專利名稱：一種重組人apoE擬肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物及應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種重組的人載脂蛋白E(apoE)模擬活性肽，同時涉及一種載脂蛋白E(apoE)擬肽的制備方法，還涉及一種載脂蛋白E(apoE)擬肽在治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化及其所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化是多種復(fù)雜的病因(氧化應(yīng)激、炎癥、血脂紊亂、高糖等)誘發(fā)下的血管壁功能失調(diào)，其特征是動脈壁內(nèi)膜下脂質(zhì)聚積及炎性細(xì)胞浸潤，包括巨噬細(xì)胞泡沫化、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的大量積聚，最后形成動脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致血管管腔變 窄，彈性減少，影響動脈血流，嚴(yán)重時完全堵塞血管或斑塊破裂、并發(fā)血栓栓塞，從而導(dǎo)致血流灌注的組織器官局部缺血，其并發(fā)癥或嚴(yán)重后果包括冠狀動脈粥樣硬化引發(fā)心肌缺血造成心絞痛、心肌梗塞，腦動脈和頸動脈粥樣硬化引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血造成中風(fēng)，外周循環(huán)或內(nèi)臟循環(huán)的動脈粥樣硬化導(dǎo)致的器官損傷(如腎動脈狹窄造成繼發(fā)性高血壓)。動脈粥樣硬化和動脈硬化在定義內(nèi)涵上有不同的病理特征，本發(fā)明中所指的動脈粥樣硬化是由于動脈粥樣斑塊使動脈硬化或失去彈性，動脈硬化是指任何一個或多個原因造成的動脈硬化或失去彈性。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體血脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷及炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。動脈粥樣硬化發(fā)生的基本病理過程主要為早期在氧化應(yīng)激及炎癥因素的刺激下，內(nèi)皮功能受損，內(nèi)皮細(xì)胞激活分泌黏附分子，使循環(huán)中單核細(xì)胞向受損內(nèi)膜下滲入、遷移，演變成巨噬細(xì)胞后，通過細(xì)胞因子的釋放、與其他細(xì)胞的相互作用參與動脈粥樣硬化的進(jìn)程，同時巨噬細(xì)胞自身攝取大量氧化低密度脂蛋白(LDL)轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞而成為斑塊中心，故巨噬細(xì)胞在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展全過程中扮演著多方面的重要角色。目前臨床上治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的推薦方案包括藥物防治和手術(shù)治療。藥物常以降脂/膽固醇為目的，具體的廣泛采用的是降低LDL-膽固醇(LDL-C)的藥物，包括他汀類(statins)，HMGCoA還原酶抑制劑，消膽胺等降低膽固醇吸收的藥物，以及丙丁酚等。其次常采用的阿司匹林用于抑制血栓形成，抗氧化抗炎作用的藥物也被人們廣泛接受應(yīng)用。手術(shù)治療主要適用于動脈粥樣硬化已產(chǎn)生嚴(yán)重并發(fā)癥或后果的情況，如球囊成形術(shù)、內(nèi)膜切除術(shù)、內(nèi)置支架、血管搭橋術(shù)等介入治療手術(shù)。當(dāng)然，由于動脈粥樣硬化所致的嚴(yán)重并發(fā)癥和后果，最好還是治療或控制危險因素，如保證合理低脂、低膽固醇、清淡飲食，積極治療和控制高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、糖尿病、高血壓等相關(guān)疾病、注意經(jīng)常鍛煉、降低體重、改善心功能，增強(qiáng)心血管保護(hù)因素等。已證實高密度脂蛋白(HDL)是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要負(fù)相關(guān)因素，HDL具有抗動脈粥樣硬化的作用涉及多種機(jī)制，包括促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、抗炎、抗氧化、抗血栓形成、促進(jìn)一氧化氮產(chǎn)生、以及保護(hù)內(nèi)皮功能等。由于針對LDL-C的降脂治療仍存在心血管疾病發(fā)生的危險性，且急、慢性炎癥狀態(tài)下，HDL功能的異常較HDL-膽固醇(HDL-C)濃度的改變更為突出，因此針對HDL功能的治療成為代謝性疾病和炎癥狀態(tài)下抑制動脈粥樣硬化形成的重要途徑。在HDL眾多優(yōu)點中，介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運和抗炎兩個功能尤為重要，而且可能存在本質(zhì)上相互聯(lián)系。近年的研究表明HDL對巨噬細(xì)胞的抗炎作用可能部分是通過ABCAl和ABCGl介導(dǎo)的膽固醇外流實現(xiàn)的。目前增強(qiáng)HDL功能的藥物和HDL類似物的研發(fā)在動脈粥樣硬化治療上顯示了巨大的應(yīng)用前景。有研究證實他汀類藥物治療就能糾正HDL的功能障礙，恢復(fù)其抗炎作用；傳統(tǒng)治療中的貝特類藥物也能有效改善代謝性疾病中HDL顆粒的功能；目前已上市的或正在研發(fā)中的一系列HDL增強(qiáng)劑還包括尼克酸(niacin)、膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(CETP)抑制劑、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)激活劑、載脂蛋白Al (apoAI)表達(dá)刺激物、內(nèi)皮脂肪酶抑制劑、PPAR/LXR激動劑以及HDL載脂蛋白或其類似物。其中尼克酸因其明顯的升高HDL作用而成為最常規(guī)的一種，然而，其引起面色潮紅的不良反應(yīng)顯然限制了它的使用，并且其抗動脈粥樣硬化和減少心血管疾病發(fā)生的效果還待考證。其他的治療劑也都在不同的改進(jìn)階段。 HDL是一種脂質(zhì)和蛋白含量大致均等的異質(zhì)性脂蛋白，組成包括多種載脂蛋白、甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯，其中載脂蛋白包括apo Al (占65-70%)，apO AU (20-25%),apo AIV, apo AV, apo C, apo D, apo E, apo J,等。目前已證實HDL主要有益作用可歸因于它主要的載脂蛋白apoAI和apoE，這促使研究者開發(fā)apoAI、apoE或者它們的擬肽以增強(qiáng)HDL的功能。利用人全長apoAI或其突變體apoAI-milano,無脂或與磷脂重構(gòu)的HDL,還有短的apoAI模擬肽開發(fā)增強(qiáng)HDL功能和抗動脈粥樣硬化的藥物，都聚集了人們巨大的興趣，部分研發(fā)已在臨床試驗中取得可喜效果。ApoE是HDL另一種主要的載脂蛋白，同時apoE也是其他脂蛋白包括極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒的成分，在脂蛋白代謝和動脈粥樣硬化的致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用而使apoE成為一種多功能蛋白，其主要作用是介導(dǎo)循環(huán)中膽固醇的清除和血管壁巨噬細(xì)胞膽固醇的外流。它是apoE受體、LDL受體(LDLR)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)的配體，介導(dǎo)攝取脂蛋白殘粒促成肝臟對血漿膽固醇的清除。ApoE還通過其受體介導(dǎo)途徑下調(diào)血管壁巨噬細(xì)胞活化，進(jìn)一步抑制與動脈粥樣硬化形成有關(guān)的級聯(lián)反應(yīng)(細(xì)胞泡沫化、平滑肌細(xì)胞增殖等)。無論是游離的蛋白還是HDL顆粒的組分，apoE可促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運、抗氧化、抗炎、抗平滑肌細(xì)胞增殖和激活HDL中LCAT活性等，從而實現(xiàn)HDL的部分功能，降低或減輕了動脈粥樣斑塊的形成，達(dá)到抗動脈粥樣硬化的效果。人血漿中apoE濃度平均為5mg/dL。apoE主要由肝臟產(chǎn)生，也有極少量可由血管壁局部的巨噬細(xì)胞分泌，在動物研究中發(fā)現(xiàn)由血管壁巨噬細(xì)胞分泌的apoE可顯著降低動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，即使低apoE濃度改變不了血漿中高膽固醇水平。