃博拉病毒，人T細(xì)胞白血病病毒，猿猴副流感病毒顯示了包膜融合蛋白的融合結(jié)構(gòu)。它說明在正粘病毒科，副粘病毒科，逆轉(zhuǎn)錄病毒科和其它類線狀病毒科各科之間的一種緊密關(guān)系，其中類跨膜糖蛋白如HIV-1的gp41，流感的血凝素，埃博拉病毒的GP2及其它使得病毒能夠進(jìn)入靶細(xì)胞(Zhao，X.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177)。
在技術(shù)水平方面，描述了用于制備肽抑制劑(C-肽)的方法(參見，例如，Root，M.J.，等，Science 291(2001)884-888；Root等描述了來源于HIV-1.HXB2和含有殘基625-661的肽C37-H6)。它是作為帶有GGR-接頭和組氨酸標(biāo)記的N40-節(jié)段被重組表達(dá)，其是在大腸桿菌中表達(dá)并從細(xì)菌裂解物的可溶性級分來純化。Zhao，X.等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)14172-14177中描述了一種recRSV-1(人呼吸道合胞病毒)的合成基因，其編碼殘基153-209，一個(gè)富含G的接頭，殘基476-524，Xa因子切割位點(diǎn)和一個(gè)組氨酸標(biāo)記。Chen.，C.H.，等，在J.Virol.69(1995)3771-3777中描述了重組表達(dá)被作為融合蛋白合成的gp41胞外結(jié)構(gòu)域，殘基540-686，融合至MBP。
已知了這類膜融合相關(guān)事件的許多肽抑制劑，其也稱為抗融合肽，所述相關(guān)事件包括例如抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒傳染未感染細(xì)胞。例如Lambert，D.M.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191，美國專利號6,013,263；6,017,536；和6,020,459和WO 00/69902，WO 99/59615，WO96/40191中描述了這類肽。在美國專利號6,093,794；6,060,065；6,020,459；6,017,536；6,013,263；5,464,933；5,656,480中和在WO 96/19495中描述了另外的抑制融合相關(guān)事件的肽來源于抑制病毒融合的HIV-Igp-41胞外域的線性肽的實(shí)例是DP-107和DP-178。DP-107是靠近N-末端融合肽的gp-41的一部分并已經(jīng)顯示為螺旋狀的，它以與卷曲螺旋結(jié)構(gòu)一致的方式強(qiáng)烈寡聚化(Gallaher，W.R.，等，Aids Res.Hum.Retrovirus 5(1989)431-440，Weissenhom，W.，等，Nature387(1997)426-430)。DP-178是源于gp-41胞外域的C-末端區(qū)域。(Weissenhom，W.，等，Nature 387(1997)426-430)。盡管在溶液中沒有可辨別的結(jié)構(gòu)，該肽和從此約束的類似物采取一種螺旋狀結(jié)構(gòu)，與gp41 N-末端卷曲螺旋三聚體的一個(gè)溝結(jié)合并且因而防止gp41轉(zhuǎn)化為融合態(tài)(Judice，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(1997)13426-13430)。
該短鏈肽通常是通過化學(xué)合成制備。例如Mergler，M.，等，TetrahedronLetters 29(1988)4005-4008和4009-4012；Andersson，L.，等，Biopolymers 55(2000)227-250；和由Jones，J.H.，J.Pept.Sci.6(2000)201-207描述了化學(xué)合成。在WO 99/48513中描述了另外的方法。
然而，化學(xué)肽合成經(jīng)受幾個(gè)缺點(diǎn)。最重要的是外消旋化，其導(dǎo)致不充分的光學(xué)純度。在肽化學(xué)中，外消旋化也就意味著在幾個(gè)手性中心中的一個(gè)處的差向異構(gòu)化。如果對于單個(gè)偶聯(lián)步驟僅僅發(fā)生1％的外消旋化，那么在100個(gè)偶聯(lián)步驟將收到僅僅61％的目標(biāo)肽(Jakubke，H.D.，肽，Spektrum Akad.Verlag，Heidelberg(1996)，198頁)。明顯的是雜質(zhì)的數(shù)量隨增長的鏈長增大并且它們的去除是越來越困難和昂貴。
高費(fèi)用和作為原材料的保護(hù)氨基酸衍生物實(shí)用性的缺乏限制了大規(guī)?；瘜W(xué)合成。一方面，這些原材料應(yīng)該過量使用以使完成反應(yīng)，另一方面，由于成本原因，安全性和環(huán)境方面它們的使用應(yīng)該是均衡的(Andersson等，Biopolymer 55(2000)227-250)。
Lepage，P.，等，在Analytical Biochemistry 213(1993)40-48中描述了用于生產(chǎn)HIV-1Rev肽的重組方法。該肽表達(dá)為具有金黃色葡萄球菌蛋白A的合成免疫球蛋白類型G(IgG)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。該肽具有大約20個(gè)氨基酸的長度，而Ig-G結(jié)合部分具有大約170個(gè)氨基酸的長度，所以表達(dá)的融合蛋白具有大約190個(gè)氨基酸的總長。表達(dá)該融合蛋白，以可溶的形式分泌在培養(yǎng)基中，并通過親和層析純化。作者報(bào)道使用該方法可能以每升培養(yǎng)物幾百毫克的數(shù)量生產(chǎn)重組蛋白。然而，由于在信號肽序列中的備選處理和融合蛋白及切割肽中的幾種翻譯后修飾導(dǎo)致該方法體系是受限制的。假定一個(gè)氨基酸的平均分子量為110道爾頓，期望的肽具有大約2,000-5,000道爾頓的分子量，然而如果將金黃色葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合域用作該融合尾部，則融合尾部具有至少170個(gè)氨基酸的長度(大約19,000D)。因此，只有10-25％的重組生產(chǎn)的蛋白是想要的肽。
