專利名稱：T細(xì)胞表位肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花粉過敏原的T細(xì)胞表位肽及以該肽為有效成分的基于肽的免疫治療方法中的組合物。該組合物用于治療和/或預(yù)防春天的花粉病。
背景技術(shù)：
日本人口中大約10％患有發(fā)生于春天的花粉病，例如雪松花粉病。這種情形正在增加并引起了大家的注意。
花粉病發(fā)生的時(shí)期一般相應(yīng)于花粉散發(fā)的時(shí)期。在許多情況下，在雪松花粉散發(fā)的季節(jié)過后花粉病的癥狀仍會(huì)保持，這是由于大部分雪松花粉病患者同時(shí)也對(duì)日本扁柏花粉(Hiroki cypress pollens)過敏，其花粉在雪松花粉散發(fā)期后即開始。因此，同時(shí)對(duì)日本扁柏花粉敏感的患者在一年的一長段時(shí)間中都患有花粉病的癥狀。
雪松花粉和日本扁柏花粉具有同樣的抗原性(Takeshi Ide等，AllergyClinic 11,174-178,1991)。已經(jīng)確定了雪松花粉和日本扁柏花粉之間IgE抗體的交叉反應(yīng)性(Taniai M.等，Mol.Immunol.30,183-189,1993)。患春天花粉病的患者其過敏原特異性Ig E抗體的陽性指數(shù)對(duì)雪松花粉而言是83.5％，對(duì)日本扁柏花粉是80.0％，二者同時(shí)則是76.4％(Mitsuhiro Okano等，Allergy 43,1179-1184,1994)。此外，60％患雪松花粉病的患者具有日本扁柏花粉特異性的IgE抗體(Yozo Saito,Chiryo(Therapy)78,1571-1576,1996)。根據(jù)這些報(bào)道，一般認(rèn)為患雪松花粉病的患者會(huì)患上日本扁柏花粉的花粉病，反之亦然。
花粉病是一種典型的由花粉過敏原(它是引起過敏的抗原因此基本上就是抗原)和特異于該過敏原的IgE抗體之間的抗原-抗體反應(yīng)誘導(dǎo)的Ⅰ型立即過敏。因此，目前所用的花粉病的預(yù)防和治療方法其理論根據(jù)是Ⅰ型過敏的形成機(jī)制。下面將簡要描述該機(jī)制。
被機(jī)體排斥的抗原由抗原呈遞細(xì)胞呈遞給輔助T細(xì)胞。結(jié)果，B細(xì)胞在抗體產(chǎn)生細(xì)胞中成熟。抗體產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性的Ig E抗體，該抗體結(jié)合到肥大細(xì)胞表面。隨后被排斥的抗原結(jié)合到肥大細(xì)胞表面的Ig E抗體上。這種刺激使肥大細(xì)胞釋放化學(xué)介質(zhì)例如組胺，于是引起過敏癥狀。
根據(jù)上述機(jī)制，下面是三種用于預(yù)防和治療過敏的主要方法1)排斥引起過敏的抗原，2)典型地使用抗組胺劑的化學(xué)治療，以及3)使用過敏原的脫敏作用。但是，方法1)在實(shí)踐中難于操作，而且方法2)僅僅是一種癥狀性的治療。方法3)看起來是解決根本問題的唯一途徑，但它并非總是有效而且可能會(huì)引起嚴(yán)重的副作用例如過敏性休克。
由于這些原因，最近已嘗試將使用過敏原的T細(xì)胞表位肽的基于肽的免疫治療來預(yù)防和治療過敏。T細(xì)胞表位參加引起過敏的臨床癥狀的蛋白質(zhì)過敏原的免疫反應(yīng)的起始和保持。這些T細(xì)胞表位結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞表面的Ⅱ類HLA分子上刺激相關(guān)的T細(xì)胞亞群。據(jù)信這種刺激能引發(fā)輔助T細(xì)胞水平的起始反應(yīng)。這種起始反應(yīng)能引起T細(xì)胞的增殖，淋巴因子的分泌，局部發(fā)炎反應(yīng)，增殖的免疫反應(yīng)細(xì)胞向發(fā)炎部位的遷移，以及在抗體產(chǎn)生前B細(xì)胞級(jí)聯(lián)的活化。作為這些抗體的同型的IgE抗體對(duì)過敏的發(fā)展和保持是至關(guān)重要的。另外，其產(chǎn)生會(huì)受到上述級(jí)聯(lián)開始時(shí)輔助T細(xì)胞分泌的淋巴因子的性質(zhì)影響。T細(xì)胞表位是被T細(xì)胞受體識(shí)別的基本元素和最小單位。過敏發(fā)炎可通過控制輔助T細(xì)胞的反應(yīng)來治療，使用T細(xì)胞表位肽構(gòu)成了免疫抑制的重要部分。
已知對(duì)過敏的使用T細(xì)胞表位的治療劑包括由貓?jiān)催^敏原組成的治療組合物(日本(JP-WA)No.Hei 7-505365公開的PCT申請(qǐng))，由雪松花粉T細(xì)胞表位肽Cryj1組成的治療組合物(JP-WA-Hei8-502163)，將雪松花粉T細(xì)胞表位肽Cryj1和Cryj2結(jié)合而成的多表位肽(日本專利申請(qǐng)?zhí)朒ei8-80702)。據(jù)報(bào)道日本扁柏花粉主過敏原Chao1分子量為45KD或50KD。每個(gè)分子其等電點(diǎn)都為6.8并且由含有5％糖類的蛋白質(zhì)組成(Takeshi Ide等，Nippon Kafun Gakkaishi(Joumal ofthe Japanese Pollen Association)34,39,1988)。但并不知道其基本結(jié)構(gòu)從而在過敏原分子表面上還未識(shí)別T細(xì)胞表位位點(diǎn)。最近，本發(fā)明人成功地克隆了日本扁柏過敏原基因，并表明了在Chao1之外還存在另一類型的過敏原，即Chao2。而且還確定了Chao1和Chao2的基本結(jié)構(gòu)(日本專利申請(qǐng)?zhí)朒ei6-335089)。
本發(fā)明的公開雪松花粉散發(fā)期與日本扁柏花粉散發(fā)期重疊是指花粉散發(fā)期的交叉。這兩種花粉具有一個(gè)相同的抗原性，這使得難以把由雪松花粉引起的癥狀與由日本扁柏引起的癥狀區(qū)分開來。甚至在雪松花粉散發(fā)期過后該癥狀還會(huì)繼續(xù)并發(fā)展。由于該時(shí)期空氣中的花粉絕大部分是日本扁柏花粉，這些癥狀看起來似乎是由日本扁柏花粉引起的。由于所種植的日本扁柏要多于雪松，因此雪松花粉的散發(fā)量逐年增加并且將來不久將會(huì)超過雪松花粉的散發(fā)量。因此建立一種方法用于預(yù)防和治療對(duì)春天由樹木花粉引起的基本的(root)一系列(overall)花粉病的過敏病是有用的，花粉病包括日本扁柏花粉病和雪松花粉病。有希望將使用T細(xì)胞表位肽的基于肽的免疫治療能產(chǎn)生對(duì)基本的花粉病的過敏治療。如上所述，對(duì)雪松花粉病而言已有幾種這類免疫治療的方法。然而，對(duì)日本扁柏花粉病或由春天樹木的花粉，包括雪松和日本扁柏花粉引起的花粉病還沒有任何報(bào)道。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于日本扁柏花粉病的基于肽的免疫治療的T細(xì)胞表位肽。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供T細(xì)胞表位肽用于治療春天由樹木花粉引起花粉病的患者包括與日本扁柏花粉具交叉反應(yīng)性的雪松花粉病患者的基于肽的免疫治療。
本發(fā)明人通過以覆蓋了日本扁柏花粉過敏原全部一級(jí)結(jié)構(gòu)的人工重疊肽刺激由日本扁柏花粉病患者建立的T細(xì)胞系鑒定了日本扁柏花粉過敏原分子上的T細(xì)胞表位位點(diǎn)，從而解決了上述問題。
本發(fā)明由每一個(gè)權(quán)利要求中描述的發(fā)明組成，并且將在下面進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明人確定了以SEQ ID NO:1表示的日本扁柏花粉過敏原主要抗原Chao1(成熟蛋白質(zhì))的氨基酸序列(在日本專利申請(qǐng)No.Hei6-335089中有描述)以及以SEQ ID NO:2表示的Chao2的氨基酸序列。Chao1的氨基酸序列與雪松花粉過敏原Cryj1的氨基酸序列具有80％的同源性，Chao2的氨基酸序列與雪松花粉過敏原Cryj2的氨基酸序列具有75％的同源性。
在來自于花粉、螨類和蜂毒的過敏原中有一些氨基酸取代。將這些種類的過敏原稱之為同系過敏原。例如從樺樹花粉BetvⅠ中分離到了11個(gè)同系過敏原，并且其氨基酸序列之間的差異在2％到15％的范圍內(nèi)(Swoboda,I.等，J.Biol.Chem.270:2607-2613,1995)。目前在Cryj2中發(fā)現(xiàn)了其成熟蛋白質(zhì)中有六個(gè)氨基酸殘基取代的兩個(gè)同系過敏原(未審
公開日本專利申請(qǐng)(JP-A)No.Hei8-47392及No.7-170986)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以合乎情理地認(rèn)為Chao1和Chao2中也存在著同系過敏原。本發(fā)明中這類同系過敏原也包括Chao1和Chao2。