例如，apoE基因缺陷型(apoE+)小鼠被認(rèn)為是高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化的典型動物模型，早在1995年，Linton和Fazio等就報道了利用骨髓移植技術(shù)使apoE+小鼠獲得野生型小鼠能分泌apoE的巨噬細(xì)胞，其結(jié)果可顯著降低apoE+小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成；而野生型小鼠的巨噬細(xì)胞如更換為apoE+鼠的巨噬細(xì)胞，則加速動脈粥樣硬化改變，即使不影響肝臟合成主要的apoE。申請者也曾證實，補(bǔ)償性給予巨卩遼細(xì)胞源性的apoE,可有效改善apoE和SRBI雙基因敲除鼠的高脂血癥并緩解動脈粥樣硬化病程，避免其早發(fā)性心衰及幼年夭折。另外apoE在體內(nèi)具有再循環(huán)功能，apoE以乳糜微粒的形式被肝細(xì)胞吞噬，隨后一直分離，游離的apoE在胞內(nèi)與新合成的apoAI結(jié)合后，胞吐進(jìn)入血循環(huán)系統(tǒng)成為HDL的重要組分，隨著HDL的成熟，apoE從HDL中脫落再次與乳糜微粒結(jié)合而循環(huán),該機(jī)制為apoE的革巴向性治療提供非常有益的生物特性，可延長生物半衰期，增加載脂蛋白的功能，這使得人們相信apoE是一類有前景的體內(nèi)HDL功能增強(qiáng)劑，有望成為一種理想的防治動脈粥樣硬化的藥物。研究顯示人類apoE基因具有多態(tài)性，可分別表達(dá)出3種異構(gòu)體apoE2、apoE3和apoE4，其中ε 3為野生型基因，占總基因70%-80%， ε2和ε 4則為異構(gòu)體基因，分別占5% -10%和10% -15%，人群中約14%個體的血漿膽固醇升高就源于apoE的基因多態(tài)性即表達(dá)的功能異構(gòu)體。野生型apoE3肽段的112位為半胱氨酸(Cys)殘基、158位為精氨酸(Arg)殘基，apoE2則112位和158位均為Cys, E4的112位和158位均為Arg。異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致apoE2、apoE4在體內(nèi)代謝速率或受體結(jié)合力與apoE3明顯不同，而表現(xiàn)出血膽固醇水平的升高。大量研究均已證實，存在apoE基因突變型異構(gòu)體的人群中，其內(nèi)源性apoE功能降低或異構(gòu)體是發(fā)生或易感動脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’ sdisease)等相關(guān)疾病的重要因素。ApoE按基本功能可分為氨基端(N末端)(第1-191氨基酸殘基)區(qū)域和羧基端(C末端)(第192-299氨基酸殘基)區(qū)域組成，包含兩個結(jié)構(gòu)功能域，分別為LDLR結(jié)合域和脂質(zhì)結(jié)合域，即4個螺旋束N端的負(fù)責(zé)結(jié)合LDLR和HSPG，C端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合脂質(zhì)和A β肽。apoE的N端呈球形結(jié)構(gòu)，其中第131-162位氨基酸肽段為LDLR結(jié)合域，尤其結(jié)構(gòu)相對保守的第141-150位氨基酸肽段由一串帶正電荷的精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)組成，可通過離子鍵與負(fù)電性的LDLR結(jié)合，被認(rèn)為是LDLR結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域肽段；C端結(jié)構(gòu)域的一個雙性α螺旋模序則是脂質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其第220 260氨基酸殘基的α螺旋首先與脂質(zhì)結(jié)合后，再引發(fā)N末端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變。這種脂質(zhì)引發(fā)的N端結(jié)構(gòu)域的改變保證了對LDLR結(jié)合的能力。Mahley等報道其中第244-272氨基酸肽段為主要的脂質(zhì)結(jié)合域，Dr. Fan早期曾對多種屬間的apoE的C端脂質(zhì)結(jié)合域(第200-299位氨基酸肽段)進(jìn)行了比較，提出其螺旋結(jié)構(gòu)中的保守肽段(第253-289氨基酸殘基)和234-254氨基酸肽段可能是發(fā)揮脂質(zhì)結(jié)合能力的主要結(jié)構(gòu)，并對全長apoE進(jìn)行的核磁共振光譜學(xué)分析，顯示絞鏈區(qū)肽段(第192-215位氨基酸肽段)對于調(diào)控功能結(jié)構(gòu)域間的相互作用發(fā)揮著重要作用。鑒于apoE在脂質(zhì)代謝中的重要性及多態(tài)性的異構(gòu)體“失功能性”，靶向增加機(jī)體正常功能的apoE水平，有望成為防治動脈粥樣硬化的重要策略。但是，apoE (34kD)含有299個氨基酸，要獲得高表達(dá)產(chǎn)率的apoE目前并未成功，其次全長的apoE作為治療藥物應(yīng)用于臨床還存在一些其它問題，包括溶解度低、易于在體內(nèi)被酶降解產(chǎn)生細(xì)胞毒性片段，作為藥物開發(fā)時分子量較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時以基因工程技術(shù)手段進(jìn)行apoE的基因調(diào)控也存在著種屬間的免疫原性和安全性及器官特異性等問題。因此，為克服這些問題，已開始發(fā)展取代全長apoE、構(gòu)建結(jié)構(gòu)簡單的小分子apoE功能擬肽,將有可能發(fā)展祀向apoE的As及相關(guān)重大疾病的防治新策略。已公認(rèn)apoE含LDLR結(jié)合域的片段具有抗炎抗氧化作用；而脂質(zhì)結(jié)合區(qū)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇的外流，尤其是其含有至少2個兩性螺旋時。故Datta課題組巧妙設(shè)計并通過化學(xué)合成方式了得到一種小分子apoE衍生肽Ac-hE18A-NH2。其選擇apoE中保守性的LDLR結(jié)合域序列與apoAI來源的18個氨基酸殘基的兩性螺旋結(jié)合而成，該肽具有介導(dǎo)血漿VLDL/LDL的清除及促巨噬細(xì)胞膽固醇外流的作用，并顯示了抗炎和抗氧化的活性，同時該小分子擬肽具有類似于apoE的體內(nèi)再循環(huán)現(xiàn)象，故顯著延長了擬肽的體內(nèi)半衰期及其生物學(xué)效應(yīng)。盡管此肽還存在含異源性18個氨基酸殘基，可能會潛在地引起人體的免疫反應(yīng)，隨時間而削減它的治療效力，但此肽的合成和相關(guān)功能研究給我們帶來了光明小分子apoE擬肽具有發(fā)展成為動脈粥樣硬化及其所致心腦血管疾病等相關(guān)疾病的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種重組的人apoE模擬活性肽(擬肽)，其基本結(jié)構(gòu)為NH2-CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-COOH，其中包含了一段 apoE 的 LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位氨基酸肽段)和一段ap·oE的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位氨基酸肽段)，apoE擬肽具有明顯的結(jié)合HDL，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流及抗炎抗氧化活性。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種重組人apoE擬肽的制備方法，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，于細(xì)菌中表達(dá)的重組apoE擬肽經(jīng)過chitinbeads及heparin Sepharose CL-6B兩步親和層析得到純化的apoE擬肽。其優(yōu)點是產(chǎn)率高、成本低、純化流程簡單、可獲得無任何標(biāo)簽的高純蛋白，其制備過程中氨基酸序列出錯率明顯低于化學(xué)合成法，并且易于規(guī)?；磉_(dá)和純化，更易獲得高量純品肽。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種重組人apoE擬肽在作為制備治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。這種重組的人apoE擬肽(EpK)可增強(qiáng)HDL介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，并增加細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的能力。