Uhlen，M.，和Moks，T.，Methods Enzymol.185(1990)129-143，T.J.R.Expression of eukaryotic genes in E.coli.InGenetic Engineering(Williamson，R.編輯)，Academic Press，London，4卷，127-185(1983)；和Kopetzki，E.，等，Clin.Chem.40(1994)688-704.Ningyi，L.，等，Gaojishu Tongxun 10(2000)28-31描述了在大腸桿菌中重組表達(dá)p24 gag基因。
國際申請WO 02/103026描述了在原核宿主細(xì)胞中生產(chǎn)作為大約14至70個(gè)氨基酸長度的融合肽的抗融合肽的方法，其特征在于，在該條件下形成所述融合肽的內(nèi)含體，在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述融合肽的核苷酸，所述融合肽包括N-末端與另一個(gè)4-30個(gè)氨基酸長度的肽連接的長度約為10-50個(gè)氨基酸的所述抗融合肽；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；形成所述內(nèi)含體，將其回收和溶解；分離所述融合肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方法，其通過內(nèi)含體的途徑高產(chǎn)率重組生產(chǎn)抗融合肽，并且適合這類肽的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明因此提供一種通過在微生物宿主細(xì)胞中，優(yōu)選在原核宿主細(xì)胞中，將編碼所述抗融合肽的核苷酸表達(dá)為重復(fù)肽，分離含有所述重復(fù)肽的內(nèi)含體，溶解該內(nèi)含體，和在切割后分離抗融合肽而重組生產(chǎn)抗融合肽的方法，其特征在于使用一種變性劑在pH6.5或低于pH6.5的pH值下洗滌內(nèi)含體，在至少pH9的pH值下溶解含有重復(fù)肽的所述內(nèi)含體和切割所述重復(fù)肽以獲得所述抗融合肽。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，具有抗融合活性的重復(fù)多肽內(nèi)含體(下文也稱為融合多肽)在6.5和低于6.5的pH值下具有對變性條件的抵抗力?；诖?，可通過按照本發(fā)明的條件以一種高效方式從宿主細(xì)胞多肽和其它源于宿主細(xì)胞的雜質(zhì)中純化含有這類重復(fù)肽的內(nèi)含體，因?yàn)樵谠撟冃詶l件下包含在內(nèi)含體中的所有物質(zhì)的大多數(shù)是易于溶解的，因而可以通過在這類變性條件下簡單洗滌內(nèi)含體而去除。
在隨后步驟中，為了回收可溶的重復(fù)肽，在9和更高的pH值下將內(nèi)含體溶解，由此不需要加入去污劑或變性劑。在溶解后，化學(xué)切割或酶切割重復(fù)以獲得想要的抗融合肽。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，切割序列位于重復(fù)的抗融合肽之間，并且該重復(fù)肽包含于融合多肽之中，所述融合多肽的特征在于該重復(fù)用優(yōu)選大約1-10個(gè)氨基酸長度的所述切割序列連接在一起?？谷诤想谋旧砭哂?0-100個(gè)氨基酸的長度，由此(關(guān)于穩(wěn)定表達(dá)和形成內(nèi)含體)融合多肽長度優(yōu)選是至少大約50個(gè)氨基酸。
因此，本發(fā)明提供由內(nèi)含體途徑通過簡單洗滌內(nèi)含體和隨后在不同pH值下將它們?nèi)芙鈦碇亟M生產(chǎn)抗融合肽的一種極其簡單的方法。
發(fā)明詳述在此使用的“抗融合”和“抗膜融合”指相對于膜融合的水平，肽抑制或降低在兩種或更多結(jié)構(gòu)，例如細(xì)胞膜或病毒包膜或菌毛之間的融合事件水平的能力，所述膜融合是在不存在該肽時(shí)在所述結(jié)構(gòu)之間發(fā)生。關(guān)于這個(gè)的實(shí)例是慢病毒屬如人免疫缺陷病毒(HIV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(HPV)，麻疹病毒(MEV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)的肽抑制劑。這類抗融合肽是來源于慢病毒屬病毒包膜融合蛋白的跨膜亞基C螺旋，并且結(jié)合于各個(gè)病毒跨膜亞基的中心卷曲螺旋。
特別優(yōu)選HIV-1抗融合肽，優(yōu)選gp41 C-肽的片段。表1描述源于gp41C-肽的HIV-1抗融合肽實(shí)施例。這些抗融合肽和其片段在本發(fā)明中特別有用。
表1

*對于N-末端乙?；?或C-末端酰胺化肽；T-20(與DP178同義)和T-1249是源于I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)，T-118源于呼吸道合胞病毒(RSV)，T-257源于麻疹病毒(MV)1)WO 99/596152)Rimsky，L.T.，等，J.Virol.72(1998)986-9933)Lambert，D.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)2186-2191抗融合肽的長度不是關(guān)鍵性的。然而優(yōu)選使用大約10-100個(gè)氨基酸的長度。該長度必須足以提供在酸性pH值下抗變性劑的穩(wěn)定性。最大長度主要取決于在溶解，切割和純化過程中融合多肽的適當(dāng)處理。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的重復(fù)肽在它的N-末端與另一個(gè)大約4-30個(gè)氨基酸的肽連接。另一個(gè)肽的目的是賦予抗融合肽以另外的性能，例如改善表達(dá)(例如具有高表達(dá)率的多肽如干擾素-α-2a的N-末端片段)，純化(例如組氨酸標(biāo)記；參見例如，Zhang，J.-H.，等，Nanjing Daxue Xuebao，Ziran Kexue 36(4)(2000)515-517)或允許隨后類似乙?；蚓垡叶蓟?PEGylation)的N-末端修飾。
另一個(gè)肽是一段包含至少四個(gè)氨基酸(用于切割和/或表達(dá)目的的蛋氨酸和三個(gè)其它氨基酸)至大約30個(gè)氨基酸，優(yōu)選10至約20個(gè)氨基酸(關(guān)于核苷酸密碼子水平)的短肽序列。另一個(gè)肽的長度對于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。然而，為了提高抗融合肽的產(chǎn)率優(yōu)選另一個(gè)肽是非常短的。特別優(yōu)選另一個(gè)肽包含一些適于高水平表達(dá)或促進(jìn)切割蛋白酶接近(避免空間位阻)的氨基酸的適當(dāng)切割位點(diǎn)和/或一些氨基酸如純化或固定標(biāo)記如組氨酸標(biāo)記(對于純化方法；Hengen，P.，Trends Biochem.Sci.20(1995)285-286))和必需的和由起始密碼子編碼的蛋氨酸。
