乳腺癌標(biāo)志物和治療靶標(biāo)-pzr及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及乳腺癌的診斷和治療領(lǐng)域，其具體涉及用于檢測PZR的物質(zhì)在制備診斷乳腺癌的試劑盒中的用途，以及用于抑制PZR表達(dá)的物質(zhì)在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例超過130萬，每年有近50萬婦女死于乳腺癌。在世界范圍內(nèi)，乳腺癌發(fā)病率存在明顯的地區(qū)差異:在發(fā)達(dá)國家，乳腺癌發(fā)病率是70-100/100000 ;在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)的國家，包括中國其發(fā)病率是20-30/100000。然而，中國是乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一。中國城鎮(zhèn)登記處的數(shù)據(jù)顯示，近幾年乳腺癌的發(fā)病率正在迅速上升。一項研究預(yù)測表明，到2021年時年齡介于35-49歲的中國婦女乳腺癌的發(fā)病率可能會增加一倍。
[0003]乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤。根據(jù)在乳腺腫瘤中表達(dá)的不同標(biāo)記蛋白，臨床上可將乳腺癌歸成3個主要的亞型，分別是:Luminal型、HER2過表達(dá)型和三陰性。Luminal型乳腺癌表達(dá)雌激素受體(ER)和/或孕激素受體(PR)，約占乳腺癌的60% [5]。其可以進(jìn)一步劃分為Luminal A型，表達(dá)ER和PR，但不表達(dá)酪氨酸激酶受體HER2/ErbB2 ；Luminal B型，ER、PR和HER2都表達(dá)。HER2過表達(dá)型乳腺癌ER、PR均為陰性，HER2陽性，占乳腺癌的25%左右。三陰性乳腺癌(TNBC)不表達(dá)ER、PR和HER2，占乳腺癌的15%左右。目前TNBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)為ER、PR和HER2均不表達(dá)，這種方法很容易造成假陰性。所以發(fā)現(xiàn)新的TNBC生物標(biāo)志物也能夠?qū)θ幮匀橄侔┻M(jìn)行更準(zhǔn)確的診斷。
[0004]與Luminal型乳腺癌相比，HER2過表達(dá)型和TNBC乳腺癌在最初4_5年里的生存率要低很多。HER2(+)或ER(-)乳腺癌易出現(xiàn)早而頻繁地復(fù)發(fā)。TNBC通常顯示惡劣的臨床特征，即高度增生。更重要的是，TNBC患者易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，常見轉(zhuǎn)移器官為肺和肝臟器官，這是導(dǎo)致TNBC高死亡率的主要原因。用針對ER和HER2的靶向藥物來治療不同類型的乳腺癌已取得重大進(jìn)展。內(nèi)分泌治療法，如雌激素受體拮抗劑(Tamoxifen)和芳香酶抑制劑(阿那曲唑和依西美坦)在治療Luminal型乳腺癌時很有效?？笻ER2治療法，包括曲妥珠單抗(trastuzumab)和小分子抑制劑拉帕替尼(lapatinib)與標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合使用來治療轉(zhuǎn)移性HER2陽性乳腺癌。遺憾的是，至今還沒有針對TNBC乳腺癌的特效治療方法。目前治療TNBC的標(biāo)準(zhǔn)方法還是化療，特異性差且副作用大，有效期也非常短，TNBC很快就會復(fù)發(fā)和發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。缺乏特異性療法也是導(dǎo)致TNBC高死亡率的原因之一。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的TNBC生物標(biāo)志物來預(yù)測化療反應(yīng)或開發(fā)新的TNBC靶向治療藥物，以降低TNBC患者的死亡率，延長乳腺癌患者的壽命并且減少副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即PZR蛋白在ER(_)的乳腺癌特別是在TNBC中的表達(dá)要大大高于ER (+)乳腺癌。PZR蛋白的表達(dá)水平在ER+乳腺癌細(xì)胞系中
[0006](MCF7、T47D和ZR75-1)是非常低的，在Her2 (+)的乳腺癌細(xì)胞株BT-474和SKBR3略高。然而，PZR蛋白表達(dá)在大多數(shù)的TNBC細(xì)胞系(HCC70，SUM159，MB-231，BT-549，SUM149(圖1))中表達(dá)最高。
[0007]為了驗證上述實驗結(jié)果，本發(fā)明進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)掘的工作。Oncomine (www.0ncomine.0rg)數(shù)據(jù)庫中有著大量腫瘤病例的RNA微陣列芯片數(shù)據(jù)。本發(fā)明對PZR基因進(jìn)行搜索和數(shù)據(jù)整理，發(fā)現(xiàn)與乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)相似。我們發(fā)現(xiàn)在Oncomine數(shù)據(jù)庫中2個不同的人類乳腺癌數(shù)據(jù)集，PZR mRNA在TNBC-中的表達(dá)顯著高于其它類型乳腺癌(圖2)。因此，PZR蛋白可以作為一種新的TNBC標(biāo)志物，在ER、PR和HER2三陰性的基礎(chǔ)上增加PZR高表達(dá)作為評判指標(biāo)，以提高TNBC的確診率。
