本發(fā)明涉及線粒體基因型檢測領(lǐng)域，具體涉及一種蛹蟲草線粒體基因型的檢測方法。

背景技術(shù)：

蛹蟲草(cordycepsmilitaris)又叫北蟲草或北冬蟲夏草，是隸屬子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、蟲草科、蟲草屬的一種絲狀真菌。現(xiàn)代研究證實，蛹蟲草有抗腫瘤、抑制流感病毒、對輻射損傷的保護及抗炎等多種藥理作用，目前已經(jīng)在東亞地區(qū)被廣泛作為滋補品及藥用菌使用，并被用作冬蟲夏草的替代品進行開發(fā)利用。2009年蛹蟲草已被衛(wèi)生部列為新資源食品(現(xiàn)名新食品原料)，因此蛹蟲草可作為普通食品流通。目前，蛹蟲草子實體已經(jīng)實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，以蛹蟲草為主要成分的保健食品已有近50種，藥品有兩種。蛹蟲草在我國已經(jīng)形成了一個巨大的產(chǎn)業(yè)，據(jù)估計年產(chǎn)值達(dá)100億元人民幣。盡管如此，市場上有些保健食品和藥品只標(biāo)稱蟲草，而未明確說明是哪種蟲草；有的雖標(biāo)稱冬蟲夏草，但實際可能為蛹蟲草。

由于具有重要的經(jīng)濟價值，近年來人們陸續(xù)開展了蛹蟲草多種組學(xué)水平的研究工作。目前，蛹蟲草的核基因組和線粒體基因組均已公布，人們還開展了轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和蛋白質(zhì)組的研究。我們通過分析和比較不同蛹蟲草菌株的線粒體基因組，發(fā)現(xiàn)不同的蛹蟲草菌株表現(xiàn)出線粒體內(nèi)含子的插入缺失多樣性，從而具有不同的線粒體基因型(scientificreports2017,7:40219)。同時，由于為異宗配合真菌，蛹蟲草是研究真菌線粒體遺傳機制的理想材料。然而，開展線粒體遺傳機制的研究需要同時對大量蛹蟲草菌株的線粒體基因型進行分析，常規(guī)的通過測序來確定線粒體基因型的方法由于成本較高、時間較長，無法滿足該類研究的需要，亟需建立一種簡單易行的快速檢測線粒體基因型的技術(shù)體系。

根據(jù)目前已知的研究結(jié)果，蛹蟲草在其線粒體基因組中至多有8個內(nèi)含子插入位點(scientificreports2017,7:40219)。本發(fā)明以這8個潛在內(nèi)含子位點為靶標(biāo)，建立基于pcr擴增和電泳分析的快速檢測蛹蟲草線粒體基因型的技術(shù)體系。該技術(shù)體系既可輔助用于蛹蟲草遺傳穩(wěn)定性和遺傳機制的研究，還可用于蛹蟲草的真?zhèn)舞b別和工業(yè)生產(chǎn)蛹蟲草菌株間的快速“親子鑒定”。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種蛹蟲草線粒體基因型的快速檢測方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種蛹蟲草線粒體基因型的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)利用已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株，設(shè)計擴增8個線粒體內(nèi)含子位點的引物，通過pcr擴增分別得到在這些內(nèi)含子插入位點有對應(yīng)內(nèi)含子的i類擴增產(chǎn)物和在這些潛在內(nèi)含子位點缺失內(nèi)含子的ii類擴增產(chǎn)物；

(2)純化各擴增產(chǎn)物并測定濃度后，將屬于同類的擴增產(chǎn)物按相同質(zhì)量混合在一起，分別進行瓊脂糖凝膠電泳，制作成dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii；所述制作dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i的電泳條件：0.7％的瓊脂糖凝膠，電壓90v，時間120min；所述制作dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的電泳條件：2.0％的瓊脂糖凝膠，電壓100v，時間60min；

(3)取待檢測的蛹蟲草菌株，利用與步驟(1)相同的引物進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物分別按步驟(2)中dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的瓊脂糖凝膠電泳條件進行電泳，通過與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的比較，獲知待檢測的蛹蟲草菌株的線粒體基因型。

所述的pcr擴增使用的引物分別為：cm-rnl-i1f1/cm-rnl-i1r1、cm-rnl-i2f1/cm-rnl-i2r1、cm-rnl-i3f1/cm-rnl-i3r1、cm-rnl-i4f1b/cm-rnl-i4r1b、cm-cob-f1/cm-cob-r1、cm-cox1-f1/cm-cox1-r1、cm-cox2-f1/cm-cox2-r1、cm-cox3-f1/cm-cox3-r1。

