專利名稱：南方鲇生長激素基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及南方鲇生長激素基因。
背景技術(shù)：
南方鲇(Silurus meridionalis)屬鲇形目，鲇科，鲇屬，俗稱河鲇，大河鲇。主產(chǎn)于長江流域的大江河中，是一種以魚為主食的大型經(jīng)濟魚類，常見個體重約2～5公斤，最大個體可達30公斤以上。它與分布很廣的那種小個體鲇(俗稱土鲇、鲇拐子)是同屬不同種。南方鲇含肉率高，蛋白質(zhì)和維生素含量豐富，肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，是產(chǎn)地群眾極為推崇的高級魚之一。四川省水產(chǎn)研究所從1985年即開始對其進行了移養(yǎng)馴化和池塘人工養(yǎng)殖的探索性試驗，結(jié)果表明，南方鲇具有生長快(在池養(yǎng)條件下，當(dāng)年4月份繁殖的魚苗到年底平均尾重可達0.4～0.5公斤，第二年可長到1.5公斤，第三年達2.7公斤)、養(yǎng)殖周期短(當(dāng)年魚苗飼養(yǎng)5～6個月即可成為商品魚)、適應(yīng)低溫能力強(我國南、北方都能在野外自然越冬)、食性可以改變(由專吃活魚蝦轉(zhuǎn)化為吃配合顆粒飼料)、消費市場廣闊(國內(nèi)外都暢銷)、經(jīng)濟效益較高(畝利潤是養(yǎng)殖常規(guī)品種的3～6倍)并具備出口創(chuàng)匯的競爭潛力等優(yōu)點。
生長激素(growth hormone，GH)是由垂體間葉嗜酸性細胞分泌的一種單一肽鏈蛋白質(zhì)激素，它是一種具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)素。能影響幾呼所有的組織類型和細胞，其主要作用是刺激骨、軟骨細胞的生長和分化；調(diào)理蛋白質(zhì)、糖及脂肪的代謝。生長激素發(fā)揮功能主要由兩個途徑一是誘導(dǎo)肝細胞、肌細胞產(chǎn)生生長激素介質(zhì)，再經(jīng)生長激素介質(zhì)間接起作用；二是直接作用于靶細胞產(chǎn)生生理效應(yīng)。無論哪一種方式都需要首先同細胞表面特異性受體結(jié)合再由受體介導(dǎo)激發(fā)一系列生化事件并最終產(chǎn)生生物效應(yīng)。(Sun et al.Foreign Medical Sectoin ofPathophysiology and Clinical Medicine 1999，19(1))魚類生長激素(fish growth hormone，fGH)是由魚腦垂體間葉細胞分泌的一種單一亞基的多肽激素，它的基本功能是促進魚體生長發(fā)育和參與多種促合成代謝作用(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊85-89)，被認為是最具潛力的魚類生長促進劑。由于魚類生長激素能夠大大加快魚類生長，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域有重大的應(yīng)用價值，日益引起人們的關(guān)注。(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊85-89)目前，魚類生長激素研究逐漸深入至分子水平，已有大馬哈魚、虹鱒、銀大馬哈魚、鰻鱺、金槍魚、羅非魚、鯉、牙鲆、真鯛、草魚、大西洋鱖等的重組生長激素cDNA被分離與克?。黄渲婿狑~、羅非魚、金槍魚、虹鱒已在工程菌或動物細胞中高效表達。(徐斌等.海洋與湖沼，1997 Vol28，No5 553-556)魚類生長激素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究已廣泛地開展，由于魚類生長激素在魚體內(nèi)本身含量很少，要通過從魚體內(nèi)直接提取，成本較大，工藝也比較的繁瑣，所有現(xiàn)階段的應(yīng)用研究主要集中在兩個方面轉(zhuǎn)生長激素基因魚的育種和魚生長激素基因工程的研究。(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊85-89)而應(yīng)用以上生物工程技術(shù)的前提是首先獲得魚類生長激素的完整cDNA序列，這是一切工作的基礎(chǔ)。
魚類生長激素基因是最早用于轉(zhuǎn)基因魚育種的目的基因。運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將含魚生長激素基因的重組DNA分子導(dǎo)入魚的受精卵中，使它在魚體內(nèi)與染色體發(fā)生重組作用。這樣外源的生長激素基因就能夠在魚體內(nèi)穩(wěn)定存在并得以表達而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)功能(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊85-89)。
1985年，朱作言等首先將外源人類生長激素基因采用顯微注射法導(dǎo)入金魚受精卵中，使其整合并表達人生長激素(徐斌等.海洋與湖沼，1997 Vol.28，No5553-556)。從這以來轉(zhuǎn)生長激素基因魚的研究已取得相當(dāng)大的進展。泥鰍、鯽魚、青魚、虹鱒、溝鯰、鮭魚、魴等生長激素基因的導(dǎo)入都相繼取得成功，還獲得了轉(zhuǎn)基因魚可以將外源基因向子代穩(wěn)定遺傳的證據(jù)(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊85-89)。Zhang等(1990)向鯉魚導(dǎo)入虹鱒，生長速度比普通魚類快而且這種特性可遺傳。(Zhang P.Mol Reprod Devel，1990，25(1)3-13)Du等(1992)將全魚生長激素基因?qū)氪笪餮篚q，成功地獲得比對照組魚大4-6倍的轉(zhuǎn)基因魚(Du，S.et al.，1992 Biotechnology，10176-181)。Devlin等(1994)將紅大馬哈魚的全魚生長激素基因?qū)脬y大馬哈魚，取得了比對照組魚生長快11倍的轉(zhuǎn)基因魚(Devlin，R H.et al.，1994，Nature，371(6 494)209-210)。.梁利群等(1994)將外源大馬哈魚生長激素基因(編碼區(qū)約3.5kb的DNA片段，包括內(nèi)含子)導(dǎo)入鯽魚，并證實其對鯽魚有促生長作用(梁利群等.生物技術(shù)，4(5)24-26，1994)。Tsai等(1995)，Xu等(1995)采用精子攜帶或電脈沖發(fā)將全魚生長激素基因分別導(dǎo)入泥鰍和牙鲆中，也獲得了比對照組魚生長快2.5倍的轉(zhuǎn)基因魚。(Tsai，H.J etal.，1995，Can.J.Aquat.Sci.，52(4)776-787.Xu，B.et al.，1995 Proceeding of FourthAsian Fisheries Forum，Edited and Published by Editorial Committee of Journal ofFisheries of China(Shanghai)，p.80.)通過將外源生長激素基因?qū)胧荏w魚并使之表達，能夠達到使養(yǎng)殖魚類快速生長的目的，特別是全魚基因元件(由魚類自身高效表達的啟動子和魚生長激素基因構(gòu)成)的使用，既可提高表達水平，又可消除哺乳類生長激素引入魚體對消費者產(chǎn)生的食用疑慮。轉(zhuǎn)基因魚研究在理論和方法上的最終突破，對縮短主要經(jīng)濟魚類的養(yǎng)殖周期，提高產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，乃至對整個水產(chǎn)養(yǎng)殖將產(chǎn)生深刻的變革(徐斌等.海洋與湖沼，1997 Vol.28，No5 553-556)。
魚類生長激素為單一多肽，沒有亞基，不需要糖基化修飾，而且二硫鍵較少，容易復(fù)性，特別適用于進行基因工程表達(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊)，而且重組生長激素與天然生長激素有相同的生物活性，引入魚體不會產(chǎn)生積累，不影響魚體的組成成分。(徐斌等.海洋與湖沼，1997 Vol.28，No5 553-556)因此，將魚生長激素基因經(jīng)過體外重組轉(zhuǎn)入表達宿主菌，構(gòu)建穩(wěn)定表達的工程菌，外源基因在宿主菌體內(nèi)大量表達，純化后可以得到相應(yīng)的生長激素。實驗證明用基因工程方法生產(chǎn)的重組魚類生長激素具有生物學(xué)活性，能夠通過口服經(jīng)腸道被魚體吸收，具有很強的促魚體生長作用(潘登等.臺灣海峽，2001，Vol.20增刊)。通過改進工藝，降低成本可望作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，產(chǎn)生可觀的經(jīng)濟效益。