將雪松樹這一科分成9個(gè)屬，日本扁柏科分成七個(gè)屬。據(jù)報(bào)道來自于屬于雪松(杉科)科的日本柳杉、北美紅杉以及水杉、曾被認(rèn)為屬于一個(gè)獨(dú)立的科、雪松科或松科的金松(或意大利傘松，Umbrella Pine)的過敏原與來自于柏科的日本扁柏、日本花柏、側(cè)柏、杜松及圓柏的過敏原有交叉反應(yīng)性(TakeshiIde等，Allergy Clinic,11,174-178,1991)。從該報(bào)道看來，雪松過敏原與日本扁柏有相當(dāng)廣泛的交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明的肽對(duì)日本扁柏花粉病與雪松花粉病都是普遍有效的。
為了得到本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽合成了覆蓋Chao1和Chao2整個(gè)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重疊肽；每一個(gè)肽含有足夠數(shù)量的氨基酸殘基(12到20個(gè)殘基)。本發(fā)明的肽刺激和/或抑制來源于患由春天時(shí)樹木花粉引起的花粉病的患者的T細(xì)胞活性。也就是說，本發(fā)明的肽可以引起T細(xì)胞的增值或T細(xì)胞的反應(yīng)，例如淋巴因子分泌和/或可誘導(dǎo)T細(xì)胞的無反應(yīng)性(無反應(yīng))。用與JP-A-Hei 8-47392的描述相同的方法以T細(xì)胞生長作指數(shù)可以鑒定過敏原分子上的T細(xì)胞表位位點(diǎn)。尤其是從日本扁柏花粉患者的外周淋巴細(xì)胞對(duì)每個(gè)患者建立了與Chao1和Chao2產(chǎn)生特異反應(yīng)的T細(xì)胞系或T細(xì)胞克隆。在重疊肽的每一種肽都存在的條件下培養(yǎng)T細(xì)胞系或T細(xì)胞克隆。在肽存在的條件下通過測(cè)定T細(xì)胞的增殖來識(shí)別表位位點(diǎn)(例如，細(xì)胞對(duì)[3H]胸腺嘧啶的吸收)并計(jì)算其刺激指數(shù)。此處所用的刺激指數(shù)(SI)是指在用沒有肽時(shí)細(xì)胞對(duì)[3H]胸腺嘧啶的放射性(cpm)吸收水平(對(duì)照)的值去除在有肽存在條件下細(xì)胞對(duì)[3H]胸腺嘧啶放射性(cpm)吸收水平的值而得到的。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，對(duì)每個(gè)患者組都計(jì)算了每種肽的平均刺激指數(shù)。將引起T細(xì)胞反應(yīng)和/或T細(xì)胞無反應(yīng)的肽定義為T細(xì)胞刺激活性。本發(fā)明優(yōu)選的T細(xì)胞表位肽具有T細(xì)胞刺激活性因此含有至少一個(gè)T細(xì)胞表位。Chao1的T細(xì)胞表位肽的實(shí)例見

圖1(具體見圖2、圖3以及SEQ ID NO:3到SEQ IDNO:37)，包括肽#1-2(SEQ ID NO:4)，肽#1-4(SEQ ID NO:6)，肽#1-5(SEQ ID NO:7)，肽#1-6(SEQ ID NO:8)，肽#1-7(SEQ IDNO:9)，肽#1-8(SEQ ID NO:10)，肽#1-10(SEQ ID NO:12)，肽#1-11(SEQ ID NO:13)，肽#1-12(SEQ ID NO:14)，肽#1-14(SEQID NO:16)，肽#1-15(SEQID NO:17)，肽#1-16(SEQ ID NO:18)，肽#1-19(SEQ ID NO:21)，肽#1-20(SEQ ID NO:22)，肽#1-21(SEQID NO:23)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-23(SEQ ID NO:25)，肽#1-24(SEQ ID NO:26)，肽#1-25(SEQ ID NO:27)，肽#1-26(SEQID NO:28)，肽#1-27(SEQ ID NO:29)，肽#1-30(SEQ ID NO:32)，肽#1-31(SEQ ID NO:33)，肽#1-32(SEQ ID NO:34)，肽#1-33(SEQID NO:35)，以及肽#1-34(SEQ ID NO:36)(圖4)。Chao2的T細(xì)胞表位肽的實(shí)例見圖5(具體見圖6、圖7以及SEQ ID NO:38到SEQ IDNO:88)，包括肽#2-5(SEQ ID NO:42)，肽#2-7(SEQ ID NO:44)，肽#2-8(SEQ ID NO:45)，肽#2-9(SEQ ID NO:46)，肽#2-10(SEQID NO:47)，肽#2-11(SEQ ID NO:48)，肽#2-12(SEQ ID NO:49)，肽#2-13(SEQ ID NO:50)，肽#2-14(SEQ ID NO:51)，肽#2-15(SEQID NO:52)，肽#2-16(SEQID NO:53)，肽#2-17(SEQ ID NO:54)，肽#2-18(SEQ ID NO:55)，肽#2-19(SEQ ID NO:56)，肽#2-20(SEQID NO:57)，肽#2-21(SEQ ID NO:58)，肽#2-22(SEQ ID NO:59)，肽#2-23(SEQ ID NO:60)，肽#2-24(SEQ ID NO:61)，肽#2-25(SEQID NO:62)，肽#2-26(SEQ ID NO:63)，肽#2-27(SEQ ID NO:64)，肽#1-2(SEQ ID NO:65)，肽#2-30(SEQ ID NO:67)，肽#2-31(SEQID NO:68)，肽#2-32(SEQ ID NO:69)，肽#2-33(SEQID NO:70)，肽#2-34(SEQ ID NO:71)，肽#2-35(SEQ ID NO:72)，肽#2-36(SEQID NO:73)，肽#2-37(SEQ ID NO:74)，肽#2-38(SEQ ID NO:75)，肽#2-40(SEQ ID NO:77)，肽#2-41(SEQ ID NO:78)，肽#2-42(SEQID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)(圖8)。更優(yōu)選地，該T細(xì)胞表位的平均刺激指數(shù)為2.0或更多。實(shí)例包括肽#1-2(SEQ ID NO:4)，肽#1-7(SEQ ID NO:9)，肽#1-8(SEQ ID NO:10)，肽#1-20(SEQ ID NO:22)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-24(SEQ IDNO:26)，肽#1-26(SEQ ID NO:28)，肽#1-32(SEQID NO:34)，肽#1-33(SEQ ID NO:35)，以及肽#1-34(SEQ ID NO:36)，如圖1所示。以及肽#2-10(SEQ ID NO:47)，肽#2-20(SEQ ID NO:57)，肽#2-21(SEQ ID NO:58)，肽#2-40(SEQ ID NO:77)，肽#2-41(SEQID NO:78)，肽#2-42(SEQ ID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)，如圖5所示。最優(yōu)選地，該T細(xì)胞表位肽的最小陽性指數(shù)為100。其實(shí)例包括肽#1-7(SEQ ID NO:9)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-32(SEQ ID NO:34)，肽#1-33(SEQ ID NO:35)，如圖1所示。以及肽#2-20(SEQ ID NO:57)，肽#2-40(SEQ ID NO:77)，肽#2-41(SEQID NO:78)，肽#2-42(SEQ ID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)，如圖5所示。此處所用的“陽性指數(shù)”是通過將某肽的平均刺激指數(shù)乘以對(duì)該肽具有T細(xì)胞反應(yīng)的患者的出現(xiàn)頻率(％)而得到的。
為了精確地識(shí)別該表位，具有T細(xì)胞刺激活性因而含有至少一個(gè)T細(xì)胞表位的肽可通過在該肽的氨基端或羧基端缺失任何氨基酸殘基來進(jìn)行修飾。當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)具重疊區(qū)域的肽產(chǎn)生T細(xì)胞刺激活性時(shí)，可以制備一個(gè)含重疊肽的全部或部分的新的T細(xì)胞表位肽，并以相同方法測(cè)定其T細(xì)胞刺激活性。