本發(fā)明制備的EpK在血循環(huán)中具有與HDL結(jié)合的特征，并顯著提高HDL介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流和抑制巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)，這種針對性改善HDL功能的機(jī)制在抗動脈粥樣硬化的治療上顯示了重要的應(yīng)用潛能，可以采用現(xiàn)有技術(shù)已知的合適方法，例如胃腸外施用，可以是部位特異性的或者進(jìn)入全身血流的方式(包括通過靜脈、肌肉或經(jīng)皮注射)，施用本發(fā)明的重組apoE擬肽，用以防治機(jī)體主要動脈的粥樣硬化病變，包括冠狀動脈，供應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的頸動脈，及外周循環(huán)或內(nèi)臟循環(huán)動脈的粥樣硬化病變，尤其涉及動脈粥樣硬化所致的冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等嚴(yán)重心腦血管疾病的防治。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明設(shè)計并得到一種重組的人apoE擬肽(命名為EpK)，其包含了一個氨基端(NH2-)的半胱氨酸(Cys，C)殘基、一段apoE的LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位的LRKLRKRLLI^i段)、六個賴氨酸(Lys，K)的連接子區(qū)和羧基端(-C00H)的apoE的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位的 QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE 肽段)，故其基本結(jié)構(gòu)為NH2_CLRKLRKRLLRKKKKKKQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE-C00H。本發(fā)明得到的EpK，來源于基因工程技術(shù)制備，利用原核表達(dá)體系表達(dá)并經(jīng)兩步親和層析可得到純化的多肽。由于多肽較短(含38個氨基酸殘基的肽段)，故制備中也可選擇利用化學(xué)合成法合成。一種重組人apoE擬肽的制備方法，其步驟是(I)重組載體的構(gòu)建及EpK肽的表達(dá)利用人apoE的結(jié)構(gòu)功能域,設(shè)計了一種含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位氨基酸肽段)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位氨基酸肽段)的衍生肽(EpK),此肽包含N端的一個半胱氨酸(Cys),通過六個賴氨酸(Lys, K)殘基連接apoE的LDLR結(jié)合區(qū)及脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。所述的人apoE的N端LDLR結(jié)合區(qū)為第141-150位的LRKLRKRLLR肽段；所述的人apoE的C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)為第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段。首先利用BLAST軟件(NCBI)設(shè)計寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成編碼EpK的DNA序列，DNA序列亞克隆插入到pTWINl載體(購于New England Biolabs)中與N端內(nèi)含肽融合。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21pLysS(購于 Stratagene)感受態(tài)細(xì)胞，利用LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)平板篩選(含100mg/L氨節(jié)青霉素)，證實EpK可于BL2IpLysS細(xì)菌中高效表達(dá)，然后于37°C液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌直到OD6tltl達(dá)到0. 8 I. 0，加入異丙基 _ β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β -D-l-thiogalactopyranoside, IPTG)至終濃度0. 5mM，再于25°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 10小時。
(2) EpK 肽的純化離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌沉淀，菌體沉淀用buffer BI (20mM Tris-HCl，pH8. 5，500mM NaCl,lmM EDTA)重懸并超聲裂解，然后進(jìn)行EpK的兩步純化首先，細(xì)胞提取物上樣到裝有Chitin beads的層析柱,用buffer BI洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。加入buffer B2 (20mMTris-HCl, pH7. 0,500mM NaCl,lmM EDTA)于室溫(20-25 °C，以下相同)下平衡過夜，使Chitin beads上的intein tag剪切,然后,用足量的buffer B2洗脫目的多肽。第二步,洗脫出的多肽用IOmM磷酸鹽結(jié)合緩沖液(PBS，含IOOmM NaCl，pH7. 4)按I : 10比例稀釋，并上樣至肝素親和柱(Heparin Sepharose CL-6B)中，然后用15倍柱床體積的PBS (含200mMNaCl,pH7. 4),洗去微量的未結(jié)合的intein tag、chitin結(jié)合區(qū)蛋白(CBD)以及其他的雜質(zhì)蛋白。目的多肽EpK最后通過增高NaCl的濃度而洗脫，即收集含500 600mM NaCl的梯度洗脫液，并在IOmM NH4HCO3進(jìn)行透析，最后凍干保存EpK粉末。采用pTWINl表達(dá)載體，其優(yōu)點是利用其內(nèi)可誘導(dǎo)的Intern蛋白剪切活性將靶蛋白肽鏈與親和標(biāo)簽(tag)分離開，無需外源蛋白酶，可通過親和層析獲得N端為Cys的重組蛋白。(3)純化后EpK肽的鑒定EpK的最終產(chǎn)率是IL LB培養(yǎng)菌獲得5 10mg，經(jīng)15%還原型SDS-PAGE證實兩步純化后為一條蛋白帶，提示為高純的多肽(圖1A)。一種分離的多肽，其序列為SEQ ID N01所示的氨基酸序列。如圖1B，質(zhì)譜證實了其正確的分子量(4686. 981對應(yīng)推算的4654. 69)、純度和部分二聚體的形成(分子量9397. 116對應(yīng)推算的9307. 364)。EpK的凍干粉溶于PBS至lmg/ml [在PBS中的最大溶解度可達(dá)10mg/ml ( 2mM)]。(4)重組人apoE擬肽(EpK)的結(jié)構(gòu)功能A、EpK包含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)(LRKLRKRLLR)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE)，此肽N端加有一個半胱氨酸(Cys)，并通過六個正電荷的Lys連接apoE的LDLR結(jié)合區(qū)及脂質(zhì)結(jié)合區(qū)。Lys可增加EpK溶解性,并通過Lys側(cè)鏈與磷脂?；捕说氖杷韵嗷プ饔?，以及帶正電的Lys氨基與帶負(fù)電的磷脂頭部基團(tuán)的親水性相互作用，增強(qiáng)EpK與磷脂結(jié)合的親和力。此特點通過EpK易于與富含磷脂的HDL結(jié)合實驗證實。B、本發(fā)明采用新型原核表達(dá)載體pTWINl(New England Biolabs)構(gòu)建含EpKDNA的重組表達(dá)載體，于BL21pLysS細(xì)菌中表達(dá)的重組肽經(jīng)過chitin beads及heparinSepharose CL-6B兩步親和層析得到了無任何標(biāo)簽的含38個氨基酸的高純EpK肽。此法優(yōu)點是產(chǎn)率高、成本低、純化流程簡單、制備過程中氨基酸序列出錯率明顯低于化學(xué)合成法，無需化學(xué)合成法的特殊精密設(shè)備，并且易于規(guī)?；磉_(dá)和純化，獲得高量純品肽。C、本發(fā)明通過親和層析獲得了 N端為Cys的重組EpK。N端Cys可促使分子間反應(yīng)，形成靶分子的二聚體，在保證多肽形成特定模體、結(jié)構(gòu)域而具有功能活性的基礎(chǔ)上，二聚體的結(jié)構(gòu)提供了 EpK雙倍的功能，即增強(qiáng)LDLR結(jié)合區(qū)和脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的能力。D、EpK具有apoE的α螺旋二級結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)結(jié)合活性,這與EpK涉及介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流作用密切相關(guān)。Ε、ΕρΚ優(yōu)先與HDL結(jié)合，可通過DMPC結(jié)合實驗證實，EpK較全長的apoE3與較大的DMPC囊泡結(jié)合動力學(xué)更慢。此特征也賦予EpK —些優(yōu)勢①因為不結(jié)合VLDL和LDL，EpK不會很快通過LDLR從血漿中清除，故EpK在循環(huán)中的半衰期延長級EpK主要與HDL結(jié)合 從而明顯增強(qiáng)HDL的功能。