專利名稱：一種運用熒光pcr技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于過敏原檢測技術(shù)，具體地說是運用熒光PCR反應來檢測過敏原的技術(shù)， 特別是食品中過敏原杏仁成分的方法。
背景技術(shù)：
食物過敏是人們對食物產(chǎn)生的一種不良反應，屬于機體對外源性物質(zhì)的一種變態(tài)反應。 近二十年來，食物過敏逐漸被重視，已被認為是嚴重的公共衛(wèi)生問題，而且WHO預測食物 過敏可能成為今后最常見的流行病之一。根據(jù)美國FDA資料統(tǒng)計，在美國，2%的成年人和 5%的嬰幼兒患有食物過敏癥，每年大約30000人需要臨床緊急治療，150人死于食物引起的 過敏反應。在所有過敏反應中，花生和樹堅果過敏占10-47%。
FDA于2005年10月5日發(fā)布《食品過敏原標識和消費者保護法案一2004》(FALCPA)， 規(guī)定主要食物過敏原包括樹堅果等八種食物的成分。日本標簽標注也要求將樹堅果列為推薦 標注成分。據(jù)國外有關(guān)學者應用ELISA方法結(jié)合PCR—ELISA法對商品進行調(diào)査，在35種 市售商品中就有7種含有過敏原杏仁成分而未在標簽中標識。
目前國內(nèi)外對過敏原杏仁成分的檢測研究主要集中在ELISA、 PCR—ELISA、 PCR、熒 光PCR及生物傳感器檢測等方面。目前對于過敏原的檢測方法FDA和AOAC共同研究推薦 使用的試劑盒有三種，均為ELISA方法。但如果產(chǎn)品中蛋白質(zhì)遭到破壞，ELISA方法就檢測 不到。而DNA比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，PCR方法較ELISA方法更為準確，并且避免了對大量抗體的 需求，歐盟、日本和AOAC都建議使用PCR方法進行確證，但沒有明確特異性的引物序列。
由于杏仁于蘋果、梨等同屬薔薇科植物，其主要過敏原蛋白基因序列具有高度的同源性， 本研究針對杏仁成分Pru du 1. 06BDNA序列設計引物及TaqMan探針，建立了運用熒光PCR 技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中 過敏原杏仁成分的方法，具體的講就是，外切酶探針熒光PCR技術(shù)(Taqman探針法)檢測 食品中過敏原杏仁成分的方法。
其技術(shù)內(nèi)容包括使用該方法所使用的引物、探針及構(gòu)建的報告質(zhì)粒。其中引物、探針 的全部序列如下
引物
所用弓1物序列一 TTTGGTTGAAGGAGATGCTC 所用引物序列二 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG 探針
所用探針序列TCCATCAGCAGATGCCACCAAC
以及由上述序列衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義 互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。還包括與之配套的熒光PCR反應條件。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的-
(1) 設計特異性寡核苷酸引物、探針，將探針法探針序列三用FAM熒光基團標記，用 于外切酶探針熒光PCR技術(shù)檢測；
(2) 以探針法引物序列一和探針法引物序列二作為引物，以食品中過敏原杏仁成分的相 關(guān)基因DNA為模板，進行目的基因的特異性擴增；
(3) 擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過 配套軟件進行分析可以觀察到對食品中過敏原杏仁成分進行特異性擴增產(chǎn)生的特定波長的 FAM熒光信號，則證明待測樣品中存在食品中過敏原杏仁成分；如沒有觀察到任何一種熒光 信號則證明待測樣品中不存在食品中過敏原杏仁成分。
本研究所建立的熒光PCR方法，與堅果類如花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果，水 果類如蘋果、梨、楊梅、李子等沒有交叉反應，具有很好的特異性，檢測靈敏度可達到5 mg/kg。
本發(fā)明中熒光PCR反應體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分 濃度 加樣量
PCR體系預混合物 2倍 25pL
探針法所用引物序列一 lO^mol/L 2pL
探針法所用引物序列二 10拜ol/L 2nL
探針法所用探針序列一 lO^mol/L L5pL DNA樣品 5jiL
雙蒸水 14.5pL
總體積 50 nL
熒光PCR擴增程序如下
(1) 50'C 2分鐘
(2) 95°C 10分鐘
(3) 95°C 15秒
(4) 60°C1分鐘
(5) 回到第3步，重復45次
擴增過程中使用熒光PCR儀進行實時熒光光強度測量，并將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過配套 軟件進行分析可以觀察到對食品中過敏原杏仁成分進行特異性擴增產(chǎn)生的特定波長的FAM 熒光信號，則證明待測樣品中存在食品中過敏原杏仁成分；如沒有觀察到任何一種熒光信號 則證明待測樣品中不存在食品中過敏原杏仁成分。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是可以檢測由于產(chǎn)品中蛋白質(zhì)遭到破壞，ELISA 方法不能檢出的食品中過敏原杏仁成分。本發(fā)明用PCR的方法擴增靶基因，避免了 ELISA 反應的復雜處理過程，節(jié)約時間；PCR鑒定方法受到的其他蛋白的干擾較小，較ELISA方法 更為準確。


圖1杏仁添加至巧克力樣品DNA，熒光信號強度。 圖2購買國際杏仁過敏原參考物質(zhì)DNA，熒光信號強度。 圖3非杏仁的其他堅果及薔薇科其他植物DNA，熒光信號強度。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述。 實施例l
