一種快速檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏原的裝置及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速、方便、高效、定量檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏成分的檢測(cè)裝置及其制備方法，屬于熒光微球標(biāo)記的檢測(cè)技術(shù)。本發(fā)明包括標(biāo)記了特殊性質(zhì)的具有生物特異性的生物大分子，以具有吸附移動(dòng)性的聚合材料薄膜作載體，在便攜輕巧的方形設(shè)備內(nèi)進(jìn)行的檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是利用標(biāo)記物的特殊性質(zhì)對(duì)食品基質(zhì)中的含有的微量牛乳過(guò)敏原成分進(jìn)行檢測(cè)。這種特殊的標(biāo)記物克服了常見(jiàn)標(biāo)記物的不穩(wěn)定性，檢測(cè)值低的問(wèn)題。本發(fā)明主要應(yīng)用于食品安全中殘余牛乳致敏物的定量檢測(cè)方面。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全中食品中牛乳過(guò)敏原的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種定性和定量 快速地檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏原的熒光微球標(biāo)記的裝置及其制備方法。 一種快速檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏原的裝置及其制備方法

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，隨著人們的生活水平日漸提高，食品的安全問(wèn)題越來(lái)越突出，包括食物過(guò) 敏等。食物過(guò)敏是指機(jī)體對(duì)食品中的某種物質(zhì)或成分產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)，是一種由IgE 介導(dǎo)和非IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，可引起皮膚、腸胃道、呼吸系統(tǒng)的反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致 系統(tǒng)過(guò)敏反應(yīng)或休克。
[0003] 牛乳制品是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白制品，同時(shí)也是常見(jiàn)的八大過(guò)敏物質(zhì)之一，其致 敏性嚴(yán)重影響了嬰幼兒的身體健康。根據(jù)修訂后的2007/68/EC，歐盟法規(guī)規(guī)定在食品的生 產(chǎn)加工過(guò)程中，無(wú)論是可致敏的原料或添加劑，必須在食品標(biāo)簽上明確標(biāo)出這些物質(zhì)的成 分。據(jù)調(diào)查，在發(fā)達(dá)國(guó)家中，牛乳過(guò)敏占過(guò)敏事件的39Γ7. 5%，嚴(yán)重影響了嬰幼兒的健康，部 分甚至導(dǎo)致兒童死亡。而目前，對(duì)于食物過(guò)敏的最好最直接的辦法是嚴(yán)格避免食用含過(guò)敏 原的食物，但在食品的加工生產(chǎn)過(guò)程中，會(huì)摻雜著少量潛在的致敏物質(zhì)，所以，人們亟需研 究出能夠快速檢測(cè)食物中致敏物質(zhì)的方法，達(dá)到預(yù)防的目的。
[0004] 目前，有關(guān)過(guò)敏原的檢測(cè)手段包括主要包括基于免疫學(xué)的方法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 技術(shù)、毛細(xì)管電泳分析、色譜法、質(zhì)譜法等，這些檢測(cè)手法都比較繁瑣，且需要一定的設(shè)備儀 器和專業(yè)人才，不適用于食品的快速檢測(cè)判斷。隨著新技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，過(guò)敏原的檢測(cè)逐漸 向高靈敏度、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確性高方向發(fā)展。
[0005] 這種裝置是建立在免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它通常以 條狀纖維層析材料為固相，通過(guò)虹吸作用原理使樣品溶液在層析條上擴(kuò)撒，并同時(shí)使樣品 中的待測(cè)物與層析材料上針對(duì)待測(cè)物的受體發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中 免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過(guò)酶反應(yīng)或直接運(yùn)用可目測(cè)的標(biāo)記物 而得到直觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而游離標(biāo)記物則越過(guò)檢測(cè)帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離之目的。 這種技術(shù)目前常見(jiàn)的標(biāo)記粒子包括膠體金，乳膠，膠體硒、明膠等，其中運(yùn)用最多和成熟的 是月父體金。
[0006] 但是，膠體金標(biāo)記的裝置存在以下缺陷： (1)膠體金標(biāo)記過(guò)程是靜電吸附過(guò)程，是一種物理吸附，故在液相中穩(wěn)定性較差，往往 造成已標(biāo)記上的蛋白分子又再次脫落。