目前進行的魚類生長激素的基因工程表達主要是通過大腸桿菌和酵母進行表達。簡清等(1999)用PCR技術(shù)對鮭魚生長激素基因cDNA進行改造，再將改造后的基因克隆到大腸桿菌表達質(zhì)粒pBV220，構(gòu)建重組鮭魚生長激素基因表達質(zhì)粒pBVGH18，并在大腸桿菌中獲得表達，表達量約占細胞可溶性總蛋白的10％。表達產(chǎn)物經(jīng)初步純化和復(fù)性后作為飼料添加劑投喂羅非魚，經(jīng)過五周的喂飼后，實驗魚的體重和體長增長率分別比對照快119.5％和64.5％(白俊杰等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1998，6(4).簡清，白俊杰淡水魚業(yè)，1999，29(3)3-5.)。陳丹等(1998)在甲醇酵母中成功地表達了鱸魚生長激素。通過技術(shù)克隆得鱸魚生長激素基因，與含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因啟動子的載體pHIL-D進行體外重組，構(gòu)建pHIL-GH酵母整合質(zhì)粒，這樣魚生長激素基因處于AOX基因啟動子的控制下，通過用電轉(zhuǎn)化法將魚生長激素基因整合到了酵母的染色體上。在甲醇的誘導(dǎo)下，AOX基因啟動子啟動了魚生長激素基因的表達，在搖瓶培養(yǎng)中的表達量達到了0.1(m/m)，經(jīng)過大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)還能大大提高產(chǎn)量。在喂飼羅非魚的實驗中取得了很好的促生長效果。(陳丹，王瑋.生物化學(xué)與生物物理進展，1998，25(1)140-148.)雙寶，陳榮忠，楊豐等(2001)用發(fā)酵后的酵母制成干粉作為飼料添加劑喂飼鱸魚、大黃魚，實驗組的重量平均比對照組增長20％以上。(雙寶，陳榮忠，楊豐等.鱸魚生長激素在在酵母中的表達中試實驗.2001).馬進等(1999)用PCR技術(shù)對虹鱒生長激素cDNA進行改造，將改造后的基因克隆到含酵母PRK啟動子的大腸桿菌酵母穿梭質(zhì)粒pMA91，轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y33，表達量約占細胞可溶性蛋白總量的3％，表達產(chǎn)物作為飼料添加劑投喂了羅非魚，具有明顯的促生長作用。(馬進，白俊杰.生物工程學(xué)報，1999，15(4)434-438.)巫愛珍等(1997)以PRPL，Trp啟動子在大腸桿菌中表達鯉魚生長激素重組DNA，經(jīng)過高密度發(fā)酵，包涵體的提取，恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)，每升發(fā)酵可得魚生長激素2g，在人工飼料中添加魚生長激素取得了良好的增產(chǎn)效果。(巫愛珍，孫玉昆.生物工程學(xué)報，1997，13(2)200-205)白俊杰等(1999)也進行了鯉魚生長激素的原核表達，在對羅非魚的促增長實驗中取得了良好的效果。(白俊杰，馬進.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報，1999，15(3)409-412)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種南方鲇(Silurus meridionalis)的生長激素基因，采用逆轉(zhuǎn)錄的方法，合成cDNA的第一條鏈，再以5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生長激素cDNA全長序列，方法簡便，成本低廉，加快了魚類生長，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有應(yīng)用價值。
本發(fā)明從南方鲇的腦垂體中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄的方法，合成cDNA的第一條鏈，其特征在于它以腦垂體的mRNA為模板經(jīng)RT-PCR，5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生長激素cDNA全長序列，見序列表一，其核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列見序列表二。為了克隆南方鲇生長激素cDNA，依據(jù)已知其它23種魚類的生長激素氨基酸序列保守區(qū)LLPEER的三聯(lián)密碼子(DNA序列)設(shè)計正向簡并引物GHFC(5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’)；依據(jù)已知其它20種魚類的生長激素氨基酸序列保守區(qū)SNCTL及終止密碼子的三聯(lián)密碼子(DNA序列)設(shè)計出反向簡并引物GHRA(5’TCT ACA GGG TRC AGT TKG 3’)。以垂體cDNA的第一條鏈為模板，經(jīng)30個熱循環(huán)擴增得到一條約0.4kbDNA主帶；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，此片段大小與已知其它動物相比較兩保守區(qū)間的片段大小一致。將此片段克隆到克隆載體pGEM-T easy上，陽性克隆(克隆號SsmB2)經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列分析，確認此克隆片段大小為444bp；經(jīng)查詢證實此克隆片段為生長激素cDNA部分同源分子。
30個熱循環(huán)擴增過程中，復(fù)性過程即退火采用的溫度至關(guān)重要。如果復(fù)性溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴增效率會非常低；如果復(fù)性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異復(fù)性，從而導(dǎo)致非特異性的DNA片段的擴增，無法得到目的DNA擴增片段。我們在對各種退火溫度(50℃、52℃、55℃、58℃、60℃)的比較分析試驗基上確定出DNA擴增帶清晰明亮的退火溫度55℃為最佳退火溫度。
為了進一步克隆出該生長激素cDNA3’端，依據(jù)上述cDNA片段設(shè)計出基因特異引物GHFS1。采用特異引物GHFS1和通用引物AUAP，以cDNA為模板擴增出約0.8kbDNA片段，經(jīng)克隆(克隆號SsmB1-2)和DNA序列分析，確認此克隆片段為完整的南方鲇生長激素cDNA3’端其大小為854bp。
最后依據(jù)南方鲇生長激素cDNA 444bp片段序列設(shè)計出基因特異引物GSP1和GSP2，以帶有Poly(C)垂體cDNA為模板，采用RACE方法擴增出603bp片段，經(jīng)克隆(克隆號SsmB9)和DNA序列分析，確認此克隆片段為完整的南方鲇生長激素cDNA5’端。
通過三次擴增與克隆，成功地獲得南方鲇生長激素完整cDNA。它全長1070nt(nucleotide)(不包括poly(A))，5’端非編碼區(qū)長52nt，閱讀框(ORF)長603nt，3’端非編碼區(qū)長415nt。.在Poly(A)上游21nt處，有一真核細胞保守性序列AATAAA，此為進行mRNA前體3’端剪切和加Poly(A)的信號。從cDNA序列推導(dǎo)的南方鲇生長激素前體由200個氨基酸組成其中酸性氨基酸27個(13.5％)，堿性氨基酸23個(11.5％)，極性氨基酸54個(27％)，和疏水性氨基酸71個(35.5％)，其等電點為5.94。
在NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)分別檢索核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)和氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)到目前為止既沒有南方鲇生長激素的核苷酸序列也沒有其氨基酸序列的提交，證實我們確實是首次克隆南方鲇生長激素的核苷酸序列。當(dāng)我們在NCBI網(wǎng)站分別用BlastN和BlastP進行搜索，發(fā)現(xiàn)克隆的南方鲇生長激素核苷酸序列的編碼區(qū)和據(jù)此推測的氨基酸序列與其它魚類特別是鲇形目魚類生長激素基因編碼區(qū)和氨基酸序列的相似性都很高(見序列表三)，從而基本可以確定我們克隆的確實是南方鲇的生長激素核苷酸序列。該序列可作為轉(zhuǎn)基因魚育種的目的基因片段也可被插入表達載體(pET-30a(t)、pPIC9K等)構(gòu)建表達工程菌(BL21(DE3)、BL21等)，生產(chǎn)生長激素，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖上蘊藏著巨大的應(yīng)用價值。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果與傳統(tǒng)魚類育種和喂飼普通飼料相比，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中運用轉(zhuǎn)基因育種和魚類生長激素基因工程，方法簡便，成本低廉，加快了經(jīng)濟魚類生長，大大增加了水產(chǎn)品產(chǎn)量，顯著提高了水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有巨大的應(yīng)用價值。隨著研究的不斷深入，實際生產(chǎn)中各種問題的解決，克隆出來的各種經(jīng)濟類的生長激素基因必將在水產(chǎn)養(yǎng)殖中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。


圖1、RT-PCR結(jié)果(A)和經(jīng)酶切的RT-PCR克隆片段(B)M.LambdaDNA/HindIII/Eco.RI分子標(biāo)準(zhǔn)1、5端RT-PCR；2、采用引物GHFC和GHRA的RT-PCR；3、3端RT-PCR；4、5和6分別為克隆SsmB、9SsmB2和SsmB1-2。
具體實施例方式