按照本發(fā)明的另一個(gè)肽也優(yōu)選在融合肽中使用以在表達(dá)、溶解、純化和肽修飾過程中保護(hù)抗融合肽的N-末端。這類融合肽在用于生產(chǎn)N-末端修飾的抗融合肽的方法中特別有價(jià)值。該方法涉及形成重組多肽作為一種融合肽，其融合部分保護(hù)N-末端。然后可以用化學(xué)保護(hù)試劑與重組融合肽反應(yīng)以選擇性保護(hù)活性側(cè)鏈基團(tuán)。接著使用至少一種切割試劑在肽和融合部分之間切割融合肽以形成一個(gè)未保護(hù)的末端氨基酸活性基團(tuán)。此后，為了N-末端乙酰化可以使用一種化學(xué)修飾試劑如乙酐或N-羥基琥珀酰亞胺乙酯修飾未保護(hù)的末端氨基酸的活性基團(tuán)。然后選擇性地將側(cè)鏈去保護(hù)以形成N-末端修飾的肽。例如在WO 94/01451；美國專利號5,635,371；和美國專利號5,656,456中描述了這類方法。
另一個(gè)肽部分優(yōu)選具有一種結(jié)構(gòu)以促進(jìn)融合肽的純化和/或固定化。為了這個(gè)目的另一個(gè)肽優(yōu)選含有一種“親和標(biāo)記”(參見Pandjaitan，B.，等，Gene 237(1999)333-342)，如聚組氨酸(約6個(gè)組氨酸殘基)等。另外，另一個(gè)肽優(yōu)選含有一個(gè)N-末端蛋氨酸(由ATG編碼)和C-末端編碼切割位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
特別優(yōu)選按照本發(fā)明的另一個(gè)肽是人干擾素-α-2a的N-末端片段，優(yōu)選具有一個(gè)包括的組氨酸標(biāo)記(標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼形式的氨基酸)
MCDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO5)MSDLPQTHSLGSR (SEQ ID NO6)MSDLPQTHHHHHHSLGSR (SEQ ID No7)按照本發(fā)明，融合多肽含有一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)，其在內(nèi)含體溶解后可被專一性切割蛋白酶(限制性蛋白酶)酶切或通過化學(xué)方法切割?？紤]待生產(chǎn)的抗融合肽的氨基酸序列來選擇蛋白酶。如果可能，必須注意限制性蛋白酶的識別/切割序列不出現(xiàn)在抗融合肽之中，并且優(yōu)選也不在另一個(gè)肽中，即，它應(yīng)該只出現(xiàn)在切割區(qū)域(接頭區(qū)域)。合適的專一性切割內(nèi)切蛋白酶是，例如Xa因子，凝血酶，枯草蛋白酶，枯草蛋白酶的BTN變體，遍在蛋白蛋白酶，凝乳酶，腸激酶，膠原酶，精確蛋白酶(precision protease)，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，內(nèi)切蛋白酶Lys-C，激肽釋放酶(Carter，P.在Ladisch，M.R.；Willson，R.C.；Painton，C.C.；Builder，S.E.，編輯.，Protein PurificationFrom Molecular Mechanisms toLarge-Scale Processes；ACS Symposium Series No.427，American ChemicalSociety，181-193頁(1990)，TEV蛋白酶(Parks，T.D.，等，Anal.Biochem.216(1994)413-417)，IgA蛋白酶(Pohlner，J.，等，Nature 325(1987)458-462)，Kex2p蛋白酶(EP-A 0 467 839)或金黃色葡萄球菌V8蛋白酶。
另一個(gè)肽的序列可優(yōu)選采用其它設(shè)計(jì)策略，其促進(jìn)在預(yù)選的切割環(huán)境中的有效切割。具體地如果預(yù)選切割試劑是一種內(nèi)肽酶，優(yōu)選另一個(gè)肽在含水的環(huán)境中是可溶的。因此，優(yōu)選具有帶電側(cè)鏈基團(tuán)和親水性質(zhì)的氨基酸包含在另一個(gè)肽中以增進(jìn)溶解性或促進(jìn)切割蛋白酶接近的任何其它氨基酸。這類氨基酸是，例如，Glu和Asp(陰離子)，Arg和Lys(陽離子)，和Ser和Thr(中性，親水性的)。如果使用精氨酸和/或賴氨酸，必須考慮到精氨酸和賴氨酸構(gòu)成胰蛋白酶切割位點(diǎn)。
典型地選擇切割位點(diǎn)以使切割結(jié)果產(chǎn)生沒有附加序列的游離的和所需的抗融合肽(例如，胰蛋白酶在Arg后切割，然后通過羧肽酶B去除Arg)。因此，切割位點(diǎn)位于每個(gè)重復(fù)的一個(gè)末端，優(yōu)選在肽重復(fù)的N-末端。這在融合多肽不包含如上定義的另一個(gè)肽的情形下同樣優(yōu)選，因?yàn)樵撉懈钗稽c(diǎn)在肽的化學(xué)修飾過程中可用于N-末端的中間保護(hù)。例如在WO92/01707和WO 95/03405中描述了化學(xué)和酶切割位點(diǎn)以及用于實(shí)現(xiàn)靠近位點(diǎn)中一個(gè)的肽鍵的切割的相應(yīng)試劑。
在下面表2中描述關(guān)于切割酶和切割序列的實(shí)例表2

化學(xué)切割

1)單字母代碼的氨基酸優(yōu)選使用胰蛋白酶，其在精氨酸和賴氨酸的C-末端專一性地切割蛋白和肽。這類酶已知是例如來源于豬，?；蛉说囊认倩蛑亟M酵母或大腸桿菌(WO 99/10503)。如果賴氨酸殘基被保護(hù)，胰蛋白酶特別適合產(chǎn)生所需的多肽。
在本發(fā)明的意義中將能夠被內(nèi)切蛋白酶切割的肽序列理解為一條短鏈肽序列，其優(yōu)選包含1-20個(gè)氨基酸，優(yōu)選1-3個(gè)氨基酸，并且含有一個(gè)適于期望內(nèi)切蛋白酶的C-末端切割位點(diǎn)。這個(gè)另外的肽優(yōu)選在N-末端和期望的內(nèi)切蛋白酶識別序列之間另外含有幾個(gè)氨基酸的組合(第一部分)，優(yōu)選選自親水性氨基酸如Gly，Thr，Ser，Ala，Pro，Asp，Glu，Arg和Lys。優(yōu)選將其中兩至八個(gè)這些另外的氨基酸是帶負(fù)電的氨基酸Asp和/或Glu的一種氨基酸一段序列用作第一部分。