[0007] (2)結(jié)果通過(guò)顯示單一的紫紅色條帶來(lái)判斷，顏色單一，難以實(shí)現(xiàn)多檢和聯(lián)檢。
[0008] (3)只有當(dāng)金顆粒集聚到一定量時(shí)，人肉眼才能觀察到紫紅的條帶，且該顏色條帶 與背景對(duì)比度不大，從而限制了檢測(cè)靈敏度。
[0009] (4)不同的材料基質(zhì)效應(yīng)明顯，背景干擾非常大。
[0010] (5)檢測(cè)靈敏度較低。
[0011] (6)無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測(cè)。
[0012] 目前也出現(xiàn)了利用彩色乳膠等標(biāo)記的檢測(cè)方法，但是這些方法并不能完全實(shí)現(xiàn)對(duì) 檢測(cè)物的定量檢測(cè)。
[0013] 專利200910085054. 1公開(kāi)了一種采用熒光微球免疫層析檢測(cè)卡來(lái)同時(shí)檢測(cè)氯胺 酮與甲基苯丙胺，反應(yīng)靈敏度較膠體金法有很大提高，快速方便。
[0014] 專利200910117820. 8公開(kāi)了一種熒光微球免疫層析試紙條，改進(jìn)熒光微球的制 備方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。
[0015] 但是牛乳過(guò)敏原用常規(guī)的熒光微球免疫層析方法來(lái)定量檢測(cè)仍然難以達(dá)到靈敏 度、檢測(cè)穩(wěn)定性方面的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種針對(duì)牛乳過(guò)敏原的熒光微球免疫層析 裝置，簡(jiǎn)單快速、在定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)具有靈敏度高、穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一 個(gè)目的是提供上述裝置的制備方法。
[0017] 一種快速檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏原的裝置，包括用于檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的免疫層析試 紙條；所述免疫層析試紙條為粘性底板上依次搭接濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、NC膜和吸 水紙；所述玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體； 所述NC膜的檢測(cè)區(qū)噴涂牛乳過(guò)敏原；所述NC膜的質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG;所述所述熒 光微球是直徑為〇. 01?10 μ m的用聚合材料或二氧化硅包裹熒光物質(zhì)的微球，其表面連 接有活性基團(tuán)。
[0018] 所述的裝置，還包括底卡和面卡，免疫層析試紙條固定在底卡上，試紙條表面用面 卡壓緊；所述面卡上預(yù)留有加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與試紙條的樣本墊對(duì)應(yīng)，觀察窗 的位置與試紙條的NC膜對(duì)應(yīng)，所述底卡和面卡為塑料卡。
[0019] 所述聚合材料為聚苯乙烯、聚乙烯和聚氯乙烯，所述的活性基團(tuán)為一 CHO、-C00H、-OH、-NH2或-SH，所述熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián)釕有機(jī)染料、異硫氰根熒光素、異硫 氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、熒光烷衍生物類、1，8-萘二酰亞胺類、香豆素類有機(jī)熒 光染料或其摻雜物或量子點(diǎn)。
[0020] 所述牛乳過(guò)敏原用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為 1. 0 mg/mL，噴膜量為0· 80 μ L/cm ;所述羊抗兔IgG用0· 01?0· 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩 沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 〇 mg/mL，噴膜量為0. 80 μ L/cm。
[0021] 前述述的裝置的制備方法，包括如下步驟：（1) NC膜上檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備； (2)熒光微球墊的制備；（3)裝置組裝；所述的NC膜上檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備，包括所述 NC膜的檢測(cè)區(qū)噴涂牛乳過(guò)敏原，牛乳過(guò)敏原用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié) 至包被物濃度為1. 〇mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm ;所述NC膜的質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG， 羊抗兔IgG用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. Omg/mL，噴膜 量為0. 8 μ L/cm ;所述的熒光微球墊的制備，包括如下的步驟：（1)熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò) 敏原多克隆抗體的制備（2)將熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體噴涂在玻璃纖維膜上 制備熒光微球墊。