1、南方鲇腦垂體RNA的提取及其cDNA第一鏈的合成腦垂體經(jīng)玻璃勻漿器勻漿后采用異硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步抽提法提取總RNA，經(jīng)DNase I(TAKARA BIO)處理、苯酚和氯仿抽提、無水乙醇沉淀后溶于適量雙蒸水中。以1.5μg經(jīng)DNase I處理過的總RNA為模板，采用引物3AP(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT(T)163’)，用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(GIBCO BRL)在30μl反應(yīng)體積中合成第一鏈cDNA。Chomczynski，P.，Sacchi，N.(1987)Single-step method of RNA isolationby acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction，Anal.Biochem.，162156-159。
2、南方鲇GH cDNA部分片段的擴增根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的生長激素序列的保守區(qū)域設(shè)計了一對簡并引物正向引物GHFC(5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’)和反向引物GHRA(5’TCT ACA GGG TRCAGT TKG 3’)。以逆轉(zhuǎn)錄合成的總cDNA 0.1μl為模板進行PCR擴增，50μl反應(yīng)體積中含有10mM Tris·HCl(pH＝8.3)，1.5mM MgCl2，0.1％明膠，2個單位的Taq DNA聚合酶(Promega)，四種dNTP各200μM，每種引物各100pM。PCR條件為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)后，72℃延伸7min。
3、南方鲇生長激素cDNA3’端(下游區(qū)域)和5’端(上游區(qū)域)的擴增分別采用3’端和5’端RACE(Rapid amplification of the cDNA ends)依次擴增南方鲇生長激素cDNA的3’端(下游區(qū)域)和5’端(上游區(qū)域)以獲得完整的cDNA序列。RACE中采用的特異引物是根據(jù)RT-PCR擴增的片段分別設(shè)計。
生長激素cDNA3’端擴增以3AP合成的第一鏈cDNA為模板，采用基因特異引物GHFS1(5’AGC TGA GCA AGA TCT TCC 3’)和錨定通用引物AUAP(5’GGCCAC GCG TCG ACT AGT AC 3’)進行擴增，其PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)內(nèi)容物均同“2”。
垂體cDNA第一鏈3’端poly(c)反應(yīng)將(dT)18合成的第一鏈cDNA用RNaseH(TAKARA BIO)處理(按廠家說明進行)，再進行純化(QIAQuick PCR PurificationKit，Qiagen)，然后經(jīng)末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT，TAKARA BIO)處理在3’端加上poly(c)，其反應(yīng)見有關(guān)說明。
生長激素cDNA5’端擴增第一輪PCR以經(jīng)過poly(c)加尾的cDNA為模板，用通用引物AAP(5’GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG 3’)和基因特異引物GSP1(5’AAT CCA GGG ATC TCC TGC 3’)進行擴增；第二輪PCR以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，用通用引物AUAP和基因特異引物GSP2(5’TAG GTCTCC ACT TTG TGC 3’)進行擴增，以獲得生長激素cDNA 5’端。其中第一輪PCR進行熱循環(huán)35次，第二輪PCR進行熱循環(huán)30次。除此之外，兩次條件相同。
4、PCR產(chǎn)物的克隆、DNA序列分析和氨基酸序列的比較
PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接克隆到pGEM-T easy載體(Promega)，其具體操作見廠家說明。篩選陽性克隆，交由上海聯(lián)合基因公司，采用載體引物T7、SP6和基因特異引物，利用ABI-377全自動序列分析儀進行雙向測序。將RT-PCR和3’端、5’端RACE的測序結(jié)果用DNAStar(V.4.01)進行拼接，獲得完整的cDNA序列。并用DNAStar進行序列的比較分析。登陸NCBI網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，分別檢索核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)和氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，以確定克隆的cDNA序列是否以前從未有人獲得，并用BlastN和BlastP進行序列相似性搜索。
序列表序列表一南方鲇(Silurus meridionalis)的生長激素的全長cDNA序列。<110>武漢大學(xué)<120>南方鲇生長激素基因<160>2<210>1<211>1088<212>DNA<213>南方鲇(Silurus meridionatis)<220><221>CDS<222>(53)-(656)<220><221>Signal peptide<222>(53)-(119)<220><221>Poly(A)Signal<222>(1070)-(1088)<400>11 aaagtctacc tcgagatttc agcaggatct gagaaagttt cttctgggaa aaatggctag 6061agtgtgggtg ctgctctccg tggtgctggc gagtttgttc tttagtcagg gcgcgacatt 120121 cgagaaccag cgtctcttca acaacgcagt catccgtgtg caacaccttc atcagctggc 180181 tgccaaaatg atggatgact ttgaggaagc tttgctacct gaagaacgca aacagctgag 240241 caagatcttc ccattgtcct tctgcaattc agactccatc gaagctccat caggcaaaga 300301 cgaaacccag aagagttctg tgttgaagct gctgcacacc tcctaccgtc tgatcgagtc 360361 atgggagttc cccagtaaga acctgggcaa ccccaatcac atctcagaga agctggctga 420421 cctgaaaatg ggcatcggtg tgcttatcga gggatgtctg gatggacaaa ccagcctgga 480481 tgagaacgac tctctggctc cacccttcga ggatttctac cagaccctaa ccgagggaaa 540541 cctgaggaag agcttccgtc tgctctcctg cttcaagaag gacatgcaca aagtggagac 600601 ctatctgagc gtggccaagt gcaggagatc cctggattcc aactgcaccc tgtagagggc 660661 atgatttagc ctcagcctgt gatttgaatt gttttaatag tccaggtgta gctaaattat 720721 taatcctttt cccctggatt tcacttctaa ctttaagtat ttattttctc ctcctccatt 780781 ctcatgtctc ggcaacttta aggttgtaaa atgggactgg tttcacaacg gtgctatgca 840841 aatccagatt tctatcaaat aatgaccagc atatgataac caggatggtg gaagtatacg 900901 ctcctgcctt atgaatatat attatatttt tcatattaga gtctattcta tatactttta 960961 aagtacgaat aataatttgc tatttagctt tgaataattc ctctgtgtaa aaaaaatctc 10201021 tgtctttgtt tttgtggatt tccaataaac ctaatcttcg cattaaaatc aaaaaaaaaa10801081 aaaaaaa1088
