Cystatin S和CA15-3在制備診斷和預(yù)示乳腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了半胱氨酸蛋白酶抑制劑S（Cystatin?S）與糖類抗原15-3（CA15-3）的聯(lián)合應(yīng)用，具體為Cystatin?S與CA15-3在制備診斷和預(yù)示乳腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，本發(fā)明還公開了乳腺癌標(biāo)志物的捕獲劑和含有該捕獲劑的試劑盒，本發(fā)明公開的試劑盒具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠用于乳腺癌的早期診斷、乳腺癌治療過程中的療效評估以及治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控，其診斷結(jié)果可早于臨床癥狀。
【專利說明】Cystat i n S和CA15-3在制備診斷和預(yù)示乳腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及半胱氨酸蛋白酶抑制劑S (Cystatin S)與糖類抗原15-3 (CA15-3)在制備診斷和預(yù)示乳腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，居全球女性發(fā)病和死亡第一位，成為女性健康的重大威脅。據(jù)國際癌癥研究中心(International Agency forResearch on Cancer, IARC)報(bào)告,2008年全球女性新發(fā)乳腺癌138萬例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的22.9%，死亡46萬例，占女性惡性腫瘤死亡的13.7%。2010年《中國乳腺疾病調(diào)查報(bào)告》指出，中國乳腺癌發(fā)病率的增長速度高出西方國家I?2個百分點(diǎn)，并呈現(xiàn)出明顯的年輕化趨勢，每年約有20余萬女性罹患乳腺癌；僅2003-2009年間，中國城市乳腺癌死亡率增長了 38.91%。目前對乳腺癌仍缺乏有效的病因?qū)W預(yù)防手段，因此二級預(yù)防顯得尤為重要。乳腺癌篩查是實(shí)現(xiàn)乳腺癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療的重要的二級預(yù)防手段。大量研究表明，篩查的實(shí)施是近年來歐美各國乳腺癌死亡率下降的主要原因之一。合理的篩查能夠早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌，提高治愈率，增加“保乳”手術(shù)的機(jī)會，減少術(shù)后輔助治療，節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用，提高患者生活質(zhì)量。為此，WHO已將乳腺癌列為應(yīng)開展人群篩查的癌癥類別之一。
[0003]美國疾病檢測中心曾統(tǒng)計(jì)指出，乳腺癌的早期治愈率可達(dá)97%，而進(jìn)展期后的治愈率則只有40%左右。因此，做到早期診斷和早期治療尤為重要，可大大提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量?；罱M織病理檢查以及影像學(xué)檢查等方法診斷準(zhǔn)確度較高，但當(dāng)患者確診時往往已處于中晚期，增加了治療的復(fù)雜性。目前很多研究發(fā)現(xiàn)血清腫瘤標(biāo)志物可用于腫瘤的診斷，現(xiàn)有技術(shù)公開了以糖類抗原15-3 (CA15-3)為腫瘤標(biāo)志物診斷乳腺癌，但是單一標(biāo)志物診斷存在假陽性，并且不能用于診斷早期乳腺癌。因此，急需開發(fā)一些新的具有診斷價(jià)值的乳腺癌血清標(biāo)志物，理想的乳腺癌標(biāo)志物需要在惡變的早期階段即能敏感和特異性地從外周血中檢出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑S (Cystatin S)和CA 15-3在制備檢測乳腺癌的標(biāo)志物中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之二在于提供乳腺癌標(biāo)志物的捕獲劑；本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述捕獲劑的試劑盒；本發(fā)明的目的之四在于提供試劑盒建立計(jì)算診斷和預(yù)示乳腺癌閾值的方法。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3在制備診斷和預(yù)示乳腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原15-3的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]優(yōu)選的，所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。[0008]2.乳腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，其特征在于:所述標(biāo)志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原15-3的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]優(yōu)選的，所述捕獲劑為識別半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3的特異性抗體。
[0010]3.含有權(quán)利要求3或4所述捕獲劑的試劑盒。
[0011]優(yōu)選的，所述試劑盒為檢測血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3濃度的試劑盒。
[0012]更優(yōu)選的，所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
[0013]更優(yōu)選的，所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
[0014]最優(yōu)選的，所述單克隆抗體為鼠抗人Cystatin S單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人Cystatin S多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
