桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用，啟動(dòng)子為如下所示：序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA片段；在嚴(yán)格條件下與上述限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；與上述限定的DNA序列具有90％以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。利用MmPIP2基因啟動(dòng)子在干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫條件下總體表達(dá)的升降情況、在不同的脅迫時(shí)間內(nèi)相對(duì)基因表達(dá)量指標(biāo)，以及MmPIP2基因啟動(dòng)子在不同桑品種中的表達(dá)差異，和MmPIP2基因啟動(dòng)子在不同的地理位置和不同抗病能力的桑樹(shù)的表達(dá)情況，可以用于桑樹(shù)抗逆性研究和轉(zhuǎn)基因育種。
【專利說(shuō)明】桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及到一種來(lái)源于桑樹(shù)水通道蛋白中的磷脂酰肌 醇4,5二憐酸（口1108口1131：丨(171；[1108；[1：01(4,5)-13丨8口1108口113七6，？1?2)基因啟動(dòng)子的克隆，及 其在逆境（干旱、低溫、PEG-6000模擬干旱、鹽、抗病感?。┟{迫下的表達(dá)模式。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，常常會(huì)受到諸多不良逆境如干旱、低溫、鹽漬等因素引起 的脫水脅迫的影響，會(huì)引起其體內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的生理生化變化。蛋白質(zhì)的合成途徑受 到抑制，同時(shí)產(chǎn)生許多新蛋白來(lái)應(yīng)對(duì)危機(jī)。植物水通道蛋白是一類位于細(xì)胞質(zhì)膜上專一性 運(yùn)輸水的蛋白。鹽脅迫通過(guò)在分子水平上影響水通道蛋白的特性和豐度，來(lái)改變細(xì)胞對(duì)水 分的吸收，降低細(xì)胞滲透壓，緩解鹽對(duì)植物的傷害。但植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn) 行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用，植物基因啟動(dòng)子是重要的順 式作用元件，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心，因此通過(guò)對(duì)PIP2啟動(dòng)子序列的克隆和分析，將為闡明這 個(gè)基因在非生物脅迫應(yīng)答途徑中的作用奠定基礎(chǔ)。
[0003] 水孔蛋白（aquaporin，AQP)是一種選擇性水轉(zhuǎn)運(yùn)膜內(nèi)在蛋白（membrane intrinsic proteins，MIP)，分子量約為24-30kDa，存在于許多植物、動(dòng)物和微生物的生物 膜上。植物水孔蛋白根據(jù)氨基酸序列的同源性和亞細(xì)胞定位，通常把其分為4大類：①質(zhì)膜 內(nèi)在蛋白（plasmamembrane intrinsic proteins, PIPs)，主要分布在細(xì)胞質(zhì)膜上；②根瘤 菌共生膜上的 N0D26 內(nèi)在蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)及類似物； ③液泡膜內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic proteins, TIPs),主要位于液泡膜上，分為α、 β、Υ、δ和ε-ΤΙΡ五個(gè)亞類；④小分子堿性膜內(nèi)在蛋白（small and basic intrinsic proteins，SIPs)，可分為SIP 1和SIP2兩個(gè)亞類。
[0004] 植物水孔蛋白基因不僅具有豐富的多樣性還有極高的豐度。這種多樣性表現(xiàn)在種 間多樣性的分布和表現(xiàn)在種內(nèi)組織、器官和細(xì)胞上的時(shí)空特異性。在當(dāng)前已知的所有高等 植物PIPs中，它們都具有兩個(gè)高度保守的相同區(qū)域，分別位于C環(huán)和E環(huán)上，猜測(cè)可能與 PIPs功能的特異性有關(guān)。根據(jù)N-端和C-端的不同，可以將PIPs分為PIP 1和PIP2兩類， 二者有極高的相似度，區(qū)別是PIP1比PIP2擁有更長(zhǎng)的N-端和較短的C-端，并且在序列當(dāng) 中各自都有相應(yīng)的保守氨基酸。另外，水通道蛋白PIP2亞家族貌似比PIP 1運(yùn)輸水分的效 率更高，在爪蟾卵母細(xì)胞的功能分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)PIP2增加卵母細(xì)胞膜水分的滲透性大約為10 到20倍的效率，而PIP 1水孔蛋白對(duì)于膜的透水性沒(méi)有影響或者影響極低。隨著PIP2的 發(fā)現(xiàn)并被克隆，人們發(fā)現(xiàn)PIP2亞家族的各個(gè)蛋白在不同的物種中也顯現(xiàn)出不同的生物學(xué) 功能，并證明了它們對(duì)植物不同的生理進(jìn)程起著非常重要的作用。這些水通道蛋白可在根 系、葉片、生殖器官和種子萌發(fā)等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與水分的運(yùn)輸。