序列表二由南方鲇(Silurus meridionalis)的生長激素基因編碼區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列。<210>2<211>200<212>PRT<213>南方鲇(Silurus meridionalis)<400>1Met Ala Arg Val Trp Val Leu Leu Ser Val Val Leu Ala Ser Leu Phe Phe Ser Gln Gly-20 -15 -10 -5Ala Thr Phe Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His Leu His1 5 10 15Gln Leu Ala Ala Lys Met Met Asp Asp Phe Glu Glu Ala Leu Leu Pro Glu Glu Arg Lys20 25 30 35Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Ser40 45 50 55Gly Lys Asp Glu Thr Gln Lys Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu His Thr Ser Tyr Arg Leu60 65 70 75Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Lys Asn Leu Gly Asn Pro Asn His Ile Ser Glu Lys80 85 90 95Lue Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Gly Val Leu Ile Glu Gly Cys Leu Asp Gly Gln Thr100 105 110 115Ser Leu Asp Glu Asn Asp Ser Leu Ala Pro Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Gln Thr Leu Thr120 125 130 135Glu Gly Asn Leu Arg Lys Ser Phe Arg Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys140 145 150 155Val Glu Thr Tyr Leu Ser Val Ala Lys Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Ash Cys Thr Leu160 165 170 175-52 AAAGTCTACCTCGAGATTTCAGCAGGATCTGAGAAAGTTTCTTCTGGGAAAA -1 21 A T F E NQ R L F N N A V I R V Q H L H 40121 CAG CTG GCT GCC AAA ATG ATG GAT GAC TTT GAG GAA GCT TTG CTA CCT GAA GAA CGC AAA 18041 Q L A A KM M D D F E E A L L P E E R K 60181 CAG CTG AGC AAG ATC TTC CCA TTG TCC TTC TGC AAT TCA GAC TCC ATC GAA GCT CCA TCA 24061 Q L S K I F P L S F C N S D S I E A P S80241 GGC AAA GAC GAA ACC CAG AAG AGT TCT GTG TTG AAG CTG CTG CAC ACC TCC TAC CGT CTG 30081 G K D E T Q K S S V L K L L H T S Y R L 100301 ATC GAG TCA TGG GAG TTC CCC AGT AAG AAC CTG GGC AAC CCC AAT CAC ATC TCA GAG AAG 360101 I E S W E F P S K N L G N P N H I S E K 120361 CTG GCT GAC CTG AAA ATG GGC ATC GGT GTG CTT ATC GAG GGA TGT CTG GAT GGA CAA ACC 420121 L A D L K M G I G V L I E G C L D G Q T140421 AGC CTG GAT GAG AAC GAC TCT CTG GCT CCA CCC TTC GAG GAT TTC TAC CAG ACC CTA ACC 480141 S L D E N D S L A P P F E D F Y Q T L T160481 GAG GGA AAC CTG AGG AAG AGC TTC CGT CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC ATG CAC AAA 540161 E G N L R K S F R L L S C F K K D M H K180541 GTG GAG ACC TAT CTG AGC GTG GCC AAG TGC AGG AGA TCC CTG GAT TCC AAC TGC ACC CTG 600181 V E T Y L S V A K C R R S L D S N C T L200601 TAG AGGGCATGATTTAGC CTCAGCCTGT GATTTGAATT GTTTTAATAG TCCAGGTGTA GCTAAATTAT 668*669 TAATCCTTTT CCCCTGGATT TCACTTCTAA CTTTAAGTAT TTATTTTCTC CTCCTCCATT728769 CTCATGTCTC GGCAACTTTA AGGTTGTAAA ATGGGACTGG TTTCACAACG GTGCTATGCA788789 AATCCAGATT TCTATCAAAT AATGACCAGC ATATGATAAC CAGGATGGTG GAAGTATACG848849 CTCCTGCCTT ATGAATATAT ATTATATTTT TCATATTAGA GTCTATTCTA TATACTTTTA908909 AAGTACGAAT AATAATTTGC TATTTAGCTT TGAATAATTC CTCTGTGTAA AAAAAATCTC968969 TGTCTTTGTT TTTGTGGATT TCCAATAAAC CTAATCTTCG CATTAAAATC AAAAAAAAAA10281029 AAAAAAA 1035序列表三在NCBI網(wǎng)站用BlastN和BlastP搜索得到的序列比對結(jié)果。gi|2147434|pir||I51114growth hormone-giant catfishLength＝200Score＝357bits(917)，Expect＝4e-98Identities＝183/200(91％)，Positives＝185/200(92％)Query1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct1 MARVLVVLSVVVASLFFSQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|4927276|gb|AAD33070.1|AF147792 1growth hormone[Heteropneustes fossilis]Length＝200Score＝354bits(909)，Expect＝4e-97Identities＝179/200(89％)，Positives＝184/200(92％)Query1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct1 MARVLVVLSVVVASLFFSQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120
QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGC+DGQTSLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNL+KSFRLLSCFKKDMHKSbjct121 LADLKMGIGVLIEGCVDGQTSLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLKKSFRLLSCFKKDMHK 180Query181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|19071230|gb|AAL84168.1|AF416489 1growth hormone protein[Heteropneustesfossilis]Length＝200Score＝354bits(909)，Expect＝4e-97Identities＝179/200(89％)，Positives＝183/200(91％)Query1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFE QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct1 MARVLVLLSVVVASLFFSQGATFETQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGC+DGQTSLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct121 LADLKMGIGVLIEGCVDGQTSLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|545073|gb|AAC60745.1|growth hormoneGH[Ictalurus punctatus]gi|8745513|gb|AAF78944.1|growth hormone[Ictalurus punctatus]Length＝200Score＝352bits(904)，Expect＝1e-96Identities＝178/200(89％)，Positives＝183/200(91％)Query1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFE+QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct1 MARVLVLLSVVVASLLFSQGATFESQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDE QKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPS+NLGNPNHISEKSbjct61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDEAQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSRNLGNPNHISEK 120Query121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEGC+DGQT LDENDSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct121 LADLKMGIGVLIEGCVDGQTGLDENDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|19071226|gb|AAL84166.1|AF416487 1growth hormone protein[Clariasgariepinus]gi|19071228|gb|AAL84167.1|AF416488 1growth hormone protein[Clariasgariepinus]Length＝200Score＝349bits(896)，Expect＝1e-95Identities＝178/200(89％)，Positives＝182/200(91％)Query1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGATFE QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct1 MARVLVLLSVVVASLFFNQGATFETQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKSbjct61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120Query121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGIGVLIEG +DGQTSLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct121 LADLKMGIGVLIEGRVDGQTSLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|19071222|gb|AAL84164.1|AF416485 1growth hormone protein[Clarias batrachus]gi|19071224|gb|AAL84165.1|AF416486 1growth hormone protein[Clariasbatrachus]Length＝200Score＝345bits(884)，Expect＝3e-94Identities＝175/200(87％)，Positives＝179/200(89％)Query1 MARXXXXXXXXXXXXXXXQGATFENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60MAR QGAT E QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKSbjct1 MARGLVLLSVVVASLFFSQGATLETQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERK 60Query61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEK 120QLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSK+LGNPNHISEKSbjct61 QLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGKDETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKSLGNPNHISEK 120Query121 LADLKMGIGVLIEGCLDGQTSLDENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180LADLKMGI VLIEGC DGQ SLDEND+ APPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKSbjct121 LADLKMGISVLIEGCEDGQASLDENDAFAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHK 180Query181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200VETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct181 VETYLSVAKCRRSLDSNCTL 200gi|425490|gb|AAB28017.1|growth hormone，GH[Ictalurus punctatus＝catfish，pituitary glands，Peptide，178 aa]Length＝178Score＝341bits(874)，Expect＝4e-93Identities＝170/178(95％)，Positives＝175/178(98％)Query23 FENQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKQLSKIFPLSFCNSDSIEAPSGK 82FE+QRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKQLSKIFPLSFCNSDSIEAP+GKSbjct1 FESQRLFNNAVIRVQHLHQLAAKMMDDFEEALLPEERKQLSKIFPLSFCNSDSIEAPAGK 60Query83 DETQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSKNLGNPNHISEKLADLKMGIGVLIEGCLDGQTSL 142DE QKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPS+NLGNPNHISEKLADLKMGIGVLIEGC+DGQT LSbjct61 DEAQKSSVLKLLHTSYRLIESWEFPSRNLGNPNHISEKLADLKMGIGVLIEGCVDGQTGL 120Query143 DENDSLAPPFEDFYQTLTEGNLRKSFRLLSCFKKDMHKVETYLSVAKCRRSLDSNCTL200DE DSLAPPFEDFYQTL+EGNLRKSFRLLSCFKKDMHKVETYLSVAKCRRSLDSNCTLSbjct121 DEEDSLAPPFEDFYQTLSEGNLRKSFRLLSCFKKDMHKVETYLSVAKCRRSLDSNCTL178gi|213566|gb|M63713.1|PNAGHPangasius pangasius growth hormone mRNA，completecdsLength＝603Score＝918bits(463)，Expect＝0.0Identities＝568/603(94％)Strand＝Plus/PlusQuery1 atggctagagtgtgggtgctgctctccgtggtgctggcgagtttgttctttagtcagggc 60||||||||||||| |||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||||||| |||5bjct1 atggctagagtgttggtggtgctctctgtggtggtggcgagtttgttctttagtcaaggc 60Query61 gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct61 gcgacattcgagaaccagcggctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120Query121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||Sbjct121 cagctggctgccaagatgatggatgactttgaggaagctctgttacctgaagaacgcaaa 180Query181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||| ||||| |||| ||||||||| || ||||||||||||||||| ||Sbjct181 cagctgagcaagattttccccctgtctttctgcaactcggactccatcgaagctcctgca 240Query241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct241 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaattgctgcacacctcctaccgtctg 300Query301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360||||||||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||| ||||||||||||||Sbjct301 atcgagtcatgggagttccccagcaagaacctcggcaaccccaaccacatctcagagaag 360Query361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| ||||||||||||||Sbjct361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggcgtgcttatcgagggatgtttggatggacaaacc 