只要抗融合肽不含蛋氨酸可使用BrCN切割(化學(xué)切割)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，抗融合肽在它的C-末端含有一個(gè)甘氨酸。該甘氨酸用于隨后的酶促C-末端酰胺化的目的(Bradbury，A.F.，和Smyth，D.G.，Trends Biochem.Sci.16(1991)112-115)。
因此，融合多肽的元件優(yōu)選是-抗融合肽，-切割位點(diǎn)，-用于促進(jìn)表達(dá)和/或純化的另一個(gè)肽，-在C-末端的甘氨酸。
切割位點(diǎn)對于抗融合肽從融合多肽的其它元件的釋放是必需的。因此切割位點(diǎn)位于在融合多肽中的抗融合肽之間，優(yōu)選作為一個(gè)N-末端保護(hù)基團(tuán)。
按照本發(fā)明，抗融合肽重復(fù)在形成含有所述肽和其它多肽的不溶性蛋白的內(nèi)含體的條件下在微生物，如原核生物中過量表達(dá)。用抗融合肽的單重復(fù)(兩段相同的抗融合肽序列)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)按照本發(fā)明的性質(zhì)。然而，還可使用具有多于一個(gè)重復(fù)的融合多肽，即，五個(gè)，十個(gè)或高達(dá)二十個(gè)相同的抗融合肽序列。待生產(chǎn)的融合肽必須具有適于在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)和形成內(nèi)含體的足夠的長度。通常，編碼至少約80個(gè)氨基酸，優(yōu)選＞100個(gè)氨基酸的基因是以穩(wěn)定的方式表達(dá)，不降解并且作為內(nèi)含體沉淀。沒有真正的重復(fù)上限。然而，表達(dá)編碼多于3,000個(gè)氨基酸的基因是困難的并且實(shí)際上是不常見的。
埃希氏菌屬，沙門氏菌屬，鏈霉菌屬或芽孢桿菌屬例如作為原核宿主生物是合適的。酵母(例如酵母菌屬，畢赤酵母屬，漢遜酵母屬，克魯維酵母菌屬，裂殖酵母)是優(yōu)選的真核宿主生物。為了生產(chǎn)按照本發(fā)明的融合多肽，以通常方式用含有編碼該肽的DNA的載體轉(zhuǎn)化微生物并且隨后以通常方式發(fā)酵。
內(nèi)含體發(fā)現(xiàn)在胞質(zhì)中存在并且含有在水中不溶的聚集形式的重復(fù)肽。通常，這類內(nèi)含體蛋白是變性的形式(例如，隨機(jī)連接的二硫鍵)。例如通過在細(xì)胞裂解后離心將這類內(nèi)含體與其它細(xì)胞組分分離。
按照本發(fā)明，在pH值低于6.5，優(yōu)選在約pH3-5下，在變性條件下洗滌內(nèi)含體。該變性條件奇怪地不能使融合多肽溶解到相當(dāng)大的程度，但是能夠溶解很多包括多肽的其它源于宿主細(xì)胞的雜質(zhì)。這類變性劑在技術(shù)水平上是眾所周知的，并且例如是高度濃縮的鹽酸胍溶液(例如大約6mol/l)或脲(例如大約8mol/l)。將變性劑優(yōu)選用作緩沖溶液。
在洗滌后，優(yōu)選不加去污劑或變性劑，在大約pH9或更高的堿性pH值下溶解內(nèi)含體。另外令人驚奇地發(fā)現(xiàn)該堿性條件能夠以充分的方式溶解融合多肽。在溶解后，可以切割融合多肽以回收抗融合肽。
在溶解后，可以以一種簡單的方式，例如通過大小排阻層析，離子交換層析或反相層析純化融合肽或抗融合肽。
構(gòu)建合適表達(dá)載體和基因表達(dá)的方法中的所有另外的步驟是當(dāng)今技術(shù)水平的并且對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟悉的。例如在Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，美國中描述了該方法。
存在大量的描述通過內(nèi)含體途徑在微生物/原核生物中重組生產(chǎn)蛋白的出版物。該綜述的實(shí)例是Misawa，S.，等，Biopolymers 51(1999)297-307；Lilie，H.，Curr.Opin.Biotechnol.9(1998)497-501；Hockney，R.C.，TrendsBiotechnol.12(1994)456-463。
按照本發(fā)明的肽在微生物/原核生物中過量表達(dá)。過量表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)含體的形成。由起始密碼子編碼的和在上述實(shí)例中提及的蛋氨酸主要在宿主細(xì)胞中表達(dá)/翻譯過程中去除。用于在微生物/原核生物中過量表達(dá)蛋白的常規(guī)方法在當(dāng)今技術(shù)水平已經(jīng)眾所周知很長時(shí)間。在該領(lǐng)域中的出版物的實(shí)例是Skelly，J.V.，等，Methods Mol.Biol.56(1996)23-53；Das，A.，Methods Enzymol.182(1990)93-112；和Kopetzki，E.，等，Clin.Chem.40(1994)688-704。
在原核生物中過量表達(dá)意味著使用具有啟動(dòng)子如tac或lac啟動(dòng)子(EP-B 0 067 540)的優(yōu)化的表達(dá)盒(美國專利號6,291,245)。通常，通過使用含有化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子或通過溫度改變誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的載體可以進(jìn)行過量表達(dá)。適于大腸桿菌的有用啟動(dòng)子是溫度-敏感的λPL啟動(dòng)子(參見EP-B 0 041 767)。另一個(gè)有效的啟動(dòng)子是tac啟動(dòng)子(參見美國專利號4,551,433)。這類用于原核生物如大腸桿菌的強(qiáng)調(diào)節(jié)信號通常來源于攻擊細(xì)菌的噬菌體(參見Lanzer，M.，等，Proc.Natl.，Acad.Sci.美國85(1998)8973-8977；Knaus，R.，和Bujard，H.，EMBO Journal 7(1988)2919-2923；對于λT7啟動(dòng)子Studier，F(xiàn).W.，等，Methods Enzymol.185(1990)60-89)；對于T5啟動(dòng)子EP-A 0 186 069；Stüber，D.，等，System for high-levelproduction in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；InImmunologicalMethods IV(1990)121-152)。