本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽有可能與T細(xì)胞交叉反應(yīng)中的Cryj1或Cryj2是免疫相關(guān)的。尤其是，1)Chao1的氨基酸序列與Cryj1的氨基酸序列有80％的同源性，Chao2的氨基酸序列與Cryj2的氨基酸序列有75％的同源性；2)除兩個(gè)氨基酸外(Chao1第12位上的丙氨酸相當(dāng)于CJI-1上的絲氨酸，Chao1第15位上的天冬氨酸相當(dāng)于CJI-1上的丙氨酸)，本發(fā)明實(shí)施例5中Chao1的T細(xì)胞表位肽#1-2的氨基酸序列(相當(dāng)于成熟型Chao1的SEQ ID NOS:11-30的氨基酸序列)與Cryj1的T細(xì)胞表位肽的CJI-1氨基酸序列(相當(dāng)于成熟型Cryj1的SEQ ID NOS:11-30的氨基酸序列)是相同的；以及3)雪松花粉與日本扁柏花粉具有相同的抗原性。由于這些原因，本發(fā)明T細(xì)胞表位肽的來源不限于日本扁柏。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽不僅對(duì)日本扁柏花粉病有效，而且對(duì)雪松花粉病也有效。在本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽中，參與識(shí)別T細(xì)胞受體的氨基酸殘基可用已知方法確定(例如測(cè)定因氨基酸殘基取代而引起的可能的T細(xì)胞刺激活性的變化)。用抗原特異性地控制T細(xì)胞刺激活性的其它氨基酸殘基來取代在與T細(xì)胞受體互作中具重要作用的氨基酸殘基，這樣就可以抑制過敏性發(fā)炎(增加T細(xì)胞反應(yīng)性，改變淋巴因子產(chǎn)生形式，無反應(yīng)性等)。據(jù)報(bào)道在人過敏模型中，當(dāng)雪松花粉Cryj1上T細(xì)胞表位肽的T細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸取代(第339位的蘇氨酸被取代為纈氨酸)時(shí)，所得類似肽與野生型肽在T細(xì)胞生長及IL-4的產(chǎn)生方面是基本相同但卻提高了抑制IgE抗體產(chǎn)生的IFN-γ的產(chǎn)生(Ikagawa,S.等，J.Aller.Clin.Immunol.97,54-64,1996)。還進(jìn)一步表明，HLA第二類分子的結(jié)合基元包含了3至5個(gè)由通過1至2個(gè)中間氨基酸殘基安排的氨基酸殘基，當(dāng)這些殘基含有幾種特定的氨基酸殘時(shí)，該肽會(huì)結(jié)合到HLA第二類分子上(Matushita,S.等J.Exp.Med.180:877-883，1994)。因此，用已知的方法通過確定對(duì)與HLA第Ⅱ類分子反應(yīng)中有重要作用的本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的氨基酸殘基，然后用其它氨基酸殘基來取代所確定的氨基酸殘基就可以防止過敏性發(fā)炎。而且，為增加其可溶性可以對(duì)本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽進(jìn)行修飾，于是也就增加了其治療或預(yù)防效應(yīng)或穩(wěn)定性。這類修飾包括氨基酸殘基的取代、缺失和增加。
本發(fā)明中，T細(xì)胞表位肽優(yōu)選不與IgE抗體結(jié)合。即使與IgE抗體結(jié)合，其結(jié)合程度也明顯低于與天然日本扁柏花粉過敏原與該抗體的結(jié)合，所說的肽由該日本扁柏花粉誘導(dǎo)產(chǎn)生。
本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽優(yōu)選含有至少7個(gè)氨基酸殘基。這些區(qū)域可通過對(duì)酶例如組織蛋白酶或胰蛋白酶的切割敏感的接頭例如精氨酸-精氨酸或賴氨酸-賴氨酸連接以增加對(duì)抗原呈遞細(xì)胞的加工的敏感性。由此可得到含有一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞表位的肽區(qū)域。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽可以與其它肽例如Cryj1的T細(xì)胞表位肽(JP-A-Hei 8-502163)和/或Cryj2的T細(xì)胞表位肽(JP-WA-Hei8-47392)結(jié)合使用。
當(dāng)將含有至少一個(gè)本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的肽向?qū)θ毡颈獍鼗ǚ酆?或?qū)θ毡颈獍丶把┧苫ǚ圻^敏的個(gè)體給藥時(shí)，該肽可控制該個(gè)體對(duì)過敏原的過敏反應(yīng)。因此該肽對(duì)基于肽的免疫治療是有效的。尤其是，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽的與雪松花粉的T細(xì)胞表位肽的結(jié)合可更加有效地用于由春天以雪松和日本扁柏花粉為代表的樹木花粉引起花粉病的患者的基于肽的免疫治療。
本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽可用作由日本扁柏花粉過敏原或其它與日本扁柏花粉過敏原有免疫交叉反應(yīng)性的樹木花粉引起的花粉病的診斷工具。在這種應(yīng)用上，將本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽加入到收集自患者的外周淋巴細(xì)胞中，其加入量約為0.1微克/毫升到約1毫克/毫升優(yōu)選約1到300微克/毫升。將混合物溫育一周后，測(cè)定淋巴細(xì)胞中[3H]胸腺嘧啶的吸收并評(píng)價(jià)其在花粉病診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽也可用于T細(xì)胞功能或T細(xì)胞增殖或二者的評(píng)價(jià)。當(dāng)用重組DNA技術(shù)合成本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽時(shí)，在適于宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基上培養(yǎng)用含有編碼該肽的序列的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。該肽可用已知技術(shù)從培養(yǎng)上清或宿主細(xì)胞中收獲。大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞都可以用作這類宿主細(xì)胞。
當(dāng)將本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽用于花粉病患者的基于肽的免疫治療時(shí)，該肽可與可藥用的稀釋物或載體一同給藥。此處所指的“花粉病患者”包括與日本扁柏花粉過敏原有免疫交叉反應(yīng)性的雪松花粉病患者。本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽可用簡單方法，例如通過注射(皮下或靜脈內(nèi))、滴注、鼻內(nèi)注射、口服給藥、細(xì)入或經(jīng)皮給藥。在注射時(shí)，單劑量的肽優(yōu)選從1微克到約30毫克，更優(yōu)選從約20微克到10毫克。
附圖簡要說明圖1說明了日本扁柏花粉過敏原Chao1及每一肽的陽性指數(shù)。
圖2說明了Chao1的重疊肽(#1-1到#1-28)。
圖3說明了Chao1的重疊肽(#1-29到#1-35)。
圖4說明了含Chao1的T細(xì)胞表位的肽。
圖5說明了日本扁柏花粉過敏原Chao2的T細(xì)胞表位肽及每一肽的陽性指數(shù)。
圖6說明了Chao2的重疊肽(#2-1到#2-27)。
圖7說明了Chao2的重疊肽(#2-28#2-51)。
圖8說明了含Chao2的T細(xì)胞表位的肽。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式下面將對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1重疊肽的合成根據(jù)日本扁柏花粉過敏原Chao1(SEQ ID NO:1)及Chao2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。用肽合成儀(PSSM-8,ShimadzuSaisakusho Ltd.)通過Fmoc方法合成了含20個(gè)氨基酸殘基(在肽#1-35(SEQID NO:37)中的14個(gè)殘基及肽#2-51(SEQ ID NO:88)，每個(gè)含有10個(gè)重疊殘基)的重疊肽。對(duì)Chao1制備了35種重疊肽(圖1,SEQ IDNO:37)，對(duì)Chao2制備了51種(圖5,SEQ ID NO:38到SEQ ID NO:88)。如此所得的肽用ODS柱高壓液相色譜(HPLC)純化。在上述肽中，其純度為90％或更高。用LASERMAT 2000(Finnigan MAT Ltd.)鑒定純化肽的分子量。
