專利名稱：一種檢測花生過敏成分Arah1的雙抗體夾心ELISA方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測花生過敏成分Arahl方法的建立，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，食物過敏已成為ー個公眾性的食品安全問題，而花生是最常見的八大食品過敏原之一。過敏疾病嚴(yán)重危害人們的身體健康，雖然激發(fā)過敏反應(yīng)的最低過敏原的量隨著人群的不同而不同，但是微量的過敏原就可以使絕大部分患者產(chǎn)生過敏癥狀。為了避免接觸微量的過敏原，過敏原的檢測成為當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)在，雖然有許多過敏原檢測方法可供借鑒，但在具體應(yīng)用上都存在著各自不同的問題。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法可提供最為直接的證據(jù)，但由于安全因素等方面的考慮，只有在不得已的情況下在醫(yī)院進(jìn)行，而且費(fèi)用昂貴、風(fēng)險大；與此相比體外實(shí)驗(yàn)方法具有方便、安全點(diǎn)，但卻存在著準(zhǔn)確性差的缺點(diǎn)。目前體外微量的檢測方法有免疫法、PCR法、組胺釋放實(shí)驗(yàn)法、過敏原指紋快速檢測法等。雖然目前有關(guān)過敏原檢測的方法很多，但都存在各自不同的問題，如檢測速度慢、成本高、需要特定的分析儀器等，這些制約了食品中過敏原檢測方法的發(fā)展。因此實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、安全、經(jīng)濟(jì)、快速、高通量、高靈敏的體外檢測技術(shù)方法具有現(xiàn)實(shí)意義。雙抗體夾心法是檢測抗原的最常用方法，操作步驟如下
1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)接，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)；
2)加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗體抗原復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合的抗原物質(zhì)；
3)加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相抗體抗原復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時，固相載體上帯有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)；
4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于建立一種可以直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA方法。用于檢測花生過敏成分Arahl。本發(fā)明所說的雙抗體夾心ELISA檢測花生過敏成分Arahl方法，是鼠抗花生過敏成分Arahl單克隆抗體作為ー抗包被,與其配對成功的鼠抗花生過敏成分Arahl單克隆抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記后作為ニ抗，夾心法檢測花生過敏成分Arahl。本發(fā)明方法中所說的鼠抗花生過敏成分Arahl單克隆抗體，其制備方法是雜交瘤的準(zhǔn)備，篩選出針對花生過敏成分Arahl的強(qiáng)陽性細(xì)胞株14株用于免疫BALB/c小鼠，收集該免疫小鼠的腹水，進(jìn)行脫脂純化酶標(biāo)，將此14株細(xì)胞株進(jìn)行配對篩選，得到配對成功即兩株能檢測針對花生過敏成分Arahl的細(xì)胞株。本發(fā)明方法的檢測分析原理是利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在本方法可檢測范圍內(nèi))。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。本發(fā)明的技術(shù)方案ー種花生過敏成分Arahl的雙抗體夾心ELISA方法，
(O酶標(biāo)板的制備所用的包被原是鼠抗Arahl單克隆抗體，所用包被緩沖液是O. 05Μ、pH9. 6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含O. I %明膠的上述包被緩沖液；
其中，鼠抗Arahl單克隆抗體是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制備；
(2)酶標(biāo)ニ抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記與一抗配對成功的鼠抗Arahl單克隆抗體；
(3)洗滌液PBST的配方為1000mL蒸餾水中加入氯化鈉8 g、磷酸ニ氫鉀O. 2g、磷酸氫ニ鈉2. 9 g、氯化鉀O. 2 g、吐溫-20 O. 5mL。