通過使用該過量生產(chǎn)的原核生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，在至少構(gòu)成細(xì)胞總表達(dá)蛋白的10％，典型地30-40％，偶爾高達(dá)50％的水平上生產(chǎn)按照本發(fā)明的肽。
在此使用的“內(nèi)含體”(IBs)指在微生物/原核生物中過量表達(dá)編碼核苷酸之后重組生產(chǎn)的一種不溶形式的多肽。該現(xiàn)象在本領(lǐng)域中是廣泛了解的并且例如由Misawa S.，和Kumagai，I.，Biopolymers 51(1999)297-307)；Guise，A.D.，等，Mol.Biotechnol.6(1996)53-64；和Hockney等，Trends Biotechnol.12(1994)456-463綜述。
優(yōu)選通過使用具有大約9或更高pH值的水溶液進(jìn)行內(nèi)含體的溶解。最優(yōu)選的是10.0或更高的pH值。對于溶解不需要加入去污劑或變性劑。按照實(shí)施例7可以容易地確定優(yōu)化的pH值。因?yàn)閺?qiáng)堿條件可使多肽變性，明顯的存在一個(gè)優(yōu)化的pH值范圍。發(fā)現(xiàn)這個(gè)優(yōu)化的范圍在pH9和pH12之間。
按照在本領(lǐng)域已知的方法可以制備編碼融合肽的核酸(DNA)。更優(yōu)選用另外的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄元件擴(kuò)展核酸序列以優(yōu)化在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。優(yōu)選通過化學(xué)合成生產(chǎn)適合表達(dá)的核酸(DNA)。該方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟悉的，并且例如在Beattie，K.L.，和Fowler，R.F.，Nature 352(1991)548-549；EP-B 0 424 990；Itakura，K.，等，Science 198(1977)1056-1063中描述。修飾按照本發(fā)明的肽的核酸序列也可能是有利的。
該修飾是例如-為了引入限制性酶的各種識別序列以易化連接，克隆和突變的步驟而修飾核酸序列；-修飾核酸序列以引入適于宿主細(xì)胞的優(yōu)選的密碼子；-為了優(yōu)化在宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)使用另外的調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄元件擴(kuò)展核酸序列。
提供下列實(shí)施例，參考文獻(xiàn)，圖1和序列表以幫助理解本發(fā)明，其真正的范圍在后附的權(quán)利要求中闡明。應(yīng)當(dāng)理解可以在未背離本發(fā)明的精神的條件下對闡明的程序進(jìn)行修改。


圖1顯示表達(dá)載體pBRori-URA3-LACI-RFN-Edel。
原材料在美國專利號6,291,245中描述了用于表達(dá)按照本發(fā)明的多聚體肽前體蛋白的大腸桿菌宿主/載體系統(tǒng)(大腸桿菌宿主菌株和基本載體)。常規(guī)方法重組DNA技術(shù)如在Sambrook，J.，等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊；冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989中所描述使用標(biāo)準(zhǔn)方法來操作DNA。按照制造廠商的說明書使用分子生物學(xué)試劑。
蛋白測定使用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)[T-重復(fù)ε＝148680cm2/mol；IFN-α-2a；ε＝18020cm2/mol；F9a＝44650cm2/mol]，通過測定在280nm處的光密度(OD)測定多聚體T-重復(fù)融合蛋白的蛋白濃度。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1合成T-重復(fù)融合基因1.1T-重復(fù)融合基因的基因設(shè)計(jì)人工T-重復(fù)融合基因編碼具有27,242D分子量的217個(gè)氨基酸的融合蛋白。該融合蛋白由人干擾素-α-2a N-末端的13個(gè)氨基酸(MCDLPQTHSLGSR｜SEQ ID NO5)；載體肽)和通過胰蛋白酶可切割的肽接頭(GR)連接的5個(gè)拷貝的抑制性HIV肽T-1357(WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO1)，目標(biāo)肽)組成。
為了將T-重復(fù)結(jié)構(gòu)基因插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel(生產(chǎn)和描述參見實(shí)施例2)，在5’末端上游插入一個(gè)合成的核糖體RBSII結(jié)合位點(diǎn)和單個(gè)EcoRI內(nèi)切酶切割位點(diǎn)并在3’末端上游插入單個(gè)的CelII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)。
1.2T-重復(fù)融合基因的基因合成通過化學(xué)合成從寡核苷酸制備RBSII T-重復(fù)基因，其是大約690bp長并被單個(gè)EcoRI和CelII限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)側(cè)接。通過寡核苷酸的退火和連接裝配雙鏈RBSII T-重復(fù)基因并隨后作為一個(gè)長度為691bp的EcoRI/CellI片段克隆于一種大腸桿菌質(zhì)粒中。將想要的質(zhì)粒命名為pT-重復(fù)。通過DNA測序證實(shí)克隆的RBSII T-重復(fù)基因預(yù)先確定的DNA序列。