[0015]4.利用所述試劑盒建立計(jì)算診斷和預(yù)示乳腺癌閾值的方法，用所述試劑盒檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3的濃度，根據(jù)P=exp(-4.147+0.664*Χ1+0.698*Χ2) ]/[1+exp (-4.147+0.664*Χ1+0.698*X2)]計(jì)算閾值 P，當(dāng) P大于0.5時，判斷為陽性；當(dāng)P小于或等于0.5時，判斷為陰性；
[0016]其中Xl為Cystatin S的濃度，單位為pg/mL ；X2為糖類抗原15-3的濃度，單位為ng/mLο
[0017]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明公開了診斷和預(yù)示乳腺癌的新標(biāo)志物，即將CystatinS和CA15-3聯(lián)合用于制備診斷和預(yù)示乳腺癌的標(biāo)志物，通過聯(lián)合兩個標(biāo)志物檢測乳腺癌，提高了診斷的靈敏度和特異性；本發(fā)明還公開了檢測乳腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，將捕獲劑與常規(guī)試劑組成檢測試劑盒，組成的試劑盒具有使用方便，重復(fù)性好，便于攜帶等特點(diǎn)，可用于乳腺癌的早期診斷、乳腺癌的療效評估或乳腺癌移轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)監(jiān)控等，其診斷乳腺癌的靈敏度為76.7%，特異性為87.5%，并且檢測結(jié)果早于臨床癥狀，為醫(yī)生提前治療和干預(yù)提供指導(dǎo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明:
[0019]圖1為Cystatin S血清檢測試劑盒檢測Cystatin S蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]圖2為Cystatin S-CA15-3聯(lián)合檢測試劑盒檢測乳腺癌ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0022]本發(fā)明使用的試劑如下:Cystatin S單克隆抗體購自美國R&D公司(貨號為:MAB1296);兔抗人Cystatin S多克隆抗體(貨號為:11542_RP02)、Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(貨號11542-H08H)購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，糖類抗原153 (CA153)定量測定試劑盒購自北京熱景生物技術(shù)有限公司。[0023]實(shí)施例1建立Cystatin S血清檢測體系及其優(yōu)化
[0024]用濃度為5 μ g/mL的鼠抗人Cystatin S單克隆抗體包被ELISA板，包被條件是在4°C條件下包被過夜，洗板；然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA中室溫封閉2小時，洗板；將濃度分別為 Opg/mL, 50pg/mL, 100pg/mL, 200pg/mL, 400pg/mL, 800pg/mL, 1600pg/mL 的 Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(編碼Cystatin S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1)和樣品加入封閉板中，于37°C反應(yīng)I小時，洗板；然后用濃度為0.5 μ g/mL HRP標(biāo)記的兔抗人Cystatin S多克隆抗體，在37°C條件下反應(yīng)I小時，洗板；再與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應(yīng)2-3分鐘，最后用濃度為2M的硫酸終止反應(yīng)，并于450nm條件下檢測OD值(圖1)。結(jié)果顯示，Cystatin S線性范圍為50pg/mL-1600pg/mL，在線性范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品線性相關(guān)系數(shù)r≥0.990，回收率在90%~110%范圍內(nèi)。
[0025]檢測體系優(yōu)化，比對分別由美國R&D，英國Abcam和美國NOVUS B10L0GICALS3個不同公司生產(chǎn)的Cystatin S單克隆抗體、美國R&D公司和北京義翹神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和R&D公司，英國Abcam和北京義翅神州生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Cystatin S多克隆抗體。結(jié)果表明，Cystatin S單克隆抗體優(yōu)選R&D公司提供的產(chǎn)品，最佳工作濃度為5 μ g/mL ；Cystatin S蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和Cystatin S多克隆抗體優(yōu)選北京義翹神州生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，最佳工作濃度為0.5 μ g/mL，在最佳條件下，可實(shí)現(xiàn)背景OD值< 0.1，能夠有效區(qū)分陰性組與陽性組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0026]固相載體的確定:對美國Corning、德國Greiner、美國Thermo和丹麥Nunc4個不同廠家生產(chǎn)的酶標(biāo)板進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，美國corning公司(貨號為:9018)和thermo(貨號為:468667)公司的酶標(biāo)板符合背景OD值< 0.1，且信噪比較高。
[0027]包被液的選擇:根據(jù)抗體包被于固相載體所需要的緩沖體系，ELISA常用包被液為緩沖鹽溶液，分別用磷酸鹽緩沖液(PH7.5)和碳酸鹽緩沖液(pH9.6)檢測包被環(huán)境對反應(yīng)體系的影響，結(jié)果顯示碳酸鹽緩沖液(PH9.6)可滿足空白組OD值< 0.1，有效區(qū)分空白組、陰性組和陽性組，信噪比較高。