實(shí)施例2大腸桿菌中重組蛋白質(zhì)的表達(dá)用PCR技術(shù)從質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增了cDNA，該質(zhì)粒中已克隆了編碼日本扁柏花粉過敏原的Chao1或Chao2 cDNA(日本專利申請(qǐng)?zhí)朒ei 6-335089)。將一個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)附到了每個(gè)cDNA的末端。將該DNA片段插入到組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)表達(dá)載體pQE9中，并將所得的載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15(pREP4)。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確證了氨芐西林抗性克隆的轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)。用Ni-NTA瓊脂糖親和柱純化表達(dá)蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3如下建立Chao1的T細(xì)胞系。用Ficoll-Paque通過比重離心分離了用丙氨酸STAT(Nippon DPC公司)或CAP-RAST(Pharmacia)患者收集到的外周淋巴細(xì)胞。在補(bǔ)充以2毫升來自于同一患者的血漿(10％)或人AB型血清(20％,Banpoh Tsusho Co.,Ltd.)的RPMI 1640培養(yǎng)基(GIBCO,Inc.)中懸浮液淋巴細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞)。將該懸浮液與實(shí)施例2中所得的10到30微克/毫升的重組Chao1或與實(shí)施例1中所得的重疊肽(0.01到1微摩爾/升)一起在24孔板上溫育3到10天(37℃,CO2恒溫箱，TABAI,Inc.)。當(dāng)用顯微鏡確證Chao1刺激所活化的T細(xì)胞時(shí)，將5單位/毫升的IL-2(Boehringer Mannheim)加到系統(tǒng)中，隨后溫育過夜。第二天，用補(bǔ)充以20單位/毫升IL-2,10％到20％人AB型血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。用同樣方法每天替換培養(yǎng)基將溫育持續(xù)10天。測(cè)定了該增殖T細(xì)胞系的特異性，并將部分的T細(xì)胞系冰凍冷藏。用同樣方法從20個(gè)日本扁柏花粉病患者中也建立了有Chao2刺激的T細(xì)胞系。
實(shí)施例4抗原呈遞細(xì)胞建立建立了用EB病毒(非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒，EBV)感染B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化來的淋巴樣干細(xì)胞系(B細(xì)胞系)并用作抗原呈遞細(xì)胞。首先，在補(bǔ)充有20％失活的肽牛血清(FCS,GIBCO Inc.)的RPMI 1640培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)EBV的B-95-8細(xì)胞(marmoset,ATCC CRL 1612)。以0.22微米無菌濾紙過濾培養(yǎng)物上清。將過濾物冰凍保存于-80℃。隨后，將1毫升的EBV溶液加到日本扁柏花粉病患者的淋巴細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞)中，將混合物在37℃保持30分鐘進(jìn)行感染。將EBV感染的細(xì)胞洗滌兩次，然后在補(bǔ)充有終濃度為200納克/毫升的環(huán)孢菌素(Sandoz Pharmaceutical Co.,Ltd.)的20％FCS-RPMI 1640培養(yǎng)基中溫育約20天。在以裸眼能觀察到細(xì)胞團(tuán)后于20％FCS-RPMI培養(yǎng)基上在繼續(xù)培養(yǎng)20天。所得細(xì)胞冰凍保存待用。
實(shí)施例5T細(xì)胞表位肽的建立用50微克/毫升絲裂霉素C(Sandoz Pharmaceutical Co.,Ltd.)將實(shí)施例中所建立的B細(xì)胞培養(yǎng)系處理30分鐘或以X光曝光(50g ray)，然后以RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌4次。將B細(xì)胞接種到96孔板(10000個(gè)細(xì)胞/孔)后，在其中加入終濃度為10微克/毫升的Chao1和Chao2。對(duì)照組中加入終濃度為10微克/毫升的溶血鏈球菌細(xì)胞壁抗原(SCW)，終濃度為10微克/毫升的白色假絲酵母抗原(CA)，以及終濃度為1微克/毫升的結(jié)核菌素抗原(PPD)。接著，將來自于已建立了其細(xì)胞系的相同患者的T細(xì)胞系(20000個(gè)細(xì)胞/孔)接種到每個(gè)孔中。溫育48小時(shí)后，在每孔中加入0.5微居里[3H]胸腺嘧啶并繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。用細(xì)胞收集器(Berthold)在玻璃濾紙上收集細(xì)胞后，通過液閃計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞[3H]胸腺嘧啶的吸收來確證細(xì)胞的生長反應(yīng)。
當(dāng)確證T細(xì)胞具有對(duì)Chao1和Chao2的特異性增殖后，用實(shí)施例3中建立的T細(xì)胞系通過與上述相同的方法測(cè)定了T細(xì)胞系對(duì)每種重疊肽(終濃度為1微摩爾/升)的生長反應(yīng)。圖1和圖5中表明了T細(xì)胞系對(duì)重疊肽的生長反應(yīng)的平均刺激指數(shù)、出現(xiàn)頻率及如此計(jì)算所得的陽性指數(shù)。
而且，測(cè)定了T細(xì)胞系(N=17)對(duì)相應(yīng)于氨基酸序列#2-11和其中有一個(gè)氨基酸殘基取代的#2-12的修飾序列(SEQID NO:89和SEQ IDNO:90)的生長反應(yīng)。這兩個(gè)修飾序列的刺激活性用刺激指數(shù)表示時(shí)是1.6和1.2，用出現(xiàn)頻率表示時(shí)是16％和11％，用陽性指數(shù)表示時(shí)是25.6和13.2。如上所述，即使有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的突變，本發(fā)明的T細(xì)胞表位肽仍然保持了其T細(xì)胞刺激活性，在某些情況下其活性還有增加。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的肽含有Chao1或Chao2的至少一個(gè)T細(xì)胞表位肽，Chao1和Chao2是日本扁柏花粉的主要過敏原。本發(fā)明還進(jìn)一步包括一種與該肽有免疫T細(xì)胞交叉反應(yīng)性的其它樹木花粉的肽片段。這些肽在用于春天由以雪松和日本扁柏花粉為代表的樹木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治療是有效的。