實(shí)施例2大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建2.1起始質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel的構(gòu)建質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel是用于在大腸桿菌中表達(dá)干擾素-α-2a(IFN-α-2a)的一種載體。它是基于IFN-α-2b的表達(dá)質(zhì)粒OripBR-URA3-EK-IFN(美國專利號6,291,245)。pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel與OripBR-URA3-EK-IFN區(qū)別在一個(gè)另外存在的lacI抑制基因和一個(gè)IFN-α-2a基因而不是一個(gè)IFN-α-2b基因。IFN-α-2a和IFN-α-2b只區(qū)別在位置21處的一個(gè)氨基酸(Lys21Arg交換)。lacI抑制基因來自質(zhì)粒pUHA1(Stüber，D.，等，System for high-level production in Escherichia coli andrapid application to epitope mapping，preparation of antibodies，and structure-function analysis；InImmunological Methods IV(1990)121-152)。使用引物N1(SEQ ID NO12)和N2(SEQ ID NO13)，NotIN1 5′-AAAAAAGCGGCCGCGACAATTCGCGCGCGAAGGCG-3′NotIN2 5′-AAAAAAGCGGCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGG-3′按照由Mullis，K.B.，和Faloona，F(xiàn).A.，在Methods Enzymol.155(1987)335-350中描述的方法，通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增它，并且隨后作為大約1210bp長度的NotI片段連接于OripBR-URA3-EK-IFN單一的NotI切割位點(diǎn)中。
2.2表達(dá)載體pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)的構(gòu)建從質(zhì)粒pT-重復(fù)(參見實(shí)施例1.2)分離作為大約690bp長度的EcoRI/CelII片段的T-重復(fù)基因，并隨后連接至用EcoRI和CelII消化的大約3.1kbp長的pBRori-URA3-LacI-RFN載體片段中。通過限制性酶切圖譜鑒定期望的質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)，并且通過DNA測序再次證實(shí)亞克隆的T-重復(fù)基因。
實(shí)施例3在大腸桿菌中表達(dá)T-重復(fù)基因?yàn)榱吮磉_(dá)按照本發(fā)明的融合基因，采用一種大腸桿菌宿主/載體系統(tǒng)，其通過互補(bǔ)大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型(PyrF)(美國專利號6,291,245)能夠進(jìn)行不含抗生素的質(zhì)粒選擇。
3.1轉(zhuǎn)化和通過在選擇性培養(yǎng)基中互補(bǔ)一種pyrF營養(yǎng)缺陷型的細(xì)胞培養(yǎng)為了表達(dá)T-重復(fù)基因，用在實(shí)施例2.2中描述的表達(dá)質(zhì)粒pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株[命名為UT5600(ΔpyrF)]。轉(zhuǎn)化的UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)細(xì)胞首先在37℃下在瓊脂平板上生長，隨后在含有0.5％酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)直至在550nm處的光密度(OD550)為0.6-0.9，然后用IPTG(1-5mmol/l的最終濃度)誘導(dǎo)。在37℃誘導(dǎo)4-16小時(shí)后，通過離心收獲細(xì)胞，用50mmol/l的磷酸鉀緩沖液，pH6.5，洗滌，并儲存在-20℃直至進(jìn)一步的處理。
3.2表達(dá)分析為了表達(dá)分析，將源于3OD550nm單位(1OD550nm＝在550nm處OD為1的1ml細(xì)胞懸浮物)離心培養(yǎng)基的細(xì)胞沉淀重懸浮在0.25ml 10mol/ml的磷酸鉀緩沖液，pH6.5中，并且通過超聲處理(在50％強(qiáng)度兩個(gè)30秒的脈沖)使細(xì)胞裂解。沉淀不溶的細(xì)胞成分(14,000rpm，5min)并且將上清液與1/5體積(體積)5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍(lán))混合。將不溶解的細(xì)胞殘?jiān)糠?沉淀)重懸浮在0.3ml 1×SDS樣品緩沖液中，將樣品在95℃溫育5min并再次離心。隨后，通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)(Laemmli，U.K.，Nature 227(1970)680-685)分離蛋白并用考馬斯亮藍(lán)R染料染色。
合成的T-重復(fù)融合蛋白是均一的并且發(fā)現(xiàn)是以不溶解的蛋白聚集體，所謂的內(nèi)含體(IBs)的形式全部在不溶解的細(xì)胞殘?jiān)糠种?。在所有克隆中表達(dá)產(chǎn)率在測量準(zhǔn)確范圍內(nèi)是可比較的并且是相對于總大腸桿菌蛋白的30-60％。
實(shí)施例4為重組生產(chǎn)T-重復(fù)的大腸桿菌101高細(xì)胞密度發(fā)酵預(yù)培養(yǎng)物為了制備預(yù)培養(yǎng)物，在一個(gè)1000ml的三角燒瓶中用1ml大腸桿菌UT5600ΔpyrF pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)甘油儲存物接種于300ml M9+培養(yǎng)基(用0.5％酪蛋白氨基酸和每個(gè)0.9g/l的Trp，Pro和Leu補(bǔ)充的M9培養(yǎng)基)。培養(yǎng)物在150rpm的外心搖床上在37℃溫育大約6小時(shí)直至OD578nm達(dá)到3.0。