所述的裝置組裝為在粘性底板上依次搭接濾紙、樣本墊、有熒光微球墊 的玻璃纖維膜、固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的NC膜、吸水紙制成免疫層析試紙條，并剪成合適 大??； 所述檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備方法如下：用BIODOT Dispensing System將牛乳過(guò)敏原和 羊抗兔IgG包被到NC膜上：分別用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)包被物濃度 為1. 0 mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm，檢測(cè)區(qū)上噴涂牛乳過(guò)敏原，質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG， 兩區(qū)相隔5 mm ;37°C烘干處理過(guò)夜后，室溫干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0022] 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗 體制備方法如下：取微球在1〇〇〇 Xg離心10?15 min，離心后收集沉淀，用0.01 M pH 4. 8 的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為0D45(I=0. 2,然后分別加入20?100 mg/mL對(duì)乙基-N，N-二 甲基丙基碳二亞胺EDC，和2?20 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺NHS，振蕩混勻，室溫孵育10? 30 min后，1000Xg離心5?15 min，沉淀用0.01 M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié) 微球濃度為〇D45(l為0. 2-1. 0,1 mL該熒光微球中加入100 μ g的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體，充 分混合后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h;超純水離心洗滌2?5次，沉淀用0.01 M pH 7. 2的磷酸鹽 緩沖液復(fù)溶沉淀至起始體積；用BI0D0T Dispensing System將標(biāo)記好的突光微球噴涂至玻 璃纖維膜上，25°C真空干燥1?2 h，置于室溫干燥的環(huán)境下備用。
[0023] 前述裝置定性檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的方法，包括如下步驟：a.在裝置的加樣孔上滴加 待測(cè)樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)裝置放入熒光分析儀檢測(cè)窗口；b.熒光微球在燈源激發(fā) 下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；c.當(dāng)樣本中不含有被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)兩條熒光 條帶，即檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別有一條熒光帶，則檢測(cè)樣本為陰性；當(dāng)待測(cè)樣本中含有過(guò)量的 被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)一條熒光條帶，即檢測(cè)區(qū)無(wú)熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條 熒光帶，則檢測(cè)樣本即為陽(yáng)性。
[0024] 前述裝置定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的方法，其特征在于包括如下步驟：在裝置加樣 孔上加入待測(cè)樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)裝置放入熒光分析儀檢測(cè)窗口；截留在檢測(cè)區(qū) 和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；發(fā)射的熒光經(jīng)CCD掃描系統(tǒng)匯 聚后，經(jīng)過(guò)光電聚集管，送入光電倍增管，光信號(hào)得到增強(qiáng)，再經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，軟件處理 后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低在顯示器上顯示；以不同已知濃度的待測(cè)牛乳過(guò)敏原作檢 測(cè)，獲得一系列數(shù)值后，繪制待檢測(cè)牛乳過(guò)敏原濃度與熒光強(qiáng)弱數(shù)值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；根 據(jù)檢測(cè)樣本的顯示數(shù)值，以及上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測(cè)樣本中牛乳過(guò)敏原的濃度。
[0025] 圖2是定性和定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的熒光微球標(biāo)記的裝置的檢測(cè)原理圖； 圖3是一種簡(jiǎn)易熒光檢測(cè)儀的檢測(cè)原理及其結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明制備的熒光微球使用壽命長(zhǎng)，易于制造，制備穩(wěn)定且具有良好的單分散性，與 牛乳過(guò)敏原多克隆抗體穩(wěn)固結(jié)合，制備的熒光微球抗體熒光量等非常適宜于牛乳過(guò)敏原的 檢測(cè)。