序列表SEQ ID NO:1:序列長度354序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ala Asn Trp Asp Gln5 10 15Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Ala20 25 30Met Gly Gly Lys Gly Gly Ala Phe Tyr Thr Val Thr Ser Ser Asp Asp35 40 45Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr Gly Ala Thr Arg50 55 60Glu Arg Ser Leu Trp Ile Ile Phe Ser Lys Asn Leu Asn Ile Lys Leu65 70 75 80Asn Met Pro Leu Tyr Ile Ala Gly Asn Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly85 90 95Ala Glu Val His Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys Leu Phe Met Arg Thr100 105 110Val Ser His Val Ile Leu His Gly Leu Asn Ile His Gly Cys Asn Thr115 120 125Ser Val Ser Gly Asn Val Leu Ile Ser Glu Ala Ser Gly Val Val Pro130 135 140Val His Ala Gln Asp Gly Asp Ala Ile Thr Met Arg Asn Val Thr Asp145 150 155 160Val Trp Ile Asp His Asn Ser Leu Ser Asp Ser Ser Asp Gly Leu Val165 170 175Asp Val Thr Leu Ala Ser Thr Gly Val Thr Ile Ser Asn Asn His Phe180 185 190Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Ser Asp Ile Tyr Ser195 200 205Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro210 215 220Asn Ala Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly Leu Ile His Val225 230 235 240Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Gly Ser245 250 255Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe Thr Ala Pro Asn260 265 270Asp Ser Asp Lys Lys Glu Val Thr Arg Arg Val Gly Cys Glu Ser Pro275 280 285Ser Thr Cys Ala Asn Trp Val Trp Arg Ser Thr Gln Asp Ser Phe Asn290 295 300Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Asn Glu Gly Thr Asn Ile305 310 315 320Tyr Asn Asn Asn Glu Ala Phe Lys Val Glu Asn Gly Ser Ala Ala Pro325 330 335Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ile Leu Ser Lys Pro340 345 350Cys SerSEQ ID NO:2:序列長度514序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型蛋白質(zhì)序列描述Met Gly Met Lys Phe Met Ala Ala Val Ala Phe Leu Ala Leu Gln Leu5 10 15Ile Val Met Ala Ala Ala Glu Asp Gln Ser Ala Gln Ile Met Leu Asp20 25 30Ser Asp Ile Glu Gln Tyr Leu Arg Ser Asn Arg Ser Leu Lys Lys Leu35 40 45Val His Ser Arg His Asp Ala Ala Thr Val Phe Asn Val Glu Gln Tyr50 55 60Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His Asp Ser Thr Glu Ala Phe Ala Thr65 70 75 80Thr Trp Asn Ala Ala Cys Lys Lys Ala Ser Ala Val Leu Leu Val Pro85 90 95Ala Asn Lys Lys Phe Phe Val Asn Asn Leu Val Phe Arg Gly Pro Cys100 105 110Gln Pro His Leu Ser Phe Lys Val Asp Gly Thr Ile Val Ala Gln Pro115 120 125Asp Pro Ala Arg Trp Lys Asn Ser Lys Ile Trp Leu Gln Phe Ala Gln130 135 140Leu Thr Asp Phe Asn Leu Met Gly Thr Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly145 150 155 160Gln Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys Lys Val Val Asn Gly Arg Thr Val165 170 175Cys Asn Asp Arg Asn Arg Pro Thr Ala Ile Lys Ile Asp Tyr Ser Lys180 185 190Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Thr Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe His195 200 205Leu Val Phe Gly Glu Cys Glu Gly Val Lys Ile Gln Gly Leu Lys Ile210 215 220Lys Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe Ala225 230 235 240Ser Lys Arg Phe His Ile Glu Lys Cys Val Ile Gly Thr Gly Asp Asp245 250 255Cys Ile Ala Ile Gly Thr Gly Ser Ser Asn Ile Thr Ile Lys Asp Leu260 265 270Ile Cys Gly Pro Gly His Gly Ile Ser Ile Gly Ser Leu Gly Arg Asp275 280 285Asn Ser Arg Ala Glu Val Ser His Val His Val Asn Arg Ala Lys Phe290 295 300Ile Asp Thr Gln Asn Gly Leu Arg Ile Lys Thr Trp Gln Gly Gly Ser305 310 315 320Gly Leu Ala Ser Tyr Ile Thr Tyr Glu Asn Val Glu Met Ile Ash Ser325 330 335Glu Asn Pro Ile Leu Ile Asn Gln Phe Tyr Cys Thr Ser Ala Ser Ala340 345 350Cys Gln Asn Gln Arg Ser Ala Val Gln Ile Gln Gly Val Thr Tyr Lys355 360 365Asn Ile His Gly Thr Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ile Gln Leu Met Cys370 375 380Ser Asp Ser Val Pro Cys Thr Gly Ile Gln Leu Ser Asn Vel Ser Leu385 390 395 400Lys Leu Thr Ser Gly Lys Pro Ala Ser Cys Val Asp Lys Asn Ala Arg405 410 415Gly Phe Tyr Ser Gly Arg Leu Ile Pro Thr Cys Lys Asn Leu Arg Pro420 425 430Gly Pro Ser Pro Lys Glu Phe Glu Leu Gln Gln Gln Pro Thr Thr Val435 440 443Met Asp Glu Asn Lys Gly Ala Cys Ala Lys Gly Asp Ser Thr Cys Ile450 455 460Ser Leu Ser Ser Ser Pro Pro Asn Cys Lys Asn Lys Cys Lys Gly Cys465 470 475 480Gln Pro Cys Lys Pro Lys Leu Ile Ile Val His Pro Asn Lys Pro Gln485 490 495Asp Tyr Tyr Pro Gln Lys Trp Val Cys Ser Cys His Asn Lys Ile Tyr500 505 510Asn ProSEQ ID NO:3:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ala Asn Trp Asp Gln1 5 