[0028]稀釋劑的選擇:通過實(shí)驗(yàn)對比了 2種商品化稀釋劑(分別購自天津博美科生物技術(shù)有限公司(貨號BMKFO17-1);上海西唐生物科技有限公司(貨號C0901))和自制稀釋劑的稀釋效果，主要從保護(hù)蛋白能力，自身穩(wěn)定性兩方面評價(jià)稀釋劑的稀釋效果。結(jié)果顯示自制稀釋劑的效果最佳，自制稀釋劑各組分的終濃度如下:3mM EDTA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的BSA、1XPBS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween-20和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的硫柳汞(pH6.0)。
[0029]穩(wěn)定劑的選擇:使用3種穩(wěn)定劑(具體如下:穩(wěn)定劑1:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，體積分?jǐn)?shù)為8%的甘油和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%的NaCl ;穩(wěn)定劑I1:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，體積分?jǐn)?shù)為8%的甘油，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的EDTA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3%的NaCl，穩(wěn)定劑II1:體積分?jǐn)?shù)為68.8%的PBS，體積分?jǐn)?shù)為30%的胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的硫柳汞)分別稀釋單克隆抗體、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和多克隆抗體至濃度為0.5mg/mL、0.16ng/mL和50 μ g/mL,使用時按體積比為1:100稀釋。并于第O天、第7天和第14天進(jìn)行檢測OD值。結(jié)果顯示，穩(wěn)定劑III效果最佳，具體組分為:體積分?jǐn)?shù)為68.8%的PBS、體積分?jǐn)?shù)為30%胎牛血清和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%硫柳萊。
[0030]通過以上研究確定檢測體系的主要組分，然后建立了 Cystatin S血清檢測反應(yīng)體系O[0031]實(shí)施例2Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
[0032]根據(jù)實(shí)施例3中建立Cystatin S血清檢測反應(yīng)體系構(gòu)建Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具體組分如表1所示:
[0033]表1.Cystatin S酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組分
【權(quán)利要求】
1.半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3在制備診斷和預(yù)示乳腺癌標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原15-3的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的應(yīng)用，其特征在于:所述診斷和預(yù)示為診斷、療效評估或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)控。
3.乳腺癌標(biāo)志物的捕獲劑，其特征在于:所述標(biāo)志物為半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3，所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述糖類抗原15-3的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的捕獲劑，其特征在于:所述捕獲劑為識別半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3的特異性抗體。
5.含有權(quán)利要求3或4所述捕獲劑的試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為檢測血清中半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3濃度的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有包被有單克隆抗體的固相載體、生物素標(biāo)記的多克隆抗體和顯色底物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于:所述單克隆抗體為鼠抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S單克隆抗體，所述多克隆抗體為兔抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑S多克隆抗體，所述顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺。
10.利用權(quán)利要求5-9任一項(xiàng)所述試劑盒建立計(jì)算診斷和預(yù)示乳腺癌閾值的方法，其特征在于:用所述試劑盒檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑S和糖類抗原15-3的濃度，根據(jù)P=exp (-4.147+0.664*Χ1+0.698*Χ2) ]/[1+exp (-4.147+0.664*Χ1+0.698*X2)]計(jì)算閾值P，當(dāng)P大于0.5時，判斷為陽性；當(dāng)P小于或等于0.5時，判斷為陰性； 其中Xl為半胱氨酸蛋白酶抑制劑S的濃度，單位為pg/mL ；X2為糖類抗原15_3的濃度，單位為ng/mL。
【文檔編號】G01N33/574GK103901207SQ201310165447
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】王弢, 秦勇, 渠香云 申請人:上海良潤生物醫(yī)藥科技有限公司