[0027] 2)本發(fā)明技術(shù)方案針對(duì)牛乳過(guò)敏原本身的特性，經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)得出熒光標(biāo)記抗 體噴涂量、質(zhì)控線上羊抗兔IgG、檢測(cè)線牛乳過(guò)敏原噴涂量，能靈敏地定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原。
[0028] 3)本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確地對(duì)食品中的牛乳過(guò)敏原實(shí)現(xiàn)定性和定量檢測(cè)。
[0029] 4)通過(guò)C⑶掃描技術(shù)把過(guò)濾后的發(fā)射光譜收集后，再發(fā)送到熒光分析檢測(cè)儀以及 經(jīng)過(guò)軟件處理，把熒光信號(hào)數(shù)值化，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0030] 5)不同粒徑和種類的量子點(diǎn)在相同的激發(fā)光譜下，能夠發(fā)出多種顏色的條帶；不同 無(wú)機(jī)或者有機(jī)熒光染料按照不同比例摻混時(shí)能夠發(fā)射不同的顏色，從而實(shí)現(xiàn)多檢和聯(lián)檢。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1是檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的熒光微球標(biāo)記的裝置的結(jié)構(gòu)圖； 圖2是定性和定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的熒光微球標(biāo)記的裝置的檢測(cè)原理圖； 圖3是一種簡(jiǎn)易熒光檢測(cè)儀的檢測(cè)原理及其結(jié)構(gòu)示意圖。
[0032] 如圖1所示，該熒光微球免疫層析裝置的構(gòu)成為：在粘性底板18上，依次搭接地粘 貼濾紙11、樣本墊12、噴涂有熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體的玻璃纖維膜13、包 被有牛乳過(guò)敏原的檢測(cè)區(qū)15和包被有羊抗兔IgG的質(zhì)控區(qū)16的NC膜14和吸水紙17。質(zhì) 控區(qū)距吸水紙2 _，質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)間隔5 mm。
[0033] 如圖1和2所示，檢測(cè)原理如下：在樣本墊12上滴加樣品，檢測(cè)裝置放入檢測(cè)窗口 41 ;當(dāng)檢測(cè)樣本中不包含待檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，待測(cè)物與標(biāo)記的抗體結(jié)合，在毛細(xì)作用下， 與檢測(cè)線上包被的抗原發(fā)生特異性的結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，多余的熒光標(biāo)記復(fù)合物繼續(xù) 流動(dòng)與質(zhì)控線上的羊抗兔IgG結(jié)合，固定在質(zhì)控線上，在簡(jiǎn)易熒光檢測(cè)儀上可觀察到，檢測(cè) 區(qū)和質(zhì)控區(qū)能看到兩條清晰的熒光條帶；當(dāng)檢測(cè)樣品中含有待檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，待測(cè)物 與標(biāo)記的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，而不與檢測(cè)線上的抗原發(fā)生結(jié)合，在毛細(xì)作用下，而只與質(zhì) 控區(qū)16上的羊抗兔IgG特異性結(jié)合，待檢樣本43在光源42激發(fā)下，發(fā)射的熒光44通過(guò)單 色光濾光片35過(guò)濾后，通過(guò)觀察窗口 36在質(zhì)控區(qū)16能夠觀察到一條清晰的熒光條帶檢測(cè) 區(qū)15無(wú)熒光條帶。所以在簡(jiǎn)易熒光檢測(cè)儀上觀察到，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)只能看到一條清晰的 熒光條帶。用熒光分析儀檢測(cè)檢測(cè)帶與質(zhì)控帶的熒光強(qiáng)度，其中檢測(cè)帶的熒光強(qiáng)度與待測(cè) 物濃度成反比。
[0034] 如圖3所示，用熒光微球標(biāo)記的裝置定性檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的檢測(cè)步驟如下：
[1] 在裝置上加入樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)裝置放入檢測(cè)窗口 41 ;
[2] 熒光微球43在燈源42激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；
[3] 當(dāng)樣本中不含有被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)兩條熒光條帶，即檢測(cè)樣本 為陰性；當(dāng)樣本中含有過(guò)量的被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)一條熒光條帶，檢測(cè)樣 本即為陽(yáng)性。