樣本不含杏仁成分的巧克力做添加基質(zhì)。取l g研磨成糊狀的杏仁加入99g巧克力中 40'C水浴融化，攪拌30min,充分混合均勻。取3 g上述添加杏仁的巧克力加入27 g巧克力 中，以此不斷稀釋，最終制成含杏仁1000mg/kg、 100mg/kg、 20 mg/kg 、 10mg/kg、 5 mg/kg 的巧克力。
l.樣品處理
(1)分別取300mg樣品，放入1.5 mL離心管中，加入600 ^LCTAB緩沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20 mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/o鹽酸調(diào)pH值至8.0) ，15 (20 mg/ml)蛋白酶K， 65'C 溫育30min;加入500jiL酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)混合液強烈振蕩，離心12000rpm15 min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min，棄上清；用200 jiL TE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)；加等體積氯仿異戊醇(24: 1)混合液強烈振蕩，離 心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min，棄 上清；用200^LTE溶解。溶解的溶液作為樣品重復上述步驟純化DNA。用DNA分析儀檢測其 純度及濃度。
2. PCR擴增
成分濃度加樣量
PCR體系預混合物2倍25nL
探針法所用引物序列一2|iL
探針法所用引物序列二
探針法所用探針序列一10nmol/Ll單
DNA樣品
雙蒸水
總體積50
熒光PCR擴增程序如下
(1) 50'C 2分鐘 (2) 95°C10分鐘
(3) 95°C 15秒
(4) 60'C1分鐘200910068848.7
(5)回到第3步，重復45次 PCR共進行7管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為含榛果成分為1000 mg/kg、 100mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5mg/kg樣品、空白對照及陽性對照。 3.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到各濃度樣品分別在23.2、 35.2、 37.0、 38.0、 39.0、 39.1循環(huán) 產(chǎn)生了明顯的FAM熒光，結(jié)果如圖l。
圖1中的各條曲線所代表的FAM熒光強度信號分別是
1. 陽性對照；
2. 含杏仁成分1000 mg/kg巧克力DNA樣品；
3. 含杏仁成分100 mg/kg巧克力DNA樣品；
4. 含杏仁成分20 mg/kg巧克力DNA樣品；
5. 含杏仁成分10 mg/kg巧克力DNA樣品；
6. 含杏仁成分5 mg/kg巧克力DNA樣品；
7. 空白對照； 實驗表明該方法檢測靈敏度達到5 mg/kg。
實施例2
樣本國際杏仁過敏原參考物質(zhì)40mg/kg、 20mg/kg 、 10mg/kg、 5 mg/kg l.樣品處理
(1)分別取300 mg樣品，放入1.5 mL離心管中，加入600 CTAB緩沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20mmol/L、 Tris 100 mmol/L， 10。/o鹽酸調(diào)pH值至8.0) ，15 pL (20mg/ml)蛋白酶K，， 65。C溫育30min;加入500 nL酚氯仿異戊醇(25: 24: l)混合液強烈振蕩，離心12000rpm 15min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min，棄上清；用200 ^LTE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)；加等體積氯仿異戊醇(24: 1)混合液強烈振蕩， 離心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min， 棄上清；用200pLTE溶解。溶解的溶液作為樣品重復上述步驟純化DNA。用DNA分析儀檢測 其純度及濃度。
2. PCR擴增
成分濃度加樣量
PCR體系預混合物2倍25pL
探針法所用引物序列一1O拜ol/L2joL
探針法所用引物序列二lOpmol/L2pL
探針法所用探針序列一10,1/L1.5|xL
dna樣品5jjL雙蒸水 總體積
14.5pL 50 (iL
熒光PCR擴增程序如下
(1) 50°C 2分鐘
(2) 95°C 10分鐘
(3) 95°C 15秒
(4) 60°C 1分鐘
(5) 回到第3步，重復45次
PCR共進行5管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別40 mg/kg、20 mg/kg 、10 mg/kg、 5 mg/kg參考物質(zhì)的DNA及空白對照。 3.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到各濃度樣品分別在32.2、 34.6、 35.1、 36.8循環(huán)產(chǎn)生了明顯 的FAM熒光，結(jié)果如圖2。
圖2中的各條曲線所代表的FAM熒光強度信號分別是
1. 含40 mg/kg杏仁成分的參考物質(zhì)DNA樣品；
2. 含20 mg/kg杏仁成分的參考物質(zhì)DNA樣品；
3. 含10 mg/kg杏仁成分的參考物質(zhì)DNA樣品；
4. 含5 mg/kg杏仁成分的參考物質(zhì)DNA樣品；
5. 空白對照。
實驗表明該方法檢測靈敏度達到5 mg/kg得到國際參考物質(zhì)的確證。 實施例3
樣本杏仁；堅果類如花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果；水果類如蘋果、梨、楊 梅、李子。