101補(bǔ)料分批主發(fā)酵在發(fā)酵開始，將預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至10升發(fā)酵罐中。主要培養(yǎng)物在限定的M9鹽培養(yǎng)基中生長直至OD578nm達(dá)到20，所述限定的M9鹽培養(yǎng)基含有1.4％甘油而不是葡萄糖，2％酪蛋白氨基酸和每個(gè)0.1％的氨基酸Trp，Leu和Pro。隨后，開始使用一個(gè)甘油酵母劑量(母液30％酵母提取物和33％甘油)進(jìn)料培養(yǎng)物，根據(jù)培養(yǎng)物pH值的發(fā)展其流速在0.8-3.5ml/min之間變化，從而避免了任何另外的校正助劑(H3PO4，KOH)的加入。pH保持在pH7.0，通過控制rpm將pO2保持在50％。
在OD578nm為70時(shí)加入1.5mmol/l的IPTG，并誘導(dǎo)基因/蛋白表達(dá)。整個(gè)發(fā)酵耗費(fèi)大約36小時(shí)并且在OD578nm為160-180時(shí)終止。
收獲生物量用無逆流離心機(jī)(13,000rpm，13l/h)將發(fā)酵罐的內(nèi)容物離心，并將收獲的生物量儲存在-20℃直至進(jìn)一步處理。
實(shí)施例55.1標(biāo)準(zhǔn)方法細(xì)胞裂解和制備IBs在0℃將200g大腸桿菌細(xì)胞(濕重)懸浮在110.1mol/l Tris-HCl，pH7.0中，加入300mg溶菌酶并在0℃溫育20分鐘。隨后，通過高壓分散的方法將細(xì)胞完全機(jī)械裂解并通過加入2ml 1mol/l MgCl2和10mgDNAse在25℃消化DNA 30分鐘。此后，將500ml 60mmol/l EDTA，6％Triton X-100和1.5mol/l NaCl，pH7.0與裂解溶液混合并在0℃溫育另外30分鐘。隨后，通過離心沉淀不溶解的組分(細(xì)胞殘?jiān)虸Bs)。
將沉淀懸浮在110.1mol/l Tris-HCl，20mmol/l EDTA，pH6.5中，25℃溫育30分鐘并通過離心分離IB制劑。
5.2按照本發(fā)明的方法細(xì)胞裂解和制備IBs將200g大腸桿菌細(xì)胞(濕重)懸浮在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0中，加入300mg溶菌酶并在0℃溫育20分鐘。隨后，通過高壓分散的方法將細(xì)胞完全機(jī)械裂解，通過加入2ml 1mol/l MgCl2和10mgDNAse在25℃消化DNA 30分鐘，并且通過離心沉淀不溶解組分(細(xì)胞殘?jiān)虸Bs)。
此后，用0.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0，洗滌沉淀兩次。為此，將沉淀在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.5中懸浮兩次，在攪拌同時(shí)在25℃溫育30分鐘，并且通過離心分離。
5.3按照本發(fā)明的方法細(xì)胞裂解和制備高純度IBs。
在0℃將200g大腸桿菌細(xì)胞(濕重)懸浮在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0之中，加入300mg溶菌酶并在0℃溫育20分鐘。隨后，通過高壓分散的方法將細(xì)胞完全機(jī)械裂解，通過加入2ml 1mol/l MgCl2和10mg DNAse在25℃消化DNA 30分鐘，并且通過離心沉淀不溶解組分(細(xì)胞殘?jiān)虸Bs)。
此后，用5.5mol/l鹽酸胍(和8mol/l脲，分別地)和10mol/l EDTA，pH3.0洗滌細(xì)胞兩次。為此，將沉淀在5.5mol/l鹽酸胍(和8mol/l脲，分別地)和10mol/l EDTA，pH3.0中懸浮兩次，在攪拌同時(shí)在25℃溫育10-30分鐘，并且通過離心分離。
此后，用0.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.0洗滌細(xì)胞兩次至三次。為此，將沉淀在110.1mol/l磷酸鉀緩沖液，pH5.5中懸浮兩至三次，在攪拌同時(shí)在25℃溫育30分鐘，并且通過離心分離。
實(shí)施例6在酸性范圍內(nèi)在變性劑存在的條件下T-重復(fù)IBs的溶解度與“標(biāo)準(zhǔn)”IBs(IFN-α-2a和F9a)的比較將待測的IBs[IFN-α-2a如在實(shí)施例2.1，3.1，4和5.1中描述制備，然而使用UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel細(xì)胞而不是UT5600(△pyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-重復(fù)細(xì)胞；F9a如在WO 97/47737中所描述制備；T-重復(fù)如在實(shí)施例2.2，3.1，4和5.2中所描述制備]在攪拌的同時(shí)在室溫下以1g/20ml的濃度各自重懸浮于a)5.5mol/l鹽酸胍和10mmol/l EDTA，pH3.0和
b)8mol/l脲和10mmol/EDTA，pH3.0在12-24小時(shí)后，在各種情形中取200μl樣品，通過離心(Eppendorf5415離心機(jī)，14.000rpm，10min)沉淀不溶解組分，并且用20μl 5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍(lán))與80μl上清液混合。在SDSPAGE前將含有5.5mol/l鹽酸胍的上清液對8mol/l的脲透析。用200μl磷酸鉀緩沖液，pH5.0洗滌不溶解的沉淀一次，然后重懸浮于250μl1×SDS樣品緩沖液中。在通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)的方法分離蛋白并用考馬斯亮藍(lán)R染料染色前將所有的樣品在95℃溫育5分鐘。此后，為了測定多肽的含量光密度分析相關(guān)的凝膠帶(表3)。
表3a5.5mol/l鹽酸胍，10mmol/l EDTA，pH3

表3b8mol/l脲，10mol/l EDTA，pH3

實(shí)施例7
在堿性范圍內(nèi)在含水溶液中T-重復(fù)IBs的溶解度與“標(biāo)準(zhǔn)”IBs(IFN-α-2a和F9a)的比較在攪拌的同時(shí)室溫下在待測試的pH值(8.0，9.0，10.0，11.0和12.0)下，將待溶解的IFN-α-2a，F(xiàn)9a-和T-重復(fù)IBs(依照實(shí)施例6中的描述生產(chǎn))分別溫育于a)50mmol/l Tris HCl和b)50mmol/l NaHCO3。