F、EpK在體內(nèi)外實驗中顯示了與脂蛋白結(jié)合的部位。利用人全長的apoE3作比較，無論EpK與體外的血清孵育，還是EpK注射入血液后，均顯示EpK沒有與VLDL或很少和LDL相結(jié)合，而主要存在于HDL組分中，從而也說明了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血漿膽固醇水平和改變脂蛋白分布的現(xiàn)象?！N重組人apoE擬肽在作為制備治療或預(yù)防在動脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用，其應(yīng)用的機(jī)制與過程是apoE在脂蛋白代謝和抗動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其機(jī)制涉及促進(jìn)循環(huán)中膽固醇的清除和血管壁巨噬細(xì)胞膽固醇的外流，抗氧化、抗炎等作用。其可存在于VLDL和乳糜微粒中，也作為HDL中主要載脂蛋白實現(xiàn)HDL的抗動脈粥樣硬化功能，降低或減輕了動脈粥樣斑塊的形成，對防治動脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病有巨大的應(yīng)用前景。(I)本發(fā)明的EpK在體外細(xì)胞實驗中表明，EpK介導(dǎo)荷載膽固醇的巨噬細(xì)胞的膽固醇外流。此與apoE及其他apoE擬肽的報道結(jié)果一致。EpK肽C端的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)可能涉及介導(dǎo)膽固醇外流作用有關(guān)。本發(fā)明的EpK易于與HDL結(jié)合，在體外實驗中顯示了與缺乏apoE的HDL結(jié)合后，可增強(qiáng)HDL作為膽固醇接受體的功能，促巨噬細(xì)胞膽固醇外流。(2)炎癥是重要的介導(dǎo)動脈粥樣硬化過程中的一個方面。本發(fā)明的EpK在體外細(xì)胞實驗中有效地抑制LPS刺激的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。和來源于apoE+小鼠的HDL結(jié)合后，也顯示抑制LPS誘發(fā)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，相比而言，含EpK的HDL較apoE缺乏的HDL具有更加有效的抗炎功能。EpK多肽N端的LDLR結(jié)合區(qū)可能與其抗炎功能有關(guān)。本文中采用來源于apoE+小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞或THP-I源性巨噬細(xì)胞，分別經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生炎癥因子作為炎癥典型的細(xì)胞模型，此上的結(jié)果說明本發(fā)明的EpK可單獨使用或與其它已知的抗炎因子組合用于治療一些急慢性炎性相關(guān)的疾病中，包括動脈粥樣硬化，急、慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默氏癥等。(3)抗氧化作用是apoE抗動脈粥樣硬化的功能之一。已經(jīng)證明H0X-1可通過抗氧化應(yīng)激和抗炎而具有防治動脈粥樣硬化的作用。一些致動脈粥樣硬化的刺激因素如高血壓、氧化脂質(zhì)和LPS都可以誘導(dǎo)HOX-I的表達(dá)。我們的實驗證明，無論是基礎(chǔ)水平還是oxLDL刺激下，EpK均可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中H0X-1的表達(dá)。因此，誘導(dǎo)H0X-1的表達(dá)是EpK抗動脈粥樣硬化的又一有益的特性。(4)本發(fā)明中EpK的體內(nèi)實驗均通過靜脈、肌肉或經(jīng)皮注射進(jìn)入全身血流的方式施用。說明可采用現(xiàn)有的胃腸外施用的合適技術(shù)方法部位特異性的或者直接進(jìn)入全身血液循環(huán)，施用本發(fā)明的重組apoE擬肽，用以增強(qiáng)血液中HDL的抗動脈粥樣硬化功能，防治機(jī)體主要動脈的粥樣硬化病變，包括冠狀動脈，供應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的頸動脈，及外周循環(huán)或內(nèi)臟循環(huán)動脈的粥樣硬化病變，尤其涉及一種重組人apoE擬肽在作為制備治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致的冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等嚴(yán)重心腦血管疾病藥物中的用途。本發(fā)明與現(xiàn)有apoE擬肽相比，具有以下優(yōu)點和效果(I)本發(fā)明中設(shè)計的EpK的重要特征之一，是同時包含了人apoE的一個LDLR結(jié)合區(qū)和一個脂質(zhì)結(jié)合區(qū)，具有α螺旋結(jié)構(gòu)，其中LDLR結(jié)合區(qū)提供了其抗炎作用，而脂質(zhì)結(jié)合 區(qū)是其與脂蛋白結(jié)合的基礎(chǔ)；(2)本發(fā)明中設(shè)計的EpK的重要特征之一，其N端的Cys殘基介導(dǎo)了二聚體的形成，EpK 二聚體通過脂質(zhì)結(jié)合區(qū)作用可有效地結(jié)合于脂蛋白表面，雙倍的LDLR結(jié)合區(qū)和脂質(zhì)結(jié)合區(qū)可增強(qiáng)EpK的功能。(3)本發(fā)明中的EpK結(jié)構(gòu)中在LDLR結(jié)合區(qū)與脂質(zhì)結(jié)合區(qū)間有6個帶正電荷的Lys，可增加EpK的溶解度,并增強(qiáng)EpK與磷脂結(jié)合的親和力。6個Lys連接體還可能在EpK被細(xì)胞攝取時保護(hù)其免遭內(nèi)涵體-溶酶體的降解，這就使得EpK有機(jī)會重新循環(huán)至血漿。(4)本發(fā)明中的EpK來源于重組載體在細(xì)菌表達(dá)體系中的表達(dá)與純化的制備。與其他研究中的化學(xué)合成的apoE擬肽相比，其純化流程簡單、可獲得無任何標(biāo)簽的高純蛋白，產(chǎn)率約為5 10mg/L LB培養(yǎng)基，且序列出錯率、所需費用也明顯低于化學(xué)合成法，并且更易規(guī)?；磉_(dá)和純化，獲得大量純品肽。(5)本發(fā)明中的EpK易于結(jié)合HDL，與EpK結(jié)合的HDL增強(qiáng)了介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制LPS刺激引起的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可改善HDL的功能；(6)本發(fā)明中的EpK還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化的活性。(7)本發(fā)明中的EpK選擇了人apoE的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)作為EpK肽的C端，這樣更好地消除了對人體潛在的免疫反應(yīng)。


圖I顯示了重組的人apoE擬肽(EpK)的兩步純化結(jié)果及純化EpK的質(zhì)譜特征。A. SDS-PAGE鑒定，分別顯示第一步及第二步純化的EpK產(chǎn)品；B.純化EpK的質(zhì)譜圖證實了其正確的分子量。圖2顯示了 EpK肽的二級結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)結(jié)合活性.A.溶液中EpK肽的遠(yuǎn)紫外圓二色譜圖說明EpK易傾向于形成α螺旋結(jié)構(gòu)；B. 24°C下EpK與DMPC囊泡孵育，A49tl的時間曲線顯示EpK與脂質(zhì)的結(jié)合及隨時間對囊泡的顯著清除效率，但較對照的完整apoE3的清除率低，其中清除1/2的時間，EpK為10分鐘，apoE3僅為3分鐘。圖3顯示了 EpK肽未介導(dǎo)血漿膽固醇的清除，但主要與血漿HDL結(jié)合。A. 100 μ g溶于PBS的EpK或全長人apoE3眼眶后靜脈注射入apoE+小鼠體內(nèi)，在所示時間點采取血樣檢測血漿膽固醇水平，顯示對照的apoE3注射后可立即顯著降低小鼠血漿膽固醇水平并持續(xù)至少4小時，而EpK并沒有改變小鼠血漿膽固醇水平；B.收集apoE+小鼠注射EpK后的血漿，及未注射EpK的小鼠血漿體外與EpK孵育，分別進(jìn)行快速蛋白液相色譜(FPLC)，顯示脂蛋白膽固醇分布無明顯差異；C. Western blot檢測EpK在不同F(xiàn)PLC組分中的分布,表明EpK主要與HDL聯(lián)系，而沒有與VLDL或很少和LDL相結(jié)合，解釋了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血衆(zhòng)膽固醇水平的現(xiàn)象。D.顯示人apoE3注射入小鼠后的血衆(zhòng)FPLC組分Western blot作為對照，可見apoE3能與各種脂蛋白結(jié)合。圖4顯示了 EpK肽增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。A.