10 15Asn Arg Met Lys20SEQ ID NO:4:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asp Ala Asn Trp Asp Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val1 5 10 15Gly Phe Gly Ser20SEQ ID NO:5:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe Gly Ser Ser Ala Met Gly Gly Lys1 5 10 15Gly Gly Ala Phe20SEQ ID NO:6:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Ala Met Gly Gly Lys Gly Gly Ala Phe Tyr Thr Val Thr Ser Ser1 5 10 15Asp Asp Asp Pro20SEQ ID NO:7:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Tyr Thr Val Thr Ser Ser Asp Asp Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly1 5 10 15Thr Leu Arg Tyr20SEQ ID NO:8:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr Gly Ala Thr Arg Glu Arg1 5 10 15Ser Leu Trp Ile20SEQ ID NO:9:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gly Ala Thr Arg Glu Arg Ser Leu Trp Ile Ile Phe Ser Lys Ash Leu1 5 10 15Asn Ile Lys Leu20SEQ ID NO:10:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ile Phe Ser Lys Asn Leu Asn Ile Lys Leu Asn Met Pro Leu Tyr Ile1 5 10 15Ala Gly Ash Lys20SEQ ID NO:11:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asn Met Pro Leu Tyr Ile Ala Gly Asn Lys Thr Ile Asp Gly Arg Gly1 5 10 15Ala Glu Val Mis20SEQ ID NO:12:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Thr Ile Asp Gly Arg Gly Ala Glu Val His Ile Gly Asn Gly Gly Pro1 5 10 15Cys Leu Phe Met20SEQ ID NO:13:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys Leu Phe Met Arg Thr Val Ser Mis Val1 5 10 15Ile Leu His Gly20SEQ ID NO:14:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Arg Thr Val Ser His Val Ile Leu Mis Gly Leu Asn Ile His Gly Cys1 5 10 15Asn Thr Ser Val20SEQ ID NO:15:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Leu Asn Ile His Gly Cys Asn Thr Ser Val Ser Gly Asn Val Leu Ile1 5 10 15Ser Glu Ala Ser20SEQ ID NO:16:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Gly Asn Val Leu Ile Ser Glu Ala Ser Gly Val Val Pro Val His1 5 10 15Ala Gln Asp Gly20SEQ ID NO:17:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gly Val Val Pro Val His Ala Gln Asp Gly Asp Ala Ile Thr Met Arg1 5 10 15Asn Val Thr Asp20SEQ ID NO:18:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asp Ala Ile Thr Met Arg Asn Val Thr Asp Val Trp Ile Asp His Asn15 10 15Ser Leu Ser Asp20SEQ ID NO:19:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Val Trp Ile Asp His Asn Ser Leu Ser Asp Ser Ser Asp Gly Leu Val1 5 10 15Asp Val Thr Leu20SEQ ID NO:20:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Ser Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Ala Ser Thr Gly Val Thr1 5 10 15Ile Ser Asn Asn20SEQ ID NO:21:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ala Ser Thr Gly Val Thr Ile Ser Asn Asn His Phe Phe Asn His His1 5 10 15Lys Val Met Leu20SEQ ID NO:22:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述His Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Ser Asp Ile1 5 10 15Tyr Ser Asp Asp20SEQ ID NO:23:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Leu Gly Mis Ser Asp Ile Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr1 5 10 15Val Ala Phe Asn20SEQ ID NO:24:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn Gln Phe Gly Pro Asn Ala1 5 10 15Gly Gln Arg Met20SEQ ID NO:25:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gln Phe Gly Pro Asn Ala Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly1 5 10 15Leu Ile His Val20SEQ ID NO:26:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Pro Arg Ala Arg Tyr Gly Leu Ile His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp1 5 10 15Pro Trp Ser Ile20SEQ ID NO:27:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Ser Ile Tyr Ala Ile Gly Gly Ser1 5 10 15Ser Asn Pro Thr20SEQ ID NO:28:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn1 5 10 15Ser Phe Thr Ala20SEQ ID NO:29:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe Thr Ala Pro Asn Asp Ser Asp Lys1 5 10 15Lys Glu Val Thr20SEQ ID NO:30:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Pro Asn