[0035] 如圖3所示，用熒光微球標(biāo)記的裝置定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的檢測(cè)步驟如下： ⑴在樣本墊上滴加樣品，反應(yīng)10 min后，檢測(cè)裝置放入檢測(cè)窗口 41 ; ⑵檢測(cè)區(qū)或質(zhì)控區(qū)被截留的熒光微球43在光源42激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶； ⑶發(fā)射的熒光44經(jīng)C⑶掃描系統(tǒng)45匯聚后，經(jīng)過(guò)光電聚集管46,送入光電倍增管47， 光信號(hào)得到增強(qiáng)，再經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換元件48,經(jīng)過(guò)軟件處理49后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低 在數(shù)據(jù)輸出410的顯示器上顯示出來(lái)； ⑷檢測(cè)過(guò)程中，以不同已知濃度的被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原作檢測(cè)，獲得一系列數(shù)值后，繪制 被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原濃度與熒光強(qiáng)弱數(shù)值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)據(jù)輸出 410的數(shù)值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得出檢測(cè)樣本中牛乳過(guò)敏原的濃度。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例一 一、熒光標(biāo)記裝置的組裝； 1.NC膜的制備： 檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備：用0. 05 M pH 7. 2的PBS(其中包含5%蔗糖和0. 05%Tween-20) 調(diào)節(jié)牛乳過(guò)敏原的濃度為1.0 mg/mL，所得的溶液噴涂在膜上的檢測(cè)區(qū)，用0.01 M pH 7. 2 的PBS (其中包含5%蔗糖和0. 05%Tween-20)調(diào)節(jié)羊抗兔IgG的濃度為1. 0 mg/mL，所得的 溶液噴涂在膜上的質(zhì)控區(qū)，兩區(qū)的噴膜量均為0.8 μ L/cm，兩區(qū)位置相隔5 mm，質(zhì)控區(qū)距NC 膜一端2 mm，37°C烘干處理過(guò)夜后，于干燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0037] 2.熒光微球墊的制備： 熒光微球標(biāo)記牛乳過(guò)敏原多克隆抗體的制備：取1 mg包裹有菲咯啉聯(lián)釕染料的市售 熒光微球（0.01?10 μπι)(購(gòu)自默克公司）在lOOOXg離心15 min，離心后收集沉淀，用 0. 01M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為0D45(I=0. 2。然后分別加入90 μ L的50 mg/mL 對(duì)乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺EDC，和150 μ L的5 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺NHS，振 蕩混勻，室溫孵育15 min后，lOOOXg離心15 min，沉淀用0. 01M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液 溶解，調(diào)節(jié)微球濃度〇D45(l為0. 5。向0. 1 mL熒光微球中加入10 μ g的牛乳過(guò)敏原多克隆 抗體，充分混合后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3 h，超純水離心洗滌3次后，沉淀用0.01 M pH 7.2的PBS (其中包含5 %鹿糖和0.05 % Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，用BI0D0T Dispensing System,按照4 μ L/cm的量噴涂至玻璃纖維膜（30X0. 8 cm)上，25?真空干燥2 h，放于 干燥環(huán)境備用。
[0038] 3.組裝裝置： 在PVC塑料底板上依次搭接地粘貼：（1)濾紙和樣本墊，樣本墊為一種經(jīng)過(guò)5 % Tween-20處理的玻璃纖維膜；（2)噴涂有熒光微球標(biāo)記牛乳過(guò)敏原多克隆抗體的熒光微球 墊；（3)有牛乳過(guò)敏原作為檢測(cè)區(qū)和有羊抗兔IgG作為質(zhì)控區(qū)的NC膜；（4)吸水紙。切割 組裝好后，放到準(zhǔn)備好的裝置盒中，裝入鋁箔袋，加入干燥劑后，封口保存，于室溫干燥的環(huán) 境下至少可保存一年。
[0039] 二、定性和定量檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏原； 1.定性檢測(cè)：秤取2g粉狀樣品（若不是，需要先研磨），加入18ml的碳酸鹽緩沖液，渦 旋lmin，4°C下離心15min，吸取50μ L上清液加入樣本墊上進(jìn)行檢測(cè)，十分鐘后，將檢測(cè)裝 置放入簡(jiǎn)易熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)窗口內(nèi)，熒光微球在LED燈源激發(fā)下，發(fā)射特定顏色的熒光， 經(jīng)過(guò)單色濾光片過(guò)濾后，選擇只能透過(guò)紅色光的濾光片，從觀察窗口觀察，在簡(jiǎn)易熒光檢測(cè) 儀上觀察到只有質(zhì)控區(qū)有一條清晰的紅色熒光條帶。說(shuō)明檢測(cè)樣本中含有牛乳過(guò)敏原。