原代培養(yǎng)的apoE+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞通過3天的acLDL孵育進(jìn)行膽固醇荷載，然后分別用含人apoAI,人全長apoE3或EpK的DMEM孵育，與相同量的人apoAI和apoE3比較，20 μ g/ml EpK顯示了更高的介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的能力，*P < O. 01，η = 3 ；B-D.來源于apoE+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS (100ng/ml)和所示濃度的EpK處理6h，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實時定量PCR檢測，顯示5 μ g/ml和10 μ g/ml的EpK均顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF α (圖4Β)、IL6 (圖4C)和MCPl (圖4D)三種致炎因子的表達(dá)。與LPS組比較，*Ρ< 0. 05，#Ρ < 0. 01，η = 3ο圖5顯示了含EpK的HDL增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流并抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。A. apoE+小鼠注射EpK后的血漿HDL作為膽固醇接受體，利用THP-I衍生的巨噬細(xì)胞進(jìn)行膽固醇外流實驗，可見作用4h時，含EpK的HDL介導(dǎo)膽固醇外流作用明顯高于不含EpK的HDL (*P < 0. 01) ；B-D.來源于THP-I的巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS(50ng/ml)刺激和含或不含EpK的HDL (100 μ g膽固醇/ml)處理6h，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行實時定量PCR檢測，顯示含EpK的HDL能更有效抑制LPS誘導(dǎo)的THP-I源性巨噬細(xì)胞IL6 (圖5B)、IL-I β (圖5C)和CCL2 (圖5D)三種細(xì)胞因子的表達(dá)，表明EpK與HDL的結(jié)合使apoE+小鼠的HDL更具抗炎活性。(與LPS組比較，*P < 0. 05，*#P < O. 01，η = 3)圖6顯示了 EpK增強(qiáng)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中血紅素加氧酶-I (hemeoxygenase-1, H0X-1)的表達(dá)。無論有無oxLDL的刺激,5 μ g/ml和10 μ g/ml的EpK都能顯著提高H0X-1的表達(dá)(*P < 0.01)，說明EpK可進(jìn)一步增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化和抗炎作用的 H0X-1活性而有益于防治動脈粥樣硬化。
具體實施例方式以下實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)被視為是對本發(fā)明的限制。實施例I :設(shè)計重組載體及EpK肽的純化鑒定本發(fā)明設(shè)計了一種含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的衍生肽(EpK)，此肽包含N端的一個半胱氨酸(Cys)，一個apoE LDLR結(jié)合區(qū)(第141-150位的LRKLRKRLLR肽段)，其后通過6個Lys殘基連接一個apoE脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE 肽段)。EpK的38個氨基酸序列如下nh2-clrklrkrllrkkkkkkqvaevrakleeqaqqirlqae-cooh本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組載體，于細(xì)菌中表達(dá)的重組肽經(jīng)過chitinbeads及heparin Sepharose CL-6B兩步親和層析得到一種純化的重組人apoE擬肽(EpK),其具體步驟是(I)重組載體的構(gòu)建及EpK肽的表達(dá)首先利用BLAST軟件(NCBI)設(shè)計寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成編碼EpK的DNA序列，DNA序列亞克隆插入到pTWINl載體(購于New England Biolabs)中與N端內(nèi)含肽融合。編碼EpK的DNA序列如SEQ ID NO 2所示，具體的為5’ TGCCGCCGCAAATTACGCAAGCGTCTGCTGCGCAAGAAGAAGAAAAAGAA GCAGGTGGCCGAGGTCCGTGCCAAGTTAGAAGAACAGGCACAGCAGATCCGCCT GCAAGCGGAG 3’重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21pLysS(購于 Stratagene)感受態(tài)細(xì)胞，利用LB培養(yǎng)平板篩選(含100mg/L氨芐青霉素)，過夜生長出單菌落，挑取單菌 落液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng),Western blotting證實EpK成功于BL21pLysS細(xì)菌中高效表達(dá),然后在37°C液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌直到OD6tltl達(dá)到0. 8 I. 0，加入終濃度0. 5mM的IPTG，再于25°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 10小時。(2) EpK 肽的純化離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌沉淀，菌體沉淀用buffer BI (20mM Tris-HCl，pH8. 5，500mM NaCl,lmM EDTA)重懸并超聲裂解，然后進(jìn)行EpK的兩步純化首先，細(xì)胞提取物上樣到裝有Chitin beads的層析柱,用buffer BI洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。加入buffer B2 (20mMTris-HCl, pH7. 0,500mM NaCl,lmM EDTA)于室溫(20-25 °C，以下相同)下平衡過夜，使Chitin beads上的intein tag剪切,然后,用足量的buffer B2洗脫目的多肽。第二步,洗脫出的多肽用IOmM磷酸鹽結(jié)合緩沖液(PBS，含IOOmM NaCl，pH7. 4)按I : 10比例稀釋，并上樣至肝素親和柱(Heparin Sepharose CL-6B)中，然后用15倍柱床體積的PBS (含200mMNaCl,pH7. 4),洗去微量的未結(jié)合的intein tag、chitin結(jié)合區(qū)蛋白(CBD)以及其他的雜質(zhì)蛋白。目的多肽EpK最后通過增高NaCl的濃度而洗脫，即收集含500 600mM NaCl的梯度洗脫液，并在IOmM NH4HCO3進(jìn)行透析，最后凍干保存EpK粉末。(3)純化后EpK肽的鑒定EpK的最終產(chǎn)率是IL LB培養(yǎng)菌獲得5 10mg，經(jīng)15%還原型SDS-PAGE證實兩步純化后為一條蛋白帶，提示為高純的多肽(圖1A)。一種分離的多肽，其序列為SEQ ID N01所示的氨基酸序列。如圖1B，質(zhì)譜證實了其正確的分子量(4686. 981對應(yīng)推算的4654. 69)、純度和部分二聚體的形成(分子量9397. 116對應(yīng)推算的9307. 364)。EpK的凍干粉溶于PBS至lmg/ml [在PBS中的最大溶解度可達(dá)10mg/ml ( 2mM)]。(4)表達(dá)和純化人apoE3本發(fā)明的apoE擬肽(EpK)的生物活性鑒定利用了全長的人apoE3作為對照。采用慢病毒載體PWPI-apoE3轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，高表達(dá)人的apoE3和GFP。以GFP標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分類以獲得穩(wěn)定表達(dá)apoE3的HEK293T細(xì)胞系，收集培養(yǎng)液直接用HeparinSepharose CL-6B柱純化apoE3，目的蛋白用含350 500mM NaCl的梯度洗脫液洗脫，并置于IOmMNH4HCO3中透析，經(jīng)15% SDS-PAGE證實為高純的apoE3，凍干保存。實驗時用PBS溶解至蛋白濃度為lmg/ml。實施例2 :純化的EpK肽二級結(jié)構(gòu)及結(jié)合脂質(zhì)活性的特征檢測ApoE具有很高的α螺旋結(jié)構(gòu)，根據(jù)設(shè)計的EpK肽序列包含人apoE的一部分LDLR結(jié)合區(qū)和一個脂質(zhì)結(jié)合區(qū)，基于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件(Network Protein SequenceAnalysis)預(yù)測，EpK可能含有89. 