Asp Ser Asp Lys Lys Glu Val Thr Arg Arg Val Gly Cys Glu1 5 10 15Ser Pro Ser Thr20SEQ ID NO:31:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Arg Arg Val Gly Cys Glu Ser Pro Ser Thr Cys Ala Asn Trp Val Trp1 5 10 15Arg Ser Thr Gln20SEQ ID NO:32:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Cys Ala Asn Trp Val Trp Arg Ser Thr Gln Asp Ser Phe Asn Asn Gly1 5 10 15Ala Tyr Phe Val20SEQID NO:33:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asp Ser Phe Asn Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Asn Glu1 5 10 15Gly Thr Asn Ile20SEQ ID NO:34:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Ser Gly Lys Asn Glu Gly Thr Asn Ile Tyr Asn Asn Asn Glu Ala1 5 10 15Phe Lys Val Glu20SEQ ID NO:35:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Tyr Asn Asn Asn Glu Ala Phe Lys Val Glu Asn Gly Ser Ala Ala Pro1 5 10 15Gln Leu Thr Lys20SEQ ID NO:36:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asn Gly Ser Ala Ala Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr1 5 10 15Cys Ile Leu Ser20SEQ ID NO:37:序列長度14序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ile Leu Ser Lys Pro Cys Ser1 5 10SEQ ID NO:38:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Met Gly Met Lys Phe Met Ala Ala Val Ala Phe Leu Ala Leu Gln Leu1 5 10 15Ile Val Met Ala20SEQ ID NO:39:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Phe Leu Ala Leu Gln Leu Ile Val Met Ala Ala Ala Glu Asp Gln Set1 5 10 15Ala Gln Ile Met20SEQ ID NO:40:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ala Ala Glu Asp Gln Ser Ala Gln Ile Met Leu Asp Ser Asp Ile Glu1 5 10 15Gln Tyr Leu Arg20SEQ ID NO:41:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Leu Asp Ser Asp Ile Glu Gln Tyr Leu Arg Ser Asn Arg Ser Leu Lys1 5 10 15Lys Leu Val His20SEQ ID NO:42:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Asn Arg Ser Leu Lys Lys Leu Val His Ser Arg His Asp Ala Ala1 5 10 15Thr Val Phe Asn20SEQ ID NO:43:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Arg His Asp Ala Ala Thr Val Phe Asn Val Glu Gln Tyr Gly Ala1 5 10 15Val Gly Asp Gly20SEQ ID NO:44:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Val Glu Gln Tyr Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His Asp Ser Thr Glu1 5 10 15Ala Phe Ala Thr20SEQ ID NO:45:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Lys His Asp Ser Thr Glu Ala Phe Ala Thr Thr Trp Asn Ala Ala Cys1 5 10 15Lys Lys Ala Ser20SEQ ID NO:46:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Thr Trp Asn Ala Ala Cys Lys Lys Ala Ser Ala Val Leu Leu Val Pro1 5 10 15Ala Asn Lys Lys20SEQID NO:47:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ala Val Leu Leu Val Pro Ala Asn Lys Lys Phe Phe Val Asn Asn Leu1 5 10 15Val Phe Arg Gly20SEQ ID NO:48:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Phe Phe Val Ash Asn Leu Val Phe Arg Gly Pro Cys Gln Pro His Leu1 5 10 15Ser Phe Lys Val20SEQ ID NO:49:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Pro Cys Gln Pro His Leu Ser Phe Lys Val Asp Gly Thr Ile Val Ala1 5 10 15Gln Pro Asp Pro20SEQ ID NO:50:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asp Gly Thr Ile Val Ala Gln Pro Asp Pro Ala Arg Trp Lys Asn Ser1 5 10 15Lys Ile Trp Leu20SEQ ID NO:51:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ala Arg Trp Lys Asn Ser Lys Ile Trp Leu Gln Phe Ala Gln Leu Thr1 5 10 15Asp Phe Asn Leu20SEQ ID NO:52:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gln Phe Ala Gln Leu Thr Asp Phe Asn Leu Met Gly Thr Gly Val Ile1 5 10 15Asp Gly Gln Gly20SEQ ID NO:53:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Met Gly Thr Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly Gln Gln Trp Trp Ala Gly1 5 10 15Gln Cys Lys Val20SEQ ID NO:54:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gln Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys Lys Val Val Asn Gly Arg Thr Val1 5 10 15Cys Asn Asp Arg20SEQ ID NO:55:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Val Asn Gly Arg Thr Val Cys Asn Asp Arg Asn Arg Pro Thr Ale Ile1 