[0008]此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PZR高表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的迀移和侵襲能力。為了探索PZR的功能，我們通過PLK0.1慢病毒載體表達(dá)兩個不同的PZRshRNAs (shl和sh2)來干擾PZR在高表達(dá)細(xì)胞株(SUM149、MB-231和BT-549)中的表達(dá)(圖3a)。干擾PZR明顯影響了 MB-231乳腺癌細(xì)胞形狀，(扁平形態(tài))(圖3b)，意味著細(xì)胞迀移能力的降低。傷口愈合(圖3c)和Transwell迀移實驗結(jié)果表明(圖4a)，PZR KD干擾乳腺癌細(xì)胞的迀移。相反，在MCF7細(xì)胞中過度表達(dá)PZR則增強(qiáng)細(xì)胞的迀移能力(圖4c)。此外，PZR KD也降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲(圖4b)。這些數(shù)據(jù)表明，PZR對保持乳腺癌細(xì)胞活動行為是至關(guān)重要的。我們的初步數(shù)據(jù)也表明，在3個乳腺癌細(xì)胞株中，干擾PZR的表達(dá)會減少EMT標(biāo)記蛋白Vimentin的表達(dá)(圖 5)。
[0009]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PZR表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在軟瓊脂中和Tumorsphere的生長。我們發(fā)現(xiàn)，除了影響乳腺癌細(xì)胞的迀移行為，干擾PZR抑制BT-549和MB-231細(xì)胞在低密度條件下(colony forming)(圖6a)和軟瓊脂(圖6b)中的生長，顯示PZR對乳腺癌細(xì)胞在anchorage-獨立條件下生長的重要性。Anchorage-獨立生長是癌細(xì)胞的重要標(biāo)志之一。此外，我們還檢測了 PZR表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞成長為Tumorspheres的能力的影響。Tumorspheres被認(rèn)為是濃縮腫瘤干細(xì)胞(CSC)的結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)，與載體對照相比，PZR在MCF7細(xì)胞中過度表達(dá)會增加4倍Tumorsphere的數(shù)目(圖7)?？紤]到PZR表達(dá)會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的EMT (圖3，4，5)，且最近發(fā)表的研究報告顯示，乳腺CSC具有EMT的特性，我們假設(shè)PZR高表達(dá)會擴(kuò)大乳腺CSC池。這也許可以解釋為什么PZR會在侵襲性強(qiáng)的乳腺癌ER(-)細(xì)胞中表達(dá)高。
[0010]本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)異種移植小鼠腫瘤模型中shRNA干擾PZR表達(dá)會抑制三陰性乳腺腫瘤的生長(圖8)和轉(zhuǎn)移(圖9)，顯示PZR在動物體內(nèi)對腫瘤和生長和轉(zhuǎn)移的重要性，并提示其作為藥物治療靶標(biāo)的潛能。
[0011]基于以上發(fā)現(xiàn)，PZR蛋白表達(dá)水平可作為一個新的生物標(biāo)志物來幫助乳腺癌亞型的診斷和預(yù)測乳腺癌惡性程度及轉(zhuǎn)移。另一個方面，可通過檢測乳腺癌組織中的PZR蛋白水平而對乳腺癌患者的預(yù)后進(jìn)行判斷，判斷乳腺癌病人對靶向藥物治療是否有效。此外，本發(fā)明涉及以PZR作為生物標(biāo)志物進(jìn)行三陰性乳腺癌治療的新方法，涉及以PZR靶向的療法如PZR單克隆抗體和或納米粒子介導(dǎo)的PZR-siRNA或受PZR監(jiān)管信號蛋白(如SHP2)來治療ER-乳腺癌和或TNBC的藥物組合物中的用途。
【附圖說明】
[0012]圖1為PZR在三陰性乳腺癌(TNBC)和其他類型乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)量比較
[0013]圖2為PZR mRNA在三陰性乳腺癌(TNBC)和其他類型乳腺癌中的表達(dá)量比較，數(shù)據(jù)來自O(shè)ncomine數(shù)據(jù)庫，圖2a為Hatzis Breast數(shù)據(jù)集，圖2b為Stickeler Breast數(shù)據(jù)集。
[0014]圖3為干擾PZR表達(dá)對于三陰性乳腺癌細(xì)胞運動能力的影響，圖3a為指定細(xì)胞系表達(dá)對照shRNA (Csh)和兩種不同的PZR的shRNA被裂解后用western blot來檢測PZR和actin的表達(dá)；圖3b為干擾PZR表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞性狀的影響。
[0015]圖3c為劃傷后MB-231細(xì)胞的愈合情況。
[0016]圖4為PZR對三陰性乳腺癌細(xì)胞的迀移和侵襲的促進(jìn)作用。圖4a和圖4b為PZR對SUM149和MB-231細(xì)胞迀移和侵襲的作用，圖4c為ER+的MCF7細(xì)胞迀移與過度表達(dá)PZR的關(guān)系。
[0017]圖5為干擾PZR對于三種三陰性乳腺癌細(xì)胞系中Vimentin和Actin表達(dá)的影響。圖6.干擾PZR表達(dá)抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞BT-549和MB-231細(xì)胞集落的生成(圖6a)和其在軟瓊脂(圖6b)里的生長。圖6c為western blot檢測轉(zhuǎn)染NC、PZR-SH1和PZR-SH2的BT549細(xì)胞中PZR的表達(dá)量。
[0018]圖7為過表達(dá)PZR與MCF7細(xì)胞Tumorspheres增長的關(guān)系。
[0019]圖8顯示了干擾PZR表達(dá)與三陰性乳腺腫瘤生長的關(guān)系。
[0020]圖9顯示了干擾PZR表達(dá)對三陰性乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。包括肺轉(zhuǎn)移情況觀察(圖9a)和熒光信號統(tǒng)計分析(圖9b)。
實施例
[0021]實施例1.檢測樣品中是否存