74%的α螺旋結(jié)構(gòu)，為證實EpK形成α螺旋的能力，我們采用圓二色法分析了 EpK的二級結(jié)構(gòu)，并用DMPC結(jié)合實驗將EpK和人全長的apoE3進(jìn)行對比，觀察它們同脂質(zhì)結(jié)合的能力。(I) EpK肽的二級結(jié)構(gòu)特征鑒定圓二色法(Circular dichroism,⑶)測量EpK肽的二級結(jié)構(gòu)，即于37°C,采用O. 2cm液層厚度的比色皿測量樣品遠(yuǎn)紫外區(qū)(190-260nm)的光譜圖，掃描過程中電腦溫控變化在0.2 °C以內(nèi)。EpK樣品濃度為O. 25mg/ml，溶于IOmM磷酸鉀溶液中(pH7. O)，或溶于25%或50%的三氟乙醇(2，2，2-trif Iuoroethanol，TFE)中。二級結(jié)構(gòu)檢測如圖2A，在IOmM磷酸鉀緩沖液中EpK的α螺旋含量很低，只有16. 9%;然而在25%或50% TFE ( 一種α螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑)中，α螺旋的含量分別提高至63. 1%和81.5%，這說明EpK具有易于形成 α螺旋的結(jié)構(gòu)。EpK在TFE溶液中易于形成兩性α螺旋結(jié)構(gòu)的趨勢是其脂質(zhì)結(jié)合活性的構(gòu)象基礎(chǔ)。⑵EpK肽的脂質(zhì)結(jié)合活性為驗證EpK的脂質(zhì)結(jié)合能力，我們用完整的人apoE3作為對照，進(jìn)行了 DMPC結(jié)合實驗，將 IOmg 二豆蘧酰磷脂酰膽堿(DMPC, Avanti Polar Lipids Inc. , Alabaster, AL)溶于氯仿/甲醇(3 lv/v)混合液中并用氮氣干燥。預(yù)熱的Iml緩沖液(20mM Tris-HCl,pH7. 2,250mM NaCl, and ImM EDTA)加入使脂質(zhì)終濃度為10mg/mL，30秒渦旋混勻數(shù)次，監(jiān)測蛋白質(zhì)誘導(dǎo)DMPC囊泡轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)/DMPC盤狀復(fù)合物的時間。將100 μ g DMPC囊泡和100 μ g EpK或者apoE3的溶液置于24°C恒溫比色杯中，混合溶液5_10秒，通過分光光度計(SpectraMax M5)監(jiān)測490nm處吸光度值(A49tl)，反映DMPC囊泡溶液的清除率。(注所有的試劑實驗前都于24°C預(yù)溫)。如圖2B，EpK濃度為0. 25mg/ml時，可以明顯觀察到DMPC囊泡溶液從混濁變成清亮，這個結(jié)果同人全長的apoE孵育Ih的結(jié)果一樣。但EpK的清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于apoE3 :清除1/2的時間，EpK為10分鐘，apoE3僅為3分鐘。即相對于apoE3而言，EpK結(jié)合DMPC囊泡的動力學(xué)較慢?？傊珼MPC結(jié)合實驗支持EpK能和DMPC囊泡結(jié)合并將其轉(zhuǎn)化成更小的顆粒，此也進(jìn)一步證實了它的脂質(zhì)結(jié)合能力。(3) EpK肽與血漿脂蛋白的結(jié)合利用apoE+小鼠進(jìn)行體內(nèi)外實驗，檢測EpK是否與血漿脂蛋白結(jié)合及結(jié)合的部位。本實驗采用的apoE+小鼠(來源于Jackson Laboratory)模型,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院的動物實驗中心(SPF級)。動物飼養(yǎng)過程和實驗方法均獲得湖北省動物飼養(yǎng)和使用委員會的批準(zhǔn)。apoE+小鼠分兩組，一組收集小鼠血漿，將90 μ I血漿與10 μ I EpK (終濃度為0. lmg/ml)共孵育30min后進(jìn)行快速蛋白液相色譜(FPLC)分離不同脂蛋白組分。另一組小鼠預(yù)先注射100 μ g EpK入血液，30min后收集血漿進(jìn)行FPLC分離，即分別取100 μ I的小鼠血楽·上樣于AKTApurifier (GE Healthcare)系統(tǒng)的Superose610/200GL凝膠層析柱,流動相(0. 15mol/L NaCl、0. 01mol/L Na2HPO4 和 0. lmol/LEDTA, pH 7. 5)，流速 0. 5ml/min。樣品連續(xù)收集40管，每管0.5ml。小鼠血漿膽固醇水平采用膽固醇檢測試劑盒(Raichem)進(jìn)行酶法比色測定。如圖3B，EpK進(jìn)入體內(nèi)血循環(huán)，短時間對血漿脂蛋白的分布及血漿膽固醇水平不產(chǎn)生影響。
隨后利用羊抗人apoE抗體(50A_Glb, Academy Biomedical)可識別EpK,米用Western blot檢測EpK是否與脂蛋白組分結(jié)合，即EpK在不同F(xiàn)PLC組分中的分布。將FPLC分離得到的樣品管各取30μ I進(jìn)行15% SDS-PAGE，然后凝膠中蛋白被轉(zhuǎn)印到NC膜(Amersham Biosciences),米用羊抗人 apoE 抗體(50A_Glb, Academy Biomedical)和 HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG孵育,ECL試劑盒(Amersham Bioscieces)顯色,檢測FPLC的不同分離組分中EpK的分布，同時采用人全長apoE3注射入小鼠血液，30min后收集血漿進(jìn)行FPLC分離及Western blot檢測，用于對照。圖3C顯示了體外孵育實驗中，EpK存在于FPLC第28-40管的洗脫組分(HDL和不含脂質(zhì)的部分)，而體內(nèi)注射實驗中EpK主要存在于FPLC第28-37管的洗脫組分(HDL部分)，僅檢測到極少量EpK存在于FPLC第24-27管(LDL)和第38-40管(不含脂質(zhì))的部分中，而apoE3的體內(nèi)外對照實驗顯示(圖3D)，apoE3可結(jié)合VLDL、LDL和HDL的任何部分，尤其以結(jié)合VLDL和LDL為主。這表明EpK與apoE3不同，主要與血漿中HDL結(jié)合，而與VLDL或/和LDL很少結(jié)合，此實驗可解釋了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血漿膽固醇水平的現(xiàn)象。盡管EpK帶有LDLR結(jié)合區(qū)及較強(qiáng)的肝素結(jié)合活性，但為什么EpK未與VLDL和LDL 結(jié)合目前還不清楚，我們推測是EpK優(yōu)先與較小的脂蛋白如HDL結(jié)合，可能是因為HDL有更多彎曲的富含磷脂的表面，正如DMPC結(jié)合實驗顯示，相對于全長的apoE3，EpK應(yīng)用更慢的動力學(xué)與較大的DMPC囊泡結(jié)合，故可能EpK首先與HDL結(jié)合。檢測到EpK優(yōu)先與HDL結(jié)合，這也賦予EpK —些優(yōu)勢①因為不結(jié)合VLDL和LDL，EpK不會很快通過LDLR從血漿中清除，故EpK在循環(huán)中的半衰期延長EpK主要與HDL結(jié)合從而有利于明顯增強(qiáng)HDL的功能，此將在下面的實施例中證實。實施例3 =EpK增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇外流和抑制巨噬細(xì)胞炎癥利用小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞對純化的EpK進(jìn)行功能評價。檢測EpK是否介導(dǎo)荷載膽固醇的巨噬細(xì)胞中膽固醇的外流。其次，檢測EpK是否抑制原代apoE+小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)。apoE+小鼠(來源于Jackson Laboratory)模型,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院的動物實驗中心(SPF級)。(I)細(xì)胞培養(yǎng)為得到小鼠的巨噬細(xì)胞，采用3ml 3% thioglycollate小鼠腹腔內(nèi)注射，3天后小鼠行安樂死，用IOml PBS灌流收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。細(xì)胞接種于6孔或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，含 10 % 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的 Dulbecco’ s Modified EagleMedium(DMEM)(均購于GIBC0)培養(yǎng)lh，然后用無FBS的DMEM洗滌2次以洗去未貼壁的細(xì)胞，貼壁的巨噬細(xì)胞以適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)巨噬細(xì)胞膽固醇外流培養(yǎng)于24孔板的小鼠巨噬細(xì)胞，加入100 μ g/ml3H-膽固醇的乙?；疞DL(acLDL)孵育3天進(jìn)行膽固醇荷載，其后更換含一定量EpK的DMEM培養(yǎng)24小時。實驗時加入100 μ g/ml 3H-膽固醇(購于PerkinElmer)的乙酸化LDL(acLDL,購于Biomedical Technologies)。培養(yǎng)48小時，然后分別加入含人apoAI，人全長apoE3 (hapoE3)或EpK的DMEM孵育，作為引發(fā)膽固醇外流的培養(yǎng)基，并分別于I小時和4小時取出培養(yǎng)液。在4小時的時間點,完全去除培養(yǎng)液并用PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞用異丙醇溶解收集，利用Beckman LS6500液閃儀進(jìn)行培養(yǎng)基和細(xì)胞3H放射性計數(shù)。以3H外流的百分率計算膽固醇外流率。