420Query421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| | | |Sbjct421 agcctggatgagaacgactctctggctccgcccttcgaggatttctaccagaccttgagc 480Query481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||Sbjct481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctgtcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540Query541 gtggagacctatctgagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct541 gtggagacctatctcagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600Query601 tag 603|||Sbjct601 tag 603gi|450294|gb|L27835.1| PGSGHAPangasianodon gigas growth hormone(GH)mRNA，complete cdsLength＝1176Score＝910bits(459)，Expect＝0.0Identities＝567/603(94％)Strand＝Plus/PlusQuery1 atggctagagtgtgggtgctgctctccgtggtgctggcgagtttgttctttagtcagggc 60||||||||||||| |||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||||||| |||Sbjct59 atggctagagtgttggtggtgctctctgtggtggtggcgagtttgttctttagtcaaggc 118Query61 gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct119 gcgacattcgagaaccagcggctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 178Query121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||||Sbjct179 cagctggctgccaagatgatggatgactttgaggaagctctgttacctgaagaacgcaaa 238Query181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||| ||||| |||| ||||||||| || ||||||||||||||||| ||Sbjct239 cagctgagcaagattttccccctgtctttctgcaactcggactccatcgaagctcctgca 298Query241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct299 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaattgctgcacacctcctaccgtctg 358Query301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360|||||||| |||||||||||||| |||||||| ||||||||||| |||||||||||||||Sbjct359 atcgagtcgtgggagttccccagcaagaacctcggcaaccccaaccacatctcagagaag 418Query361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| ||||||||||||||Sbjct419 ctggctgacctgaaaatgggcatcggcgtgcttatcgagggatgtttggatggacaaacc 478Query421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| | | |Sbjct479 agcctggatgagaacgactctctggctccgcccttcgaggatttctaccagaccttgagc 538Query481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||Sbjct539 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctgtcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 598Query541 gtggagacctatctgagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct599 gtggagacctatctcagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 658Query601 tag 603|||Sbjct659 tag 661gi|4927275|gb|AF147792.1| AF147792Heteropneustes fossilis growth hormone(GH)mRNA，complete cdsLength＝1132Score＝799bits(403)，Expect＝0.0Identities＝553/603(91％)Strand＝Plus/PlusQuery1 atggctagagtgtgggtgctgctctccgtggtgctggcgagtttgttctttagtcagggc 60||||||||||||| |||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||||||| |||Sbjct59 atggctagagtgttggtggtgctctctgtggtggtggcgagtttgttctttagtcaaggc 118Query61 gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct119 gcgacattcgagaaccagcggctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 178Query121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|||||||||||||| |||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||||Sbjct179 cagctggctgccaagatgatggatgactttgaggaagctctgttacctgaagaacgcaaa 238Query181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||| ||||| |||| ||||||||| || ||||| ||||| ||||| ||Sbjct239 cagctgagcaagattttcccgctgtctttctgcaactcggactctatcgaggctccggca 298Query241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || |||||| |||| ||||||||||||||||||||||||Sbjct299 ggcaaggacgagacccagaaaagctctgtgctgaaactgctgcacacctcctaccgtctg 358Query301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360|||||||| |||||||||||||| |||||||| |||||||| || |||||||| ||||||Sbjct359 atcgagtcgtgggagttccccagcaagaacctcggcaaccctaaccacatctccgagaag 418Query361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420|||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||||Sbjct419 ctggctgacctgaaaatgggcatcggcgtgcttatcgagggatgcgtggatggacaaacc 478Query421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480|||||||| ||||||||| || | || || |||||||||||||||||||||||||| | |Sbjct479 agcctggacgagaacgacgcttttgcgccgcccttcgaggatttctaccagaccctgagc 538Query481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540||||| ||||||| ||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||Sbjct539 gaggggaacctgaagaaaagcttccgtctgctgtcctgcttcaagaaggacatgcacaag 598Query541 gtggagacctatctgagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600||||||| |||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct599 gtggagacttatctaagcgtagccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 658Query601 tag 603|||Sbjct659 tag 661gi|19071221|gb|AF416485.1|Clarias batrachus growth hormone protein precursorRNA，complete cdsLength＝663Score＝735bits(371)，Expect＝0.0Identities＝545/603(90％)Strand＝Plus/PlusQuery1 atggctagagtgtgggtgctgctctccgtggtgctggcgagtttgttctttagtcagggc 60|||||| ||| || |||||||||||| |||||| |||||||| ||||||||||||| |||Sbjct61 atggctcgagggttggtgctgctctctgtggtggtggcgagtctgttctttagtcaaggc 120Query61 gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120|||||| | |||| |||||| ||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||Sbjct121 gcgacacttgagacccagcggctcttcaacaatgcagtcatccgcgtgcaacaccttcac 180Query121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|| ||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||||||Sbjct181 caactggctgccaagatgatggatgactttgaagaagctttgttacctgaagaacgcaaa 240Query181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||||||||| |||| ||||||||| || ||||||||||| || || ||Sbjct241 cagctgagcaagatcttccccctgtcattctgcaactcggactccatcgaggcgccggca 300Query241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||||| || 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gtggagacctatctgagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600|||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||Sbjct601 gtggagacctatctaagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcactctg 660Query601 tag 603|||Sbjct661 tag 663gi|19071225|gb|AF416487.1|Clarias gariepinus growth hormone protein precursorRNA，complete cdsLength＝619Score＝712bits(359)，Expect＝0.0Identities＝542/603(89％)Strand＝Plus/PlusQuery1 atggctagagtgtgggtgctgctctccgtggtgctggcgagtttgttctttagtcagggc 60|||||| |||| | |||||||||||| |||||| |||||||| ||||||||| ||| |||Sbjct17atggctcgagttttggtgctgctctctgtggtggtggcgagtctgttctttaatcaaggc 76Query61gcgacattcgagaaccagcgtctcttcaacaacgcagtcatccgtgtgcaacaccttcat 120||||||||| |||| |||||| ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||Sbjct77gcgacatttgagacccagcggctcttcaacaacgcggtcatccgtgtgcaacaccttcac 136Query121 cagctggctgccaaaatgatggatgactttgaggaagctttgctacctgaagaacgcaaa 180|| ||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||||||Sbjct137 caactggctgccaagatgatggatgactttgaagaagctttgttacctgaagaacgcaaa 196Query181 cagctgagcaagatcttcccattgtccttctgcaattcagactccatcgaagctccatca 240|||||||||||||||||||| |||| ||||||||| || |||||| ||||| ||||| ||Sbjct197 cagctgagcaagatcttccccctgtcattctgcaactcggactctatcgaggctccggca 256Query241 ggcaaagacgaaacccagaagagttctgtgttgaagctgctgcacacctcctaccgtctg 300||||| ||||| |||||| || || ||| |||| ||||||||||||| ||||| ||||||Sbjct257 ggcaaggacgagacccagaaaagctccgtgctgaaactgctgcacacatcctatcgtctg 316Query301 atcgagtcatgggagttccccagtaagaacctgggcaaccccaatcacatctcagagaag 360||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| || || ||||| || |||Sbjct317 atcgagtcatgggagttccccagcaagaacctgggcaaccctaaccatatctctgaaaag 376Query361 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttatcgagggatgtctggatggacaaacc 420||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| || ||||||||||||||Sbjct377 ctggctgacctgaaaatgggcatcggtgtgcttattgagggacgtgtggatggacaaacc 436Query421 agcctggatgagaacgactctctggctccacccttcgaggatttctaccagaccctaacc 480|||||||| ||||| ||| | | ||||| |||||||||||||||||||||||||| | |Sbjct437 agcctggacgagaatgacgcatttgctccgcccttcgaggatttctaccagaccctgagc 496Query481 gagggaaacctgaggaagagcttccgtctgctctcctgcttcaagaaggacatgcacaaa 540|||||| ||| ||||||||||||||||||||| || ||||||||||| ||||||||||||Sbjct497 gaggggaacttgaggaagagcttccgtctgctgtcttgcttcaagaaagacatgcacaaa 556Query541 gtggagacctatctgagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcaccctg 600|||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||Sbjct557 gtggagacttatctcagcgtggccaagtgcaggagatccctggattccaactgcactctg 616Query601 tag 603|||Sbjct617 tag 619
權(quán)利要求