所述的已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株至少為v40-5和cm09-31-28或cm06。

所述的pcr擴增使用的dna聚合酶為easytaqpcrsupermix、kodplusneo或kodfxneo。

上述技術(shù)方案中：

所有目前已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株見表1。

表1已經(jīng)線粒體基因型的蛹蟲草菌株

注：√代表某菌株在對應(yīng)位點有內(nèi)含子，×代表在對應(yīng)位點缺失內(nèi)含子。該表信息來源于scientificreports2017,7:40219。

由上表可知，在已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株中，最多含有8個內(nèi)含子插入位點，其中，在基因cox1、cox2、cox3、cob中各含有1個內(nèi)含子插入位點，在基因rnl中含有4個內(nèi)含子插入位點。在這8個內(nèi)含子位點中，rnl-i2和rnl-i4沒有缺失現(xiàn)象，而其它6個內(nèi)含子都可能發(fā)生缺失。

所述的用于制作dna分子量標(biāo)準(zhǔn)的各pcr擴增產(chǎn)物的濃度在40-60ng/μl之間，分別取2-3μl進行混合。

本發(fā)明方法通過分子量標(biāo)準(zhǔn)i和分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的雙重驗證，即可了解一個蛹蟲草菌株在8個潛在內(nèi)含子插入位點上的內(nèi)含子存在情況，從而準(zhǔn)確地確定其線粒體基因型。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點：

(1)相比傳統(tǒng)的通過測序才能確定基因型的方法，本發(fā)明所述檢測方法不需要進行測序，可以極大地節(jié)約成本。

(2)依據(jù)本發(fā)明所述檢測方法，通過與制備好的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)進行比較就可以確定待檢測蛹蟲草菌株的線粒體基因型，因此，本發(fā)明操作簡便，可極大節(jié)約檢測時間。

(3)由于蛹蟲草線粒體內(nèi)含子長度比較大(893-1828bp)，某位點有或無內(nèi)含子所得到的擴增產(chǎn)物，其大小區(qū)別是非常明顯的，因此，使用本發(fā)明制成的分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常不會出現(xiàn)模棱兩可或者判斷出錯的情況。

(4)本發(fā)明所涉及的pcr擴增和核酸電泳技術(shù)現(xiàn)在絕大多數(shù)學(xué)?；蚩蒲袡C構(gòu)普遍都能完成。本發(fā)明適用于各種pcr儀，對儀器設(shè)備無特殊要求。所述其它試劑都很容易購買。

(5)由于具有上述優(yōu)點，本發(fā)明適于同時對大量蛹蟲草菌株進行線粒體基因型的檢測。

附圖說明

圖1.蛹蟲草線粒體基因組中存在內(nèi)含子的8個位點pcr擴增片段的電泳結(jié)果，其中m為trans2kplusdnaladder。

圖2.蛹蟲草線粒體基因組中缺失內(nèi)含子的6個位點pcr擴增片段的電泳結(jié)果，其中m為trans2kplusdnaladder。

圖3.由存在內(nèi)含子的8個位點的擴增片段混合制備成的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i(m-i)，其中第1泳道m(xù)為購買的1kbplusdnaladder。

圖4.由缺失內(nèi)含子的6個位點的擴增片段混合制備成的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii(m-ii)，其中第1泳道為購買的trans2kplusdnaladder。

圖5.實施例2中菌株v40-5擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i的比較

圖6.實施例2中菌株v40-5擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的比較

圖7.實施例2中菌株cm552擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i的比較

圖8.實施例2中菌株cm552擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的比較

圖9.實施例2中菌株cm09-9-24擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i的比較

圖10.實施例2中菌株cm09-9-24擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的比較

圖11.實施例3中菌株129擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i的比較

圖12.實施例3中菌株129擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的比較

圖13.實施例3中菌株13擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i的比較

圖14.實施例3中菌株13擴增產(chǎn)物與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii的比較

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述：

實施例1：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和ii的制備

1.蛹蟲草菌株培養(yǎng)和總dna的提取

將已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株v40-5、v26-17、f02、cm09-31-18、cm09-9-24、cm06、cm552接種到新鮮制備的pda平板中，之后轉(zhuǎn)接到鋪有一層無菌玻璃紙的pda平板中，然后在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2周。收集菌絲體，充分研磨后利用ctab法提取總dna。