(4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配方為在含30%體積甲醇的pH 6. 5的PBS中加入質(zhì)量比為5%的氯化鈉；
(5)顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入O. 933 g檸檬酸，3. 68 gNa2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202 ；Β液配方為60 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100 mLこニ醇，使用時按A : B=I : I體積比使用；
(6)終止液為2mol/L的硫酸；
檢測步驟為
1)以鼠抗Arahl單克隆抗體anti-ArahI-NO. 8作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，以O(shè). 05 Μ、ρΗ 9. 6的碳酸鈉緩沖液為包被緩沖液，37°C孵育2h ；
2)洗板包被后,將酶標(biāo)板內(nèi)容溶液洗掉,拍干,每孔加220μ L洗滌液，放搖床上振動3min，倒掉拍干，再加洗液反復(fù)洗板三次；
3)封閉將板拍干后，每孔22(^し封閉液，37で孵育2h，洗板三次拍干，置37°C烘箱15min烘干備用；
4)加受檢標(biāo)本，以NaCl含量為O.9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液稀釋，IOOul/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗板拍干；
5)加酶標(biāo)鼠抗Arahl單克隆抗體HRP-anti-Arahl_NO.5作為檢測抗體，以含O. 1%明膠的PBST為抗體稀釋液，IOOul/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗滌拍干；
6)顯色姆孔加入100yL顯色液,暗處37 °C反應(yīng)15 min,取出后姆孔加入100 μ L終止液，用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)伽。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了一種可以直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA方法，用于檢測花生過敏成分Arahl。


圖I Arahl雙抗體夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方案以下通過實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明。一、儀器
TGL 一 40Β臺式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠KFLOff純水機(jī)，凱佛隆公司
ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠
Costar96孔8X 12可拆酶標(biāo)板,上海吉泰生物科技有限公司
MuLtiska Mks 酶標(biāo)儀，Thermo Labsystems 公司
可調(diào)試移液器，Thermo Labsystems公司
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠
AKTA purifierlO自動快速蛋白純化系統(tǒng)，superdex 7510/300 GL凝膠過濾柱 GEhealth life sciences 公ロ]
垂直電泳儀Bio-rad公司 倒置生物顯微鏡德國萊卡公司 ニ、試劑
辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (HRP - IgG)，康成生物工程公司 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，華美生物工程公司 Arahl標(biāo)品，Indoor公司 其他試劑均為分析純試劑
三、步驟
I、花生過敏原的提取與純化
a、將新鮮花生仁去皮，研磨粉碎。稱取10g，按1:10 (W/V)浸入石油醚(60 90)中4°C脫脂，磁力攪拌下過夜，靜置0. 5h,8000r離心20min，棄上清，反復(fù)脫取三次，沉淀用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干。b、隨即按1:20 (W/V)浸入0. 05M、pH 7.4 PBS中浸提，磁力攪拌4h，靜置0. 5h，8000r離心20min,去殘洛,取上清。C、在b所得上清中緩慢加入硫酸銨固體，邊加邊攪拌，加入的完全溶解后才繼續(xù)往后加，直至飽和度為30%，4°C靜置0. 5h，8000 r/min離心20 min，沉淀用所述PBS復(fù)溶。繼續(xù)往上清液中加硫酸銨同理得到60%、80%飽和度組分。上述分級組分分別裝入透析袋中，在 0.05M、pH 7. 4 PBS 中透析 24h。d、上述三個分級組分分別用紫外測定其蛋白含量，然后用SDS-PAGE鑒定各組分蛋白成分。e,通過SDS-PAGE鑒定后，挑選含有Arahl較多的硫酸銨沉淀組進(jìn)行凝膠過濾層析。層析柱為superdex 7510/300 GL凝膠過濾柱，層析條件洗脫液為0. 05M、pH 7.4 PBS,流速為0. 35mL/min, 280nm紫外吸收監(jiān)測。收集所需出峰樣品，超純水透析24h即得含Arahl純度較高的花生蛋白。2、單抗的準(zhǔn)備