[0040] 2.定量檢測(cè)： (1) 在裝置的樣本墊上加入樣本，反應(yīng)10 min后，檢測(cè)裝置放入檢測(cè)窗口； (2) 熒光微球在LED燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光； ⑶發(fā)射的熒光經(jīng)C⑶掃描系統(tǒng)匯聚后，經(jīng)過(guò)光電聚集管，送入光電倍增管，光信號(hào)得 到增強(qiáng)，在經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換元件，經(jīng)過(guò)軟件處理后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低在數(shù)據(jù)輸出410 的顯示器上顯示出來(lái)。
[0041] (4)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將含牛乳過(guò)敏原的標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度，測(cè)出其對(duì)應(yīng)的熒光 強(qiáng)度的數(shù)值，從而根據(jù)這一系列數(shù)值與對(duì)應(yīng)濃度建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣本經(jīng)過(guò)前處理后，吸 取50μ L懸液，進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，在0. 5~200ng/ml的范圍內(nèi)具 有很好的線性關(guān)系，檢測(cè)限值可達(dá)到〇. lng/ml，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù)CV〈5%，穩(wěn)定性好。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測(cè)食品中牛乳過(guò)敏原的裝置，其特征在于包括用于檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的免 疫層析試紙條；所述免疫層析試紙條為粘性底板上依次搭接濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、 NC膜和吸水紙；所述玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球墊為熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克 隆抗體；所述NC膜的檢測(cè)區(qū)噴涂牛乳過(guò)敏原；所述NC膜的質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG ; 所述所述熒光微球是直徑為〇. 01?10 μ m的用聚合材料或二氧化硅包裹熒光物質(zhì)的微 球，其表面連接有活性基團(tuán)。
2. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于還包括底卡和面卡，免疫層析試紙條固定在 底卡上，試紙條表面用面卡壓緊；所述面卡上預(yù)留有加樣孔和觀察窗，加樣孔的位置與試紙 條的樣本墊對(duì)應(yīng)，觀察窗的位置與試紙條的NC膜對(duì)應(yīng)，所述底卡和面卡為塑料卡。
3. 如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于所述聚合材料為聚苯乙烯、聚乙烯和聚氯乙 烯，所述的活性基團(tuán)為一 CHO、-COOH、-OH、-NH2或-SH，所述熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián)釕有機(jī)染 料、異硫氰根熒光素、異硫氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、熒光烷衍生物類、1，8-萘二 酰亞胺類、香豆素類有機(jī)熒光染料或其摻雜物或量子點(diǎn)；所述牛乳過(guò)敏原用〇. 01?〇. 1 Μ pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 0 mg/mL，噴膜量為0. 80 μ L/cm ;所述羊抗 兔IgG用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1. 0 mg/mL，噴膜量為 0·80 μ L/cm。
4. 權(quán)利要求1所述的裝置的制備方法，其特征在于包括如下步驟：（1) NC膜上檢測(cè) 區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備；（2)熒光微球墊的制備；（3)裝置組裝；所述的NC膜上檢測(cè)區(qū)和質(zhì) 控區(qū)的制備，包括所述NC膜的檢測(cè)區(qū)噴涂牛乳過(guò)敏原，牛乳過(guò)敏原用0.01?0.1 M pH 7. 2 的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度為1 mg/mL，噴膜量為0. 8 μ L/cm ;所述NC膜的質(zhì)控區(qū) 上噴涂羊抗兔IgG，羊抗兔IgG用0. 01?0. 1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至包被物濃度 為lmg/mL，噴膜量為0.8 μ L/cm;所述的熒光微球墊的制備，包括如下的步驟：（1)熒光微 球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體的制備（2)將熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體噴涂 在玻璃纖維膜上制備熒光微球墊；所述的裝置組裝為在粘性底板上依次搭接濾紙、樣本 墊、有熒光微球墊的玻璃纖維膜、固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的NC膜、吸水紙制成免疫層析試 紙條，并剪成合適大小。