2.內(nèi)含子位點的擴增

參照表1，選取從步驟1中適當(dāng)?shù)木曛刑崛〉膁na作為擴增內(nèi)含子位點的模板dna。擴增內(nèi)含子位點時，首選擴增體系1，無法得到理想的擴增條帶時可選擴增體系2或擴增體系3。

pcr擴增體系1(總體積50μl)：

pcr擴增體系2(總體積50μl)：

pcr擴增體系3(總體積50μl)：

pcr擴增程序：

1)熱啟動：pcr儀機蓋溫度升至105℃，樣品槽溫度升至94℃時再放入樣品；

2)預(yù)變性：94℃5min；

3)40個變性-退火-延伸的循環(huán)：

變性：94℃1min；

退火：采用二階段退火法，前5個循環(huán)54℃，后35個循環(huán)51℃；時間1min；

延伸：72℃，延伸時間在擴增含有內(nèi)含子的片段時使用2min，在擴增缺失內(nèi)含子的片段時使用1min；

4)剩余步驟：72℃8min；4℃或12℃保存。

pcr擴增儀：使用美國伯樂公司的t100pcr儀進行擴增。

擴增各內(nèi)含子位點的引物信息見表2。設(shè)計引物時著重考慮了預(yù)期擴增片段的長度，使有內(nèi)含子的各擴增片段和無內(nèi)含子的各擴增片段分別具有不同的長度，以便通過瓊脂糖凝膠電泳能相互區(qū)分開。

表2本發(fā)明涉及的引物信息

*，在已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株中沒有發(fā)現(xiàn)在該位點內(nèi)含子缺失的情況

根據(jù)以上擴增體系和程序，得到在8個內(nèi)含子位點均含有對應(yīng)內(nèi)含子的i類擴增產(chǎn)物(圖1)和在6個位點缺失內(nèi)含子的ii類擴增產(chǎn)物(圖2)。擴增產(chǎn)物的大小與預(yù)期完全一致。

3.pcr擴增產(chǎn)物的切膠純化和定量

制備1％的瓊脂糖凝膠，將上述擴增產(chǎn)物進行電泳，電泳結(jié)束后在geldocxr+凝膠成像系統(tǒng)的紫外燈下切取含有目標(biāo)電泳條帶的膠塊，利用omega公司的gelextractionkit進行膠回收純化，濃縮后獲取純度較高、電泳條帶單一的目的dna片段。

用超微量分光光度計nonodrop2000對已純化的pcr產(chǎn)物進行定量(表3、表4)。其中，i類擴增產(chǎn)物是指在內(nèi)含子插入位點都有對應(yīng)內(nèi)含子的擴增產(chǎn)物，ii類擴增產(chǎn)物是指在這些潛在內(nèi)含子位點缺失內(nèi)含子的擴增產(chǎn)物。

表3i類擴增產(chǎn)物各dna片段的定量

表4ii類擴增產(chǎn)物各dna片段的定量

*，在已知線粒體基因型的蛹蟲草菌株中沒有發(fā)現(xiàn)在該位點內(nèi)含子缺失的情況

4.dna分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備及電泳條件的確定

參照表3和表4各dna片段的濃度定量結(jié)果，將屬于同類擴增產(chǎn)物的dna片段按相同質(zhì)量混合在一起，分別制備成dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和ii。其中，dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i(由在8個內(nèi)含子位點都存在內(nèi)含子的8個pcr擴增產(chǎn)物組成)的適宜電泳條件為：0.7％的瓊脂糖凝膠，電壓90v，電泳時間為120min；各條帶從上往下依次代表rnl-i4、cox2、rnl-i1、cox3、rnl-i2、cob、cox1、rnl-i3這八個位點有內(nèi)含子時的擴增產(chǎn)物大小(圖3)。dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii(由在6個內(nèi)含子位點缺失內(nèi)含子的6個pcr擴增產(chǎn)物組成)的適宜電泳條件為：2.0％的瓊脂糖凝膠，電壓100v，電泳時間為60min；各條帶從上往下依次代表cox2、rnl-i1、cox3、rnl-i3、cox1、cob這六個位點缺失內(nèi)含子時的擴增產(chǎn)物大小(圖4)。通過所述電泳條件下的瓊脂糖凝膠電泳，構(gòu)成dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和ii的各個條帶清晰可辨。