用上述得到的Arahl純度較高的蛋白免疫小鼠，挑選效價最高的小鼠進(jìn)行沖刺免疫，沖免三天后取其脾臟中脾細(xì)胞與SP2/0骨髄瘤細(xì)胞融合，融合后篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞并及時進(jìn)行亞克隆，經(jīng)多次亞克隆后，挑選到14顆強(qiáng)陽性的純細(xì)胞株。將這14株細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，將收集的細(xì)胞腹腔注射到已打石蠟油的BALB/c小鼠體內(nèi)，待小鼠腹部明顯變大且行動遲緩時抽取腹水，5000r/min、IOmin后收集中層澄清腹水。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法分·別純化收集到的14類腹水，并記為anti-Arah I-NO. f 14。
3、配對篩選
采用過碘酸鈉法對純化后的抗體anti-Arah I-NO. Γ 4進(jìn)行HRP標(biāo)記，并用直接ELISA法鑒定HRP標(biāo)記抗體是否成功。利用兩種單抗進(jìn)行雙抗體夾心法ELISA法檢測過敏原吋，必須是針對不同抗原表位的兩種單抗才能成功，而所針對的兩個抗原表位的空間位置也是雙抗體夾心法ELISA法效果好壞的關(guān)鍵。以制備的anti-Arah I-NO. 1 14這14種單抗中的任意一種稀釋1000倍包被酶標(biāo)板，然后封閉，封閉后加入Arahl標(biāo)準(zhǔn)品溶液，設(shè)置陽性對照(P，100ng/mL的Arahl標(biāo)準(zhǔn)品溶液)和陰性對照(N,0ng/mL的Arahl標(biāo)準(zhǔn)品溶液),待標(biāo)準(zhǔn)品與包被抗體反應(yīng)后,カロ入除包被的單抗外的13種HRP標(biāo)記的抗Arahl單抗(稀釋1000倍)，顯色終止、檢測后，選擇P/N值最大者的組合為最優(yōu)組合。4、ELISA方法條件的優(yōu)化
通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立了 Arahl雙抗體夾心ELISA檢測方法，最終確定的工作條件為以anti-Arah I-NO. 8為捕獲抗體，稀釋1600倍包被酶標(biāo)板；以HRP-anti-Arahl_NO. 5為檢測抗體，工作濃度為800倍稀釋；包被液采用0.05 M、pH 9.6的碳酸鈉緩沖液；封閉液為含O. 1%明膠的包被液；以NaCl含量為O. 9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液作為樣品稀釋液，含O. 1%明膠的PBST為酶標(biāo)抗體稀釋液。5、ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
根據(jù)優(yōu)化的ELISA條件，建立Arahl標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制成一系列的Arahl標(biāo)準(zhǔn)溶液1200ng/mL>600ng/mL>300ng/mL>150ng/mL>75ng/mL,37 ng/mL,18 ng/mL,9 ng/mL,4. 5 ng/mL, 2. 3 ng/mL, I. I ng/mL, 0. 5 ng/mL 12個濃度梯度，姆個濃度做3個重復(fù),零孔做6個重復(fù)。以標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)繪制曲線。根據(jù)繪制的曲線選取最佳的線性范圍，最低檢測限(LOD)為零孔加3倍標(biāo)準(zhǔn)差所對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度值。本實(shí)驗(yàn)建立的Arahl雙抗體夾心ELISA檢測方法檢測限達(dá)到O. 42ng/mL,線性范圍是為O. 8 100 μ g/mL。具體見附圖I。6、ELISA檢測方法評估
I)將純牛奶稀釋五倍，分別添加Arahl標(biāo)準(zhǔn)品至濃度為Ing/mL, 5ng/mL, 30 ng/mL, 60ng/mL，每個濃度做6次測定平均值，做5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I。表I Arahl雙抗體夾心ELISA精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度驗(yàn)證