與只有DMEM(不含外源性的膽固醇接受體)孵育相比，加10 μ g/ml EpK可增加細(xì)胞的膽固醇外流為I. 3% 6. 1%，加入20 μ g/ml EpK則進(jìn)一步增加膽固醇外流至13. 4%,而蛋白濃度為20 μ g/ml時，apoAI介導(dǎo)10%的膽固醇外流，apoE3介導(dǎo)膽固醇外流率為
9.7%，與相同量的人apoAI和apoE3比較，EpK顯示了更高的介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流的能力(P < O. 01)(圖 4A)。(3)巨噬細(xì)胞炎癥因子的檢測采用實時定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)技術(shù)我們檢測巨卩遼細(xì)胞受LPS刺激后EpK對細(xì)胞炎癥因子TNFa、IL_6、MCP-ImRNA表達(dá)水平的影響。從小鼠腹腔新取出的巨噬細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中貼壁I小時，用DMEM洗滌兩次后在無血清的DMEM中培養(yǎng)過夜，然后用含50ng/ml LPS的DMEM更換培養(yǎng)基，同時給予適量EpK(μ g/ml級別)進(jìn)行處理。培養(yǎng)6小時后棄去培養(yǎng)基并用DMEM 洗滌細(xì)胞兩次，采用的Trizol試劑(Invitrogen)和RNeasy試劑盒(Qiagen)提取細(xì)胞總RNA,使用iScript cDNA Synthesis試劑盒(Bio-Rad)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,于Eppendorf Realplex2Mastercycler (Eppendprf)進(jìn)行qPCR檢測目標(biāo)基因mRNA的水平。以小鼠18s rRNA為內(nèi)參基因。qPCR的引物序列如下小鼠18s rRNA 正向引物5’ CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 3’ ；反向引物5，AGTCGGCATCGTTTATGGTC3，；小鼠TNFa 正向引物5’ CGTCAGCCGATTTGCTATCT 3，；反向引物5’CGGACTCCGCAAAGTCTAAG 3’ ；小鼠IL-6 正向引物5’ AGTTGCCTTCTTGGGACTGA3’反向引物5’TCCACGATTTCCCAGAGAAC 3’小鼠MCP-I 正向引物5’ AGGTCCCTGTCATG CTTCTG 3’反向引物5’TCTGGACCCATTCCTTCTTG 3’采用GraphPad PRISM軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,組間平均值差異使用one-way ANOVA和student t_tests顯示。P < O. 05認(rèn)為有顯著性差異。如圖4B-4D，與僅含DMEM培養(yǎng)基的空白組，LPS顯著增加巨噬細(xì)胞中TNF a、IL6和MCPl三種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平，與LPS組比較，加入5 μ g/ml和10 μ g/ml的EpK均顯著降低LPS所致TNF α、IL6和MCPl三種因子的表達(dá)(*Ρ < O. 05，**Ρ < O. 01)。實施例4 :體內(nèi)外實驗檢測含EpK的HDL的功能通過純化的EpK 二級結(jié)構(gòu)及其脂質(zhì)結(jié)合活性的研究實施例中，證實EpK與apoE3不同，主要與血漿中HDL結(jié)合，而與VLDL或/和LDL很少結(jié)合。為進(jìn)一步研究EpK和HDL的結(jié)合對機(jī)體脂蛋白代謝的影響，能否增強(qiáng)HDL抗動脈粥樣硬化的相關(guān)功能。HDL抗動脈粥樣硬化的眾多作用中，介導(dǎo)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運和抗炎兩個功能尤為重要，而且可能存在本質(zhì)上相互聯(lián)系。我們利用體內(nèi)外實驗，從EpK與apoE+小鼠HDL結(jié)合的角度觀察對機(jī)體血漿膽固醇的清除及對巨噬細(xì)胞膽固醇外流和巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。(I)進(jìn)入體內(nèi)的EpK結(jié)合HDL，但不介導(dǎo)血漿膽固醇的清除根據(jù)實施例2中體內(nèi)外實驗證實EpK與血漿脂蛋白的結(jié)合分布，EpK主要存在于FPLC洗脫的HDL組分，僅極少量EpK存在于FPLC洗脫的LDL和無脂部分。進(jìn)一步利用100 μ g溶于PBS的EpK或全長人apoE3眼眶后靜脈注射入4月齡的apoE+小鼠體內(nèi)，并于注射后lmin、10min、30min、lh、2h、4h和24h米取30 μ I血樣檢測血衆(zhòng)膽固醇水平。結(jié)果顯示，對照的apoE3注射后可立即顯著降低血漿膽固醇水平，并持續(xù)至少4小時，而EpK并沒有改變apoE+小鼠血漿膽固醇水平(圖3A)。結(jié)合實施例2中的體內(nèi)外實驗，無論EpK進(jìn)入小鼠體內(nèi)30min后收集血清進(jìn)行FPLC檢測，還是EpK與血漿孵育后30min后進(jìn)行FPLC檢測，結(jié)果EpK注射組的脂蛋白分布無顯著變化(圖3B)。Western blot檢測比較apoE3和EpK在FPLC不同組分中的分布，圖3C-3D顯示了人apoE3注射入小鼠后的血漿，可見apoE3能與各種脂蛋白結(jié)合。而EpK盡管帶有LDLR結(jié)合區(qū)及較強(qiáng)的肝素結(jié)合活性，但注射EpK入apoE+小鼠主要與HDL聯(lián)系，與VLDL或很少和LDL相結(jié)合，故不介導(dǎo)血漿膽固醇的清除，這也合理解釋了 EpK注射入體內(nèi)并不降低血漿膽固醇水平及改變脂蛋白分布的現(xiàn)象。(2)含EpK的HDL增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的膽固醇外流本實驗我們收集實施例2中注射過EpK的apoE+小鼠的血漿FPLC第30_37 管HDL組分，同樣以注射過PBS的apoE+小鼠血漿FPLC相同組分作為對照，通過centricom (Mi 11 ipore)濃縮樣品HDL組分，并經(jīng)O. 45 μ m濾器過濾除菌。利用30ng/ml的PMA誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系THP-I細(xì)胞3天使其分化成巨噬細(xì)胞，以HDL作為膽固醇接受體進(jìn)行膽固醇外流實驗，將100yg/ml 3H標(biāo)記的acLDL孵育細(xì)胞48h荷載膽固醇后，洗滌、更換含有100 μ g膽固醇/ml HDL (膽固醇受體)的RPMI培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。分別于Ih和4h時間點收集培養(yǎng)基進(jìn)行3H放射性計數(shù)，在4h點培養(yǎng)基被完全除去，PBS洗滌細(xì)胞2次后，異丙醇溶解細(xì)胞，檢測細(xì)胞的3H放射性計數(shù)。膽固醇外流率以計算外流3H的百分比表示。結(jié)果如圖5A顯示，在Ih時間點，與單純RPMI1640培養(yǎng)基相比，無論是否含有EpK的HDL都顯著增強(qiáng)了細(xì)胞膽固醇的外流(5. 78%,4. 86% vs 0· 93%；Ρ< 0· 01)，但有無EpK結(jié)合的HDL在介導(dǎo)膽固醇外流的能力上并無明顯不同(5. 78% vs 4. 86% ) 而在4h時間點，含EpK的HDL介導(dǎo)膽固醇外流的作用明顯高于不含EpK的HDL(10. 58% vs 7. 42%, P