實施例2：用制備的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和ii驗證已知蛹蟲草菌株的線粒體基因型

1.蛹蟲草菌株培養(yǎng)和總dna的提取

選擇3株線粒體基因型已知的蛹蟲草菌株v40-5、cm552和cm09-9-24，按照實施例1中的描述進行菌株培養(yǎng)和總dna的提取。

2.內(nèi)含子位點的擴增

根據(jù)實施例1的描述，從以上3個菌株中分別用表2所列的8對引物組合進行pcr擴增。pcr擴增時的延伸時間使用2min。

3.已知蛹蟲草菌株線粒體基因型的確認(rèn)

本課題組之前的研究表明，菌株v40-5在所檢測的8個位點均存在內(nèi)含子(scientificreports2017,7:40219)。從附圖5和6可以看出，來自v40-5八個位點的擴增條帶大小很好地對應(yīng)了dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i中的各個條帶，而沒有對應(yīng)dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii中的條帶。該結(jié)果驗證了菌株v40-5在8個位點均含有內(nèi)含子。

本課題組之前研究表明，菌株cm552在cob、cox1、cox2、rnl-i2和rnl-i4這5個位點含有內(nèi)含子，而在cox3、rnl-i1和rnl-i3這3個位點缺失內(nèi)含子(scientificreports2017,7:40219)。從附圖7和8可以看出，在來自cm552八個位點的擴增條帶中，cob、cox1、cox2、rnl-i2和rnl-i4這5個位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶；cox3、rnl-i1和rnl-i3這3個位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)的條帶。該結(jié)果驗證了菌株v40-5在cob、cox1、cox2、rnl-i2和rnl-i4這5個位點含有內(nèi)含子，而在cox3、rnl-i1和rnl-i3這3個位點缺失內(nèi)含子。

本課題組之前研究表明，菌株cm09-9-24在cox1、rnl-i2、rnl-i4這3個位點含有內(nèi)含子，而在其余5個位點都缺失內(nèi)含子(scientificreports2017,7:40219)。從附圖9和10可以看出，在來自cm09-9-24八個位點的擴增條帶中，cox1、rnl-i2和rnl-i4這3個位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶；cob、cox2、cox3、rnl-i1和rnl-i3這五個位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii相對應(yīng)的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)的條帶。該結(jié)果驗證了菌株cm09-9-24在cox1、rnl-i2、rnl-i4這3個位點含有內(nèi)含子，而在其余5個位點缺失內(nèi)含子。

綜上所述，利用本發(fā)明制成的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii，3個已知蛹蟲草菌株的線粒體基因型都得到了成功驗證，證明了本發(fā)明所述檢測方法的有效性。

實施例3：用制備好的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i和ii檢測未知蛹蟲草菌株的線粒體基因型

1.蛹蟲草菌株培養(yǎng)和總dna的提取

選擇2株線粒體基因型未知的蛹蟲草菌株129和13，按照實施例1的描述進行菌株培養(yǎng)和總dna的提取。

2.目的dna片段的擴增

根據(jù)實施例1的描述，從這2個菌株中分別用表2所列的8對引物組合進行pcr擴增。pcr擴增時的延伸時間選擇2min。

3.未知蛹蟲草菌株線粒體基因型的檢測

從附圖11和12可以看出，菌株129在rnl-i2和rnl-i4這兩個位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)大小的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶；cob、cox1、cox2、cox3、rnl-i1、rnl-i3這6個位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)的條帶。該結(jié)果表明，菌株129只在rnl-i2和rnl-i4這兩個位點含有內(nèi)含子，而在其它6個位點缺失內(nèi)含子。

從附圖13和14可以看出，菌株13在cob、cox1、cox2、cox3、rnl-i1、rnl-i2和rnl-i4這7個位點都有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)大小的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶；rnl-i3位點有與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)ii對應(yīng)的條帶，而無與dna分子量標(biāo)準(zhǔn)i對應(yīng)的條帶。該結(jié)果表明，菌株13在cob、cox1、cox2、cox3、rnl-i1、rnl-i2和rnl-i4這7個位點均含有內(nèi)含子，而在rnl-i3位點缺失內(nèi)含子。

綜上所述，本發(fā)明制成的兩種dna分子量標(biāo)準(zhǔn)可用于確定未知蛹蟲草菌株的線粒體基因型。

sequencelisting

<110>山西大學(xué)

<120>一種蛹蟲草線粒體基因型的檢測方法

<130>.

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