4小時(shí)后，在各種情形中取200μl樣品，通過離心(14.000rpm，15min)沉淀不溶解組分。用20μl 5×SDS樣品緩沖液(1×SDS樣品緩沖液50mmol/l Tris-HCl，pH6.8，1％SDS，50mmol/l DTT，10％甘油，0.001％溴酚藍(lán))與80μl上清液混合。用200μl 50mmol/l的磷酸鉀緩沖液，pH6.5洗滌不溶解的沉淀一次，并重懸浮于250μl 1×SDS樣品緩沖液中。在通過SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳(PAGE)的方法分離蛋白并用考馬斯亮藍(lán)R染料染色前將樣品在95℃溫育5分鐘。此后，為了測定多肽的含量光密度分析相關(guān)的凝膠帶(表4)。
表4aIFN-α-2a

表4bF9a

表4cT-重復(fù)

實(shí)施例88.1標(biāo)準(zhǔn)方法在變性條件下溶解IBs通過在25℃攪拌兩小時(shí)將20g IB沉淀(濕重)懸浮在200ml 50mmol/lTris-HCl緩沖液，6mol/l鹽酸胍(和8mol/l脲，分別地)，10mmol/l EDTA，pH7.0之中。通過離心分離不溶解的組分并且進(jìn)一步處理透明的上清液。
8.2按照本發(fā)明的方法將IBs溶解于含水微堿性緩沖液中通過在25℃攪拌4-16小時(shí)將10g IB沉淀(濕重)懸浮在200ml 50mmol/l Tris-HCl緩沖液，pH9(和50mmol/l NaHCO3緩沖液，pH9-10，分別地)之中。通過離心分離不溶解的組分并且通過用胰蛋白酶酶切進(jìn)一步處理[任選地，在用檸康酸酐衍生化T-重復(fù)融合蛋白的伯氨基基團(tuán)(賴氨酸的ε-氨基基團(tuán))之后]透明的上清液。
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<223>人工序列的描述肽T1357<400>1Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>2<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽T680<400>2
Tyr Thr Ser Leu I1e His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>3<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽RSV118<400>3Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu1 5 10 15Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu His Asn Val Asn Ala Gly20 25 30Lys Ser Thr35<210>4<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述肽MY257<400>4Leu His Arg Ile Asp Leu Gly Pro Pro Ile Ser Leu Glu Arg Leu Asp1 5 10 15Val Gly Thr Asn Leu Gly Asn Ala Ile Ala Lys Leu Glu Asp Ala Lys20 25 30Glu Leu Leu35<210>5
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<223>人工序列的描述切割序列
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<223>人工序列的描述引物N2<400>13aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg3權(quán)利要求
1.用于通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)一種編碼作為重復(fù)肽的所述抗融合肽的核酸，分離含有所述重復(fù)肽的內(nèi)含體，溶解所述內(nèi)含體，并在切割后分離所述抗融合肽來重組生產(chǎn)一種抗融合肽的方法，其特征在于在pH6.5或低于pH6.5的pH值下使用一種變性劑洗滌所述內(nèi)含體，在至少pH9的pH值下溶解含有所述重復(fù)肽的所述內(nèi)含體并切割所述重復(fù)肽以獲得所述抗融合肽。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其特征在于洗滌是在pH3-5的條件下進(jìn)行。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述重復(fù)肽是在溶解所述內(nèi)含體過程中或之后被切割。
4.一種編碼一種融合多肽的核酸，所述融合多肽包括(在N-末端至C-末端方向)a)一種作為至少兩個(gè)相同抗融合肽序列的重復(fù)肽的抗融合肽；b)一個(gè)位于所述抗融合肽之間的切割位點(diǎn)。
5.依照權(quán)利要求4的核酸，其特征在于所述抗融合肽包括10-100個(gè)氨基酸。
6.依照權(quán)利要求4或5的核酸，其特征在于所述重復(fù)包括2-20個(gè)相同的抗融合肽序列。
7.一種含有一種融合多肽的內(nèi)含體制劑，所述融合多肽包括(在N-末端至C-末端方向)a)一種作為大約10-100個(gè)氨基酸長度的重復(fù)肽的抗融合肽；b)一個(gè)位于所述抗融合肽之間的切割位點(diǎn)。
全文摘要
用于通過在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)一種編碼作為重復(fù)肽的所述抗融合肽的核酸，分離含有所述重復(fù)肽的內(nèi)含體，溶解所述內(nèi)含體并在切割后分離所述抗融合肽來重組生產(chǎn)一種抗融合肽的方法，其特征在于在pH6.5或低于pH6.5的pH值下使用一種變性劑洗滌所述內(nèi)含體，在至少pH9的pH值下溶解含有所述重復(fù)肽的所述內(nèi)含體并切割所述重復(fù)肽以獲得所述抗融合肽。
文檔編號C12P21/00GK1502698SQ200310116190
公開日2004年6月9日 申請日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月19日
發(fā)明者卡奇馬雷克·亞歷山德拉, 科佩茨基·埃哈德, 尚茨·克里斯蒂安, 澤貝爾·斯特凡, 斯特凡, 克里斯蒂安, 卡奇馬雷克 亞歷山德拉, 基 埃哈德 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司