[0005] 桑樹(shù)作為應(yīng)用于蠶桑產(chǎn)業(yè)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，是家蠶（Bombyx mori)的唯一飼 料來(lái)源。我們用已克隆得到的魯桑品種（Morus multicaulis)育71-lMmPIP2基因全長(zhǎng)序列 設(shè)計(jì)引物通過(guò)染色體步移的方法獲得該基因的啟動(dòng)子序列。用PLACE中的plant care軟 件對(duì)該序列進(jìn)行了分析，啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：在魯桑育71-1的PIP2啟動(dòng)子中除了轉(zhuǎn) 錄必須的TATA_box、GATA_box以及CAAT-box等保守元件外，還存在一些感應(yīng)環(huán)境脅迫、光、 水分、激素應(yīng)答及生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)的元件，如響應(yīng)參與光調(diào)節(jié)的AE-box、AT 1-motif、G-box、 GAG以及GATA-motif、I-box等，脫落酸應(yīng)答因子ABRE、胚乳表達(dá)因子Skn-lmotif，植物激 素應(yīng)答因子TGA-element，細(xì)胞周期調(diào)控應(yīng)答因子MSA-like等。并采用qRT-PCR的方法檢 測(cè)MmPIP2基因啟動(dòng)子在干旱、低溫、PEG模擬干旱脅迫和鹽脅迫以及抗病感病幾種條件下 的表達(dá)模式。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明旨在提供桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng) 用，該啟動(dòng)子屬于水通道蛋白家族新成員，內(nèi)容涉及其cDNA全長(zhǎng)序列、功能域分析，該基因 在干旱、低溫、PEG-6000模擬干旱、鹽、抗病感病逆境的誘導(dǎo)下的表達(dá)模式及應(yīng)用。
[0007] 技術(shù)方案：一種桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，為如下（1)、（2)或（3)所 示：
[0008] (1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA片段；
[0009] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段；
[0010] ⑶與⑴限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。
[0011] 擴(kuò)增權(quán)利要求1所述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子全長(zhǎng)或其任意片段的 引物對(duì)。
[0012] 上述引物如SEQ ID N0. 2?4所示。
[0013] 含有上述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或表達(dá)盒。
[0014] 上述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子在使目的基因在植物非生物脅迫表達(dá) 中的應(yīng)
[0015] 用。
[0016] 上述應(yīng)用中非生物脅迫為低溫、干旱、模擬干旱、和高鹽脅迫環(huán)境。
[0017] 上述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子在植物的遺傳育種中的應(yīng)用。
[0018] 上述植物為桑樹(shù)。
[0019] 一種使目的基因在植物非生物脅迫表達(dá)的試劑盒，含有SEQ ID NO. 1所示的DNA 片段。
[0020] 有益效果：本發(fā)明的MmPIP2DNA片段是一啟動(dòng)子，且該啟動(dòng)子有很強(qiáng)的特異表達(dá) 活性，通過(guò)熒光定量PCR分析，利用MmPIP2基因啟動(dòng)子在干旱脅迫、鹽脅迫和低溫脅迫條件 下總體表達(dá)的升降情況、在不同的脅迫時(shí)間內(nèi)相對(duì)基因表達(dá)量指標(biāo)，以及MmPIP2基因啟動(dòng) 子在不同桑品種中的表達(dá)差異，和MmPIP2基因啟動(dòng)子在不同的地理位置和不同抗病能力 的桑樹(shù)的表達(dá)情況，可以用于桑樹(shù)抗逆性研究和轉(zhuǎn)基因育種。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為啟動(dòng)子序列產(chǎn)物電泳檢測(cè)示意圖；(A)為第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，其 中M :DNA分子標(biāo)記；1 :SP1與API為引物；2 :SP1與AP2為引物；3 :SP1與AP3為引物；4 : SP1與AP4為引物；(B)為第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，其中M :DNA分子標(biāo)記；1 :SP2與 API為引物；2 :SP2與AP2為引物；3 :SP2與AP3為引物；4 :SP2與AP4為引物；（C)為第三 輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，其中M :DNA分子標(biāo)記；1 :SP3與API為引物；2 :SP3與AP2為引 物；3 :SP3與AP3為引物；4 :SP3與AP4為引物；
[0022] 圖2為啟動(dòng)子序列分析結(jié)果示意圖；
[0023] 圖3為定量RT-PCR檢測(cè)MmPIP2啟動(dòng)子在鹽脅迫下桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量示意 圖；其中1.對(duì)照，2.鹽處理12小時(shí)，3.鹽處理1天，4.鹽處理2天，5.鹽處理3天，6.鹽 處理4天，7.鹽處理5天；
[0024] 圖4為定量RT-PCR檢測(cè)MmPIP2啟動(dòng)子在低溫脅迫下桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量 示意圖；其中1.對(duì)照，2.干旱處理2天，3.干旱處理4天，4.干旱處理6天，5.干旱處理8 天，6.干旱處理10天；