1. 樣品處理
(1)分別取300 mg樣品，放入l.5 mL離心管中，加入600 CTAB緩沖液(CTAB 55mmol/L、 EDTA20證ol/L、 TrislOOmmol/L， 100/o鹽酸調(diào)pH值至8.0) ，15 (20mg/ml)蛋白酶K,, 65。C溫育30min;加入500 ^L酚氯仿異戊醇(25: 24: l)混合液強烈振蕩，離心12000rpm 15min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000rpm， 10min，棄上清；用200 HLTE溶解(TE量視DNA沉淀多少而定)加等體積氯仿異戊醇(24: 1)混合液強烈振蕩， 離心12000rpml5min;吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后離心12000 rpm， 10min， 棄上清；用200pLTE溶解。溶解的溶液作為樣品重復上述步驟純化DNA。用DNA分析儀檢測 其純度及濃度。
2. PCR擴增
成分 濃度 加樣量PCR體系預混合物
探針法所用引物序列
探針法所用引物序列
探針法所用探針序列
DNA樣品
10nmol/L 10|_imol/L
2nL 恥
14單 50
雙蒸水 總體積
熒光PCR擴增程序如下
(1) 50°C 2分鐘
(2) 95°C 10分鐘
(3) 95。C 15秒
(4) 60°C 1分鐘
(5) 回到第3步，重復45次
PCR共進行11管PCR實驗，其中DNA樣品所加入的分別為待測樣品的原濃度DNA
樣品o
3.被檢測樣品熒光PCR圖譜觀察
熒光PCR過程中可以觀察到杏仁DNA在30.2循環(huán)產(chǎn)生了明顯的FAM熒光，結(jié)果如圖3 。 圖3中的曲線所代表的FAM熒光強度信號分別是待測樣品的原濃度DNA樣品。
實驗表明該方法特異性強。 序列列表
SEQUENCE LISTING
<110>天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
120> —種運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法
<140> 200910068848.7 <141> 2009-05-15
<160> 3
<170> Patentln version 3.5 <210> 1<211> 20 <212> DNA <213>人工合成<220><221> prim—bind<222> (1)..(20)<400> 1世ggttgaaggagatgctc 20<210> 2<211> 21<212> DNA <213>人工合成<220><221> prim一bind <222> (1)..(21)<400> 2tagttgctggtgctctttatg 21<210> 3<211> 22<212> DNA <213>人工合成<220><221> prim一bind <222> (1)..(22)<400> 3tccatcagcagatgccaccaac 2權(quán)利要求
1.一種運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法，其特征在于，一種熒光PCR技術(shù)是指外切酶探針熒光PCR技術(shù)(TaqMan)探針技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法,其特征在于，外切酶探針熒光PCR技術(shù)(TaqMan探針法)檢測杏仁的方法所使用的引物、探針的序列如下引物所用引物序列一TTTGGTTGAAGGAGATGCTC所用弓I物序列二 TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG探針所用探針序列TCCATCAGCAGATGCCACCAAC
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所設計的引物序列、探針序列，其特征在于，還包括由上述三條引物和探針衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法，其特征在于，PCR反應體系中各組分構(gòu)成比例如下-成分濃度加樣JPCR體系預混合物2倍25nL探針法所用引物序列一2jiL探針法所用引物序列二10(imol/L2|iL探針法所用探針序列一1 Oj^nol/LDNA樣品5pL雙蒸水14.5fiL總體積50
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法，其特征在于，PCR方法中擴增程序為(1) 5(TC 2分鐘(2) 95°C10分鐘(3) 95。C15秒(4) 60'C1分鐘(5) 回到第3步，重復45次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運用熒光PCR技術(shù)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法，屬于過敏原檢測技術(shù)，特別是指外切酶探針熒光PCR技術(shù)(TaqMan)檢測食品中過敏原杏仁成分的方法。其技術(shù)方案是針對過敏原杏仁成分Pru du 1.06B DNA序列設計引物及TaqMan探針，建立熒光PCR檢測方法。本發(fā)明包括設計的杏仁成分特異性的引物和探針以及與之配套的熒光PCR反應條件。本方法花生、榛仁、栗子、核桃、松子、夏果等沒有交叉反應，具有特異性，檢測靈敏度可達到5mg/kg。本發(fā)明所載明的方法可以用于檢測食品中的過敏原，避免使用該類食物導致的過敏反應，具有實際意義。
文檔編號C12Q1/68GK101643786SQ200910068848
公開日2010年2月10日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者培 劉, 霞 張, 張海濱, 張海英, 徐寶梁, 王乃福, 穎 陳, 高旗利 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心