1.一種南方鲇生長激素基因，其特征在于它以腦垂體的mRNA為模板經(jīng)RT-PCR，獲得cDNA的第一鏈，再依據(jù)其它已知魚類生長激素氨基酸序列保守區(qū)LLPEER的三聯(lián)密碼子和SNCTL及終止密碼子的三聯(lián)密碼子，設(shè)計一對簡并引物，正向GHFC 5’CTG TTR YCT GAD GAM CGC 3’，反向GHRA 5’TCT ACA GGGTRC AGT TKG 3’，以cDNA的第一條鏈為模板克隆得到生長激素cDNA部分同源分子，然后經(jīng)5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生長激素cDNA全長序列，并推導(dǎo)出氨基酸序列，其南方鲇的生長激素的全長cDNA序列如下1 aaagtctacc tcgagatttc agcaggatct gagaaagttt cttctgggaa aaatggctag 6061agtgtgggtg ctgctctccg tggtgctggc gagtttgttc tttagtcagg gcgcgacatt 120121 cgagaaccag cgtctcttca acaacgcagt catccgtgtg caacaccttc atcagctggc 180181 tgccaaaatg atggatgact ttgaggaagc tttgctacct gaagaacgca aacagctgag 240241 caagatcttc ccattgtcct tctgcaattc agactccatc gaagctccat caggcaaaga 300301 cgaaacccag aagagttctg tgttgaagct gctgcacacc tcctaccgtc tgatcgagtc 360361 atgggagttc cccagtaaga acctgggcaa ccccaatcac atctcagaga agctggctga 420421 cctgaaaatg ggcatcggtg tgcttatcga gggatgtctg gatggacaaa ccagcctgga 480481 tgagaacgac tctctggctc cacccttcga ggatttctac cagaccctaa ccgagggaaa 540541 cctgaggaag agcttccgtc tgctctcctg cttcaagaag gacatgcaca aagtggagac 600601 ctatctgagc gtggccaagt gcaggagatc cctggattcc aactgcaccc tgtagagggc 660661 atgatttagc ctcagcctgt gatttgaatt gttttaatag tccaggtgta gctaaattat 720721 taatcctttt cccctggatt tcacttctaa ctttaagtat ttattttctc ctcctccatt 780781 ctcatgtctc ggcaacttta aggttgtaaa atgggactgg tttcacaacg gtgctatgca 840841 aatccagatt tctatcaaat aatgaccagc atatgataac caggatggtg gaagtatacg 900901 ctcctgcctt atgaatatat attatatttt tcatattaga gtctattcta tatactttta 960961 aagtacgaat aataatttgc tatttagctt tgaataattc ctctgtgtaa aaaaaatctc 10201021 tgtctttgtt tttgtggatt tccaataaacctaatcttcg cattaaaatc aaaaaaaaaa 10801081 aaaaaaa
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南方鲇生長激素基因，其特征在于南方鲇的生長激素基因編碼的氨基酸序列如下Met Ala Arg Val Trp Val Leu Leu Ser Val Val Leu Ala Ser Leu Phe Phe Ser Gln Gly-20 -15 -10 -5Ala Thr Phe Glu Asn Gln Arg Leu Phe Asn Asn Ala Val Ile Arg Val Gln His Leu His1 5 10 15Gln Leu Ala Ala Lys Met Met Asp Asp Phe Glu Glu Ala Leu Leu Pro Glu Glu Arg Lys20 25 30 35Gln Leu Ser Lys Ile Phe Pro Leu Ser Phe Cys Asn Ser Asp Ser Ile Glu Ala Pro Ser40 45 50 55Gly Lys Asp Glu Thr Gln Lys Set Ser Val Leu Lys Leu Leu His Thr Ser Tyr Arg Leu60 65 70 75Ile Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Lys Asn Leu Gly Asn Pro Asn His Ile Ser Glu Lys80 85 90 95Lue Ala Asp Leu Lys Met Gly Ile Gly Val Leu Ile Glu Gly Cys Leu Asp Gly Gln Thr100 105 110 115Ser Leu Asp Glu Asn Asp Ser Leu Ala Pro Pro Phe Glu Asp Phe Tyr Gln Thr Leu Thr120 125 130 135Glu Gly Asn Leu Arg Lys Ser Phe Arg Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Met His Lys140 145 150 155Val Glu Thr Tyr Leu Ser Val Ala Lys Cys Arg Arg Ser Leu Asp Ser Asn Cys Thr Leu160 165 170 175-52 AAAGTCTACCTCGAGATTTCAGCAGGATCTGAGAAAGTTTCTTCTGGGAAAA-1 21A T F EN Q R L F N N A V I R V Q H L H 40121 CAG CTG GCT GCC AAA ATG ATG GAT GAC TTT GAG GAA GCT TTG CTA CCT GAA GAA CGC AAA18041Q LA A K M M D D F E E A L L P E E R K 60181 CAG CTG AGC AAG ATC TTC CCA TTG TCC TTC TGC AAT TCA GAC TCC ATC GAA GCT CCA TCA24061Q L S K I F P L S F C N S D S I E A P S 80241 GGC AAA GAC GAA ACC CAG AAG AGT TCT GTG TTG AAG CTG CTG CAC ACC TCC TAC CGT CTG30081G K D E T Q K S S V L K L LH T S Y R L 100301 ATC GAG TCA TGG GAG TTC CCC AGT AAG AAC CTG GGC AAC CCC AAT CAC ATC TCA GAG AAG360101 I E S W E F P S K N L G N P N H I S E K 120361 CTG GCT GAC CTG AAA ATG GGC ATC GGT GTG CTT ATC GAG GGA TGT CTG GAT GGA CAA ACC420121 L A D L K M G I G V L I E G C L D G Q T 140421 AGC CTG GAT GAG AAC GAC TCT CTG GCT CCA CCC TTC GAG GAT TTC TAC CAG ACC CTA ACC480141 S L D E N D S L A P P F E D F Y Q T L T 160481 GAG GGA AAC CTG AGG AAG AGC TTC CGT CTG CTC TCC TGC TTC AAG AAG GAC ATG CAC AAA540161 E G N L R K S F R L L S C F K K D M H K 180541 GTG GAG ACC TAT CTG AGC GTG GCC AAG TGC AGG AGA TCC CTG GAT TCC AAC TGC ACC CTG600181 V E T Y L S V A K C R R S L D S N C T L 200601 TAG AGGGCATGATTTAGC CTCAGcCTGT GATTTGAATT GTTTTAATAG TCCAGGTGTA GCTAAATTAT668*669 TAATCCTTTT CCCCTGGATT TCACTTCTAA CTTTAAGTAT TTATTTTCTC CTCCTCCATT 728769 CTCATGTCTC GGCAACTTTA AGGTTGTAAA ATGGGACTGG TTTCACAACG GTGCTATGCA 788789 AATCCAGATT TCTATCAAAT AATGACCAGC ATATGATAAC CAGGATGGTG GAAGTATACG 848849 CTCCTGCCTT ATGAATATAT ATTATATTTT TCATATTAGA GTCTATTCTA TATACTTTTA 908909 AAGTACGAAT AATAATTTGC TATTTAGCTT TGAATAATTC CTCTGTGTAA AAAAAATCTC 968969 TGTCTTTGTT TTTGTGGATT TCCAATAAAC CTAATCTTCG CATTAAAATC AAAAAAAAAA 10281029 AAAAAAA 103全文摘要
本發(fā)明公開了南方鲇的生長激素基因，其特征是它以腦垂體的mRNA為模板經(jīng)RT－PCR，5’RACE和3’RACE的方法得到南方鲇生長激素cDNA全長序列。該序列可作為轉(zhuǎn)基因魚育種的目的基因片段，也可被插入表達載體(pET－30a(t)、pPIC9K等)構(gòu)建表達工程菌(BL21(DE3)、BL21等)，生產(chǎn)生長激素。方法簡便，成本低廉，加快了經(jīng)濟魚類生長，在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有應(yīng)用價值。
文檔編號C07K14/435GK1482253SQ0312837
公開日2004年3月17日 申請日期2003年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月24日
發(fā)明者宋平, 宋 平 申請人:武漢大學(xué)