[0025] 圖5為定量RT-PCR檢測(cè)MmPIP2啟動(dòng)子在干旱脅迫下桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量示 意圖；其中1.對(duì)照，2.4°C處理1天，3.4°C處理2天，4.4°C處理3天，5.4°C處理4天，6.4°C 處理5天,7. 4°C處理6天；
[0026] 圖6為定量RT-PCR檢測(cè)MmPIP2啟動(dòng)子在抗病和感病桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量示 意圖；其中1.遼育8號(hào)，2.遼育166號(hào)，3.沂水黃魯頭，4.大黑桑，5.武二，6.綠椹子，7.小 紅點(diǎn)，8.吐白1號(hào)，9.多果桑，10.中陽(yáng)1號(hào)；
[0027] 圖7為定量RT-PCR檢測(cè)MmPIP2啟動(dòng)子在南北地區(qū)桑苗嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量示意 圖；其中1.遼35號(hào)，2.龍1，3.陜桑305,4.廣東桑2號(hào)，5.瓊雞桑，6.三亞9號(hào)。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0029] 實(shí)施例1桑樹(shù)MmPIP2基因啟動(dòng)子的克隆
[0030] 供試桑樹(shù)品種為保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹(shù)圃的 育71-1。根據(jù)已構(gòu)建桑樹(shù)幼葉cDNA文庫(kù)，選擇其中一條預(yù)測(cè)為水通道蛋白家族基 因的EST序列，設(shè)計(jì)引物克隆，并利用RACE技術(shù)獲得該基因的全長(zhǎng)，按照Clontech 公司的genome walker試劑盒說(shuō)明書要求利用已獲得的MmPIP2基因的全長(zhǎng)序列 設(shè)計(jì) 3 個(gè)特異性引物（SEQ ID NO. 2 :SP1 :5 ' -TGCGGCGTTCTGTTTCTTGTGG-3 '; SEQ ID NO. 3：SP2：5 ; -TCGGCGATCAGGGCTCTGTAGAAC-3 ; ；SEQ ID NO. 4 ：SP3 ： 5' -GCTCACTTCCTTCGACATCTCCT-3'設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，SP2的位置位 于SP1的內(nèi)側(cè)，SP3位于SP2的內(nèi)側(cè)）和試劑盒中提供的四種經(jīng)過(guò)獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低 的兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4為引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行膠回收后測(cè)序， 采用生物信息學(xué)為基礎(chǔ)的方法，運(yùn)用NCBI的Blast工具（http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST)進(jìn)行序列對(duì)比和分析，驗(yàn)證該基因。
[0031] 擴(kuò)增步驟如下：
[0032] (1)第一輪 PCR 反應(yīng)。
[0033] ①按下列組份配制第一輪PCR反應(yīng)液。
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，其特征在于為如下（1)、（2)或（3)所示： ⑴序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA片段； (2) 在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA片段； (3) 與（1)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且具有相同功能的DNA片段。
2. 擴(kuò)增權(quán)利要求1所述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子全長(zhǎng)或其任意片段的引 物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，其特征在于如SEQ ID NO. 2?4所示。
4. 含有權(quán)利要求1所述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。
5. 權(quán)利要求1所述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子在使目的基因在植物非生物 脅迫表達(dá)中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4中所述的應(yīng)用，其特征在于：所述非生物脅迫為低溫、干旱、模擬干 旱、和高鹽脅迫環(huán)境。
7. 權(quán)利要求1中所述桑樹(shù)非生物脅迫特異性表達(dá)的啟動(dòng)子在植物的遺傳育種中的應(yīng) 用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物為桑樹(shù)。
9. 一種使目的基因在植物非生物脅迫表達(dá)的試劑盒，其特征在于含有SEQ ID NO. 1所 示的DNA片段。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104250648SQ201410472985
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】趙衛(wèi)國(guó), 王恒, 李鳳, 錢姣, 方榮俊, 劉利 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)