<0. 01)。(3)含EpK的HDL抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)我們繼續(xù)利用THP-I源性巨噬細(xì)胞，檢測是否含EpK的HDL能更有效抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。實驗首先用30ng/mlPMA誘導(dǎo)THP-I細(xì)胞3天分化成巨噬細(xì)胞，以LPS(50ng/ml)刺激THP-1源性巨噬細(xì)胞，同時加入含有EpK的HDL(100 μ g膽固醇/ml)共孵育，實驗設(shè)立不含EpK的HDL為對照組。LPS和HDL共孵育6h后，采用的Trizol試劑和RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時定量PCR(qPCR)檢測THP-1源巨噬細(xì)胞中IL6、IL-I β和CCL2三種細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。以人的基因GAPDH為內(nèi)參基因。qPCR的引物序列如下人GAPDH 正向引物5 ’ GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3 ’反向引物5’TTGATTTT GGAGGGATCTCG 3’人IL-6 正向引物5 ’ TACCCCCAGGAGAAGATTCC 3 ’反向引物5’TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT 3’人IL-1 β 正向引物5 ’ GGGCCTCAAGGAAAAGAATC 3 ’反向引物5’ TTCTGCTTGAGAGGTGCTGA3 ’
人CCL2 正向引物5 ’ CCCCAGTCACCTGCTGTTAT 3 ’反向引物5’TGGAATCCTGAACCCACTTC 3’結(jié)果如圖5B-5D，顯示LPS均明顯刺激巨噬細(xì)胞中IL6、IL_10和CCL2三種細(xì)胞因子的表達(dá)，來源于apoE+小鼠的HDL無論是否含有EpK都顯著抑制了 IL6、IL-I β和CCL2這三種細(xì)胞因子的表達(dá)，但含EpK的HDL更加有效(P < O. 01)，表明來源于apoE+小鼠體內(nèi)的與EpK結(jié)合的HDL抗炎活性更高。實施例5 =EpK增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中血紅素加氧酶-I的表達(dá)巨曬細(xì)胞血紅素加氧酶-I (heme oxygenase-1,H0X-1)具有抗氧化和抗炎的作用。我們檢測EpK是否可以刺激小鼠原代巨噬細(xì)胞H0X-1表達(dá)。apoE+小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)見實施例3中的方法，收集的巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 過夜，更換含50 μ g/ml氧化型LDL (oxidized LDL, oxLDL)和/或適量的EpK的新鮮DMEM培養(yǎng)6h后，采用的Trizol試劑和RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行實時定量PCR檢測H0X-1的mRNA表達(dá)水平。仍以小鼠18s rRNA為內(nèi)參基因。qPCR的引物序列如下小鼠18s rRNA 正向引物5’ CGCGGTTCTATTTTGTTGGT 3’反向引物5’ AGTCGGCATCGTTTATGGTC 3 ’小鼠H0X-1 正向引物5 ’ CACGCATATACCCGCTACCT 3，反向引物5，CCAGAGTGTTCATTCGAGCA3’結(jié)果如圖6顯示oxLDL可明顯增加H0X-1的mRNA表達(dá)(P < 0. 01)，而無論有無oxLDL的刺激，加入5和10 μ g/ml的EpK都能顯著提高HOX-1的表達(dá)(P < O. 01)，說明EpK可進(jìn)一步增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化和抗炎作用的H0X-1活性而有益于防治動脈粥樣硬化。
權(quán)利要求
1.一種分離的重組人apoE擬肽(EpK)，其序列為SEQ ID NO :I所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的一種重組人apoE擬肽(EpK)的制備方法，其步驟是 (1)重組載體的構(gòu)建及EpK肽的表達(dá) 利用人apoE的結(jié)構(gòu)功能域,設(shè)計了一種含人apoE的一段N端LDLR結(jié)合區(qū)和一段C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的衍生肽，此肽包含N端的一個半胱氨酸，通過六個賴氨酸殘基連接apoE的LDLR結(jié)合區(qū)及脂質(zhì)結(jié)合區(qū)； 所述的人apoE的N端LDLR結(jié)合區(qū)為第141-150位的LRKLRKRLLR肽段；所述的人apoE的C端脂質(zhì)結(jié)合區(qū)為第234-254位的QVAEVRAKLEEQAQQIRLQAE肽段； 首先利用BLAST軟件設(shè)計寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)合成編碼EpK的DNA序列，編碼EpK的DNA序列如下5’ TGCCGCCGCAAATTACGCAAGCGTCTGCTGCGCAAGAAGAAGAAAAAGAAGCAGGTGGCCGAGGTCCGTGCCAAGTTAGAAGAACAGGCACAGCAGATCCGCCTGCAAGCGGAG 3， DNA序列亞克隆插入到pTWINl載體中與N端內(nèi)含肽融合； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21pLysS感受態(tài)細(xì)胞，利用LB培養(yǎng)平板篩選，證實EpK于BL2IpLysS細(xì)菌中高效表達(dá)，然后于37°C液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌直到OD6tltl達(dá)到O. 8 I. 0，加入IPTG至終濃度O. 5 mM，再于25°C誘導(dǎo)蛋白表達(dá)8 10小時； (2)EpK肽的純化 離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌沉淀，用buffer BI重懸并超聲裂解，然后進(jìn)行兩步純化首先，細(xì)胞提取物上樣到裝有Chitin beads的層析柱,用buffer BI洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì),加入buffer B2于室溫下平衡過夜,使Chitin beads上的intein tag剪切，再用足量的buffer B2洗脫目的多肽；第二步，洗脫出的多肽用10 mM磷酸鹽結(jié)合緩沖液(PBS)按I 10比例稀釋，并上樣至肝素親和柱中，然后用15倍柱床體積的PBS，洗去微量的未結(jié)合的intein tag、chitin結(jié)合區(qū)蛋白以及其他的雜質(zhì)蛋白，目的多肽EpK最后通過增高NaCl的濃度而洗脫，收集含500 600 mM NaCl的梯度洗脫液，并在10 mM NH4HCO3進(jìn)行透析，最后凍干保存EpK粉末； (3)純化后EpK肽的鑒定 EpK的最終產(chǎn)率是IL LB培養(yǎng)菌獲得5 10 mg,經(jīng)15%還原型SDS-PAGE證實兩步純化后為一條蛋白帶，提示為高純的多肽，質(zhì)譜證實了其正確的分子量、純度和部分二聚體的形成。
3.權(quán)利要求I所述一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致心腦血管疾病藥物中的用途。
4.權(quán)利要求I所述的一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致冠心病藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致心肌梗塞疾病藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的一種重組apoE擬肽在制備治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致中風(fēng)疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人apoE擬肽及制備方法和應(yīng)用，一種分離的重組apoE擬肽(EpK)，其序列為SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。采用原核表達(dá)體系表達(dá)并經(jīng)兩步親和層析制備純化的EpK，其優(yōu)點是產(chǎn)率高、成本低、純化流程簡單、獲得無任何標(biāo)簽的高純蛋白，并且規(guī)?；磉_(dá)和純化，更易獲得高量純品肽。EpK的功能特征在于具有α螺旋結(jié)構(gòu)，無論體內(nèi)外均能與脂質(zhì)結(jié)合，并優(yōu)先與HDL結(jié)合。EpK及與其結(jié)合的HDL顯著增強(qiáng)了介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇外流及抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的功能，同時，EpK還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化的活性。一種重組人apoE擬肽在治療或預(yù)防動脈粥樣硬化所致冠心病、心肌梗塞、中風(fēng)等心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P9/10GK102863525SQ201110185560
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者喻紅, 樊大平, 杜芬, 商亮, 吳堯, 潘陽, 曹佳, 李小明 申請人:武漢大學(xué)