批間(n=6)批次(n=6)
添加量(ng/ml) 檢測值士SD(ng/ml)回收率(％) 檢測值士 SD(ng/ml)回收率(％)
6070. 51±5.879117:69.00±6.79114.9
3030·80±3·149102:29·06±3·7998.28
54·673±0·27993.9:5·207±0·289103.54
I[1.403 + 0.066]139.2jl.289±0.210[^128.93
由表I可知，在批間實(shí)驗(yàn)中，回收率在93. 9 139. 2之間，變異系數(shù)在4. 68% 10. 32%之間，在批次實(shí)驗(yàn)中，回收率在98. 28 128. 9之間，變異系數(shù)在6. 989Γ12. 30%之間，所以建立的Arahl雙抗體夾心ELISA檢測方法精密度高、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度好。2)實(shí)際樣品檢測從本地超市選購10種包裝食品，按建立的ELISA方法進(jìn)行Arahl實(shí)際樣品檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果進(jìn)行分析，檢測結(jié)果如表2所示
表2樣品檢測結(jié)果分析權(quán)利要求
1.一種撿測花生過敏成分Arahl的雙抗體夾心ELISA方法,其特征在于 (O酶標(biāo)板的制備所用的包被原是鼠抗Arahl單克隆抗體，所用包被緩沖液是O. 05Μ、pH9. 6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含O. I %明膠的上述包被緩沖液； 其中，鼠抗Arahl單克隆抗體是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制備； (2)酶標(biāo)ニ抗是辣根過氧化物酶標(biāo)記與一抗配對成功的鼠抗Arahl單克隆抗體； (3)洗滌液PBST的配方為1000mL蒸餾水中加入氯化鈉8 g、磷酸ニ氫鉀O. 2g、磷酸氫ニ鈉2. 9 g、氯化鉀O. 2 g、吐溫-20 O. 5mL ； (4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配方為在含30%體積甲醇的pH6. 5的PBS中加入質(zhì)量比為5%的氯化鈉； (5)顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入O. 933 g檸檬酸，3. 68 gNa2HPO4 · 12H20,18 μ L 30%Η202 ；Β液配方為60 mg四甲基聯(lián)苯胺溶于100 mLこニ醇，使用時按A : B=I : I體積比使用； (6)終止液為2mo I/L的硫酸； 檢測步驟為 1)以鼠抗Arahl單克隆抗體anti-ArahI-NO. 8作為捕獲抗體包被酶標(biāo)板，100 μ L/孔，以O(shè). 05 Μ、ρΗ 9. 6的碳酸鈉緩沖液為包被緩沖液，37°C孵育2h ； 2)洗板包被后,將酶標(biāo)板內(nèi)容溶液洗掉,拍干,每孔加220μ L洗滌液，放搖床上振動3min，倒掉拍干，再加洗液反復(fù)洗板三次； 3)封閉將板拍干后，每孔22(^し封閉液，37で孵育2h，洗板三次拍干，置37°C烘箱15min烘干備用； 4)加受檢標(biāo)本，以NaCl含量為O.9%的O. OlM pH 7. 4的PBS溶液稀釋，100 μ L/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗板拍干； 5)加酶標(biāo)鼠抗Arahl單克隆抗體HRP-anti-Arahl_NO.5作為檢測抗體，以含O. 1%明膠的PBST為抗體稀釋液，100 μ L/孔，37°C孵育O. 5h，同法洗滌拍干； 6)顯色姆孔加入100yL顯色液,暗處37 °C反應(yīng)15 min,取出后姆孔加入100 μ L終止液，用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)45tlt全文摘要
一種檢測花生過敏成分Arah1的雙抗體夾心ELISA方法，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先從新鮮花生仁中獲取含Arah1純度較高的花生蛋白，用其免疫小鼠獲得14株單抗，從中選擇P/N值最大者的組合為最優(yōu)組合。利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。本發(fā)明直接、快速、高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡單的雙抗體夾心ELISA法，檢測花生過敏成分Arah1。
文檔編號G01N33/577GK102680696SQ201210187068
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者匡華, 宋珊珊, 尹玉云, 彭娟, 朱建平, 王利兵, 王文彬, 胥傳來 申請人:江南大學(xué)