5 10 15Lys Ile Asp Tyr20SEQ ID NO:56:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Asn Arg Pro Thr Ala Ile Lys Ile Asp Tyr Ser Lys Ser Val Thr Val1 5 10 15Lys Glu Leu Thr20EQ ID NO:57:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Lys Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Thr Leu Met Asn Ser Pro Glu1 5 10 15Phe His Leu Val20SEQ ID NO:58:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe His Leu Val Phe Gly Glu Cys Glu Gly1 5 10 15Val Lys Ile Gln20SEQID NO:59:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Phe Gly Glu Cys Glu Gly Val Lys Ile Gln Gly Leu Lys Ile Lys Ala1 5 10 15Pro Arg Asp Ser20SEQ ID NO:60:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gly Leu Lys Ile Lys Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile1 5 10 15Asp Ile Phe Ala20SEQ ID NO:61:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Pro Asn Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe Ala Ser Lys Arg Phe His Ile1 5 10 15Glu Lys Cys Val20SEQ ID NO:62:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ser Lys Arg Phe His Ile Glu Lys Cys Val Ile Gly Thr Gly Asp Asp1 5 10 15Cys Ile Ala Ile20SEQ ID NO:63:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ala Ile Gly Thr Gly Ser Ser Asn1 5 10 15Ile Thr Ile Lys20SEQ ID NO:64:序列長度20序列類型氨基酸拓?fù)鋵W(xué)線性分子類型肽序列描述Gly Thr Gly Ser Ser Asn Ile Thr Ile Lys Asp Leu Ile Cys Gly Pro1 5 10 15Gly His Gly Ile20SEQ ID 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權(quán)利要求
1．包含日本扁柏花粉過敏原Cha o1的至少一種T細(xì)胞表位肽并具有選自如圖4所示的下列某一肽的氨基酸序列或所說氨基酸序列的一部分的肽，這些肽包括肽#1-2(SEQ ID NO:4)，肽#1-4(SEQ ID NO:6)，肽#1-5(SEQ ID NO:7)，肽#1-6(SEQ ID NO:8)，肽#1-7(SEQID NO:9)，肽#1-8(SEQ ID NO:10)，肽#1-10(SEQ ID NO:12)，肽#1-11(SEQ ID NO:13)，肽#1-12(SEQ ID NO:14)，肽#1-14(SEQ ID NO:16)，肽#1-15(SEQ ID NO:17)，肽#1-16(SEQID NO:18)，肽#1-19(SEQ ID NO:21)，肽#1-20(SEQID NO:22)，肽#1-21(SEQ ID NO:23)，肽#1-22(SEQ ID NO:24)，肽#1-23(SEQ ID NO:25)，肽#1-24(SEQ ID NO:26)，肽#1-25(SEQID NO:27)，肽#1-26(SEQ ID NO:28)，肽#1-27(SEQ ID NO:29)，肽#1-30(SEQ ID NO:32)，肽#1-31(SEQ ID NO:33)，肽#1-32(SEQ ID NO:34)，肽#1-33(SEQ ID NO:35)，以及肽#1-34(SEQ ID NO:36)。
2．包含日本扁柏花粉過敏原Chao2的至少一種T細(xì)胞表位肽并具有選自如圖4所示的下列某一肽的氨基酸序列或所說氨基酸序列的一部分的肽，這些肽包括#2-5(SEQ ID NO:42)，肽#2-7(SEQ ID NO:44)，肽#2-8(SEQ ID NO:45)，肽#2-9(SEQ ID NO:46)，肽#2-10(SEQID NO:47)，肽#2-11(SEQ ID NO:48)，肽#2-12(SEQ ID NO:49)，肽#2-13(SEQ ID NO:50)，肽#2-14(SEQ ID NO:51)，肽#2-15(SEQID NO:52)，肽#2-16(SEQ ID NO:53)，肽#2-17(SEQID NO:54)，肽#2-18(SEQ ID NO:55)，肽#2-19(SEQ ID NO:56)，肽#2-20(SEQ ID NO:57)，肽#2-21(SEQ ID NO:58)，肽#2-22(SEQ ID NO:59)，肽#2-23(SEQ ID NO:60)，肽#2-24(SEQID NO:61)，肽#2-25(SEQ ID NO:62)，肽#2-26(SEQ ID NO:63)，肽#2-27(SEQ ID NO:64)，肽#1-2(SEQ ID NO:65)，肽#2-30(SEQ ID NO:67)，肽#2-31(SEQ ID NO:68)，肽#2-32(SEQID NO:69)，肽#2-33(SEQ ID NO:70)，肽#2-34(SEQ ID NO:71)，肽#2-35(SEQ ID NO:72)，肽#2-36(SEQ ID NO:73)，肽#2-37(SEQID NO:74)，肽#2-38(SEQ ID NO:75)，肽#2-40(SEQID NO:77)，肽#2-41(SEQ ID NO:78)，肽#2-42(SEQ ID NO:79)，和肽#2-43(SEQ ID NO:80)。
3．權(quán)利要求1或2中所說的肽，其中所說的肽包含至少兩個(gè)T細(xì)胞表位。
4．對(duì)春天由樹木花粉引起的花粉病患者的T細(xì)胞具有刺激和/或抑制效應(yīng)并具有經(jīng)取代、缺失或插入修飾的權(quán)利要求1或2中所述的氨基酸序列的肽。
5．用于由春天因樹木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治療的組合物，包括作為有效成分的權(quán)利要求1到4中的任一項(xiàng)的肽。
6．將權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的肽用于制備春天由樹木花粉引起的花粉病的基于肽的免疫治療組合物的用途。
7．用于治療和預(yù)防春天由樹木花粉引起的花粉病的方法，包括用權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的肽進(jìn)行給藥。
8．用于診斷春天由樹木花粉引起的花粉病的試劑，包括作為有效成分的權(quán)利要求1到4中的任一項(xiàng)的肽。
9．將權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的肽用于制備診斷春天由樹木花粉引起的花粉病的試劑的用途。
10．用于診斷春天由樹木花粉引起的花粉病的方法，包括用權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的肽進(jìn)行給藥。
全文摘要
用覆蓋日本扁柏花粉過敏源一級(jí)結(jié)構(gòu)的重疊肽對(duì)來自患日本扁柏(hinoki)花粉過敏源過敏的患者的T細(xì)胞系進(jìn)行刺激從而鑒定了日本扁柏花粉過敏源的T細(xì)胞表位位點(diǎn)。該肽可用于春天的樹木花粉病包括與日本扁柏花粉有交叉反應(yīng)活性的日本扁柏花粉病的免疫治療和診斷。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1227566SQ97197087
公開日1999年9月1日 申請(qǐng)日期1997年6月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月14日
發(fā)明者紀(jì)光助, 大力一雄 申請(qǐng)人:明治乳業(yè)株式會(huì)社