5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備方法如下： 用BIODOT Dispensing System將牛乳過(guò)敏原和羊抗兔IgG包被到NC膜上：分別用0. 01? 0.1 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)包被物濃度為1 mg/mL，噴膜量為0.8 μ L/cm，檢測(cè)區(qū)上 噴涂牛乳過(guò)敏原，質(zhì)控區(qū)上噴涂羊抗兔IgG，兩區(qū)相隔5 mm ;37°C烘干處理過(guò)夜后，室溫干 燥的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> 6. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于熒光微球標(biāo)記的牛乳過(guò)敏原多克隆抗體 制備方法如下：取微球在1000 Xg離心10?15 min，離心后收集沉淀，用0.01 M pH 4. 8的 硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為0D45(I=0. 2,然后分別加入20?100 mg/mL對(duì)乙基-N，N-二甲 基丙基碳二亞胺EDC，和2?20 mg/mL N-羥基丁二酰亞胺NHS，振蕩混勻，室溫孵育10? 30 min后，1000Xg離心5?15 min，沉淀用0.01 M pH 4. 8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào) 節(jié)微球濃度為〇D45(l為0. 2-1. 0,1 mL該熒光微球中加入0. 1?100 μ g的牛乳過(guò)敏原多克 隆抗體，充分混合后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1?4 h ;超純水離心洗滌2?5次，沉淀用0. 01 M pH 7. 2的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶沉淀至起始體積；用BIODOT Dispensing System將標(biāo)記好的突光 微球噴涂至玻璃纖維膜上，25°C真空干燥1?2 h，置于室溫干燥的環(huán)境下備用。
7. 用權(quán)利要求1~4任一所述裝置定性檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的方法，其特征在于包括如下步 驟：a.在裝置的加樣孔上滴加待測(cè)樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)裝置放入熒光分析儀檢測(cè) 窗口；b.熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光；c.當(dāng)樣本中不含有被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原 時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)兩條熒光條帶，即檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別有一條熒光帶，則檢測(cè)樣本為陰 性；當(dāng)待測(cè)樣本中含有過(guò)量的被檢測(cè)牛乳過(guò)敏原時(shí)，觀察窗內(nèi)只出現(xiàn)一條熒光條帶，即檢測(cè) 區(qū)無(wú)熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光帶，則檢測(cè)樣本即為陽(yáng)性。
8. 用權(quán)利要求1~3任一所述裝置定量檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的方法，其特征在于包括如下 步驟：在裝置加樣孔上加入待測(cè)樣本，反應(yīng)10 min后，將檢測(cè)裝置放入熒光分析儀檢測(cè)窗 口；截留在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在燈源激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；發(fā)射的熒 光經(jīng)CCD掃描系統(tǒng)匯聚后，經(jīng)過(guò)光電聚集管，送入光電倍增管，光信號(hào)得到增強(qiáng)，再經(jīng)過(guò)信 號(hào)轉(zhuǎn)換元件，軟件處理后，熒光的強(qiáng)弱以數(shù)值的高低在顯示器上顯示；以不同已知濃度的 待測(cè)牛乳過(guò)敏原作檢測(cè)，獲得一系列數(shù)值后，繪制待檢測(cè)牛乳過(guò)敏原濃度與熒光強(qiáng)弱數(shù)值 關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)檢測(cè)樣本的顯示數(shù)值，以及上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測(cè)樣本中牛乳過(guò) 敏原的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK104101703SQ201310124277
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月11日
【發(fā)明者】賴衛(wèi)華, 倪小琴, 劉道峰, 山珊, 彭濤 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)