Rasamsonia轉(zhuǎn)化體的制作方法
【專利說(shuō)明】Rasamsonia轉(zhuǎn)化體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及在Rasamsonia細(xì)胞的革El位點(diǎn)實(shí)施重組的方法。本發(fā)明還涉及 Rasamsonia細(xì)胞，例如通過(guò)這種方法產(chǎn)生的Rasamsonia細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用這種 Rasamsonia細(xì)胞的工藝和產(chǎn)生的酶組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及核酸和氨基酸序列。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 碳水化合物組成地球上最豐量的有機(jī)化合物。然而，許多這類碳水化合物隱蔽在 復(fù)雜聚合物中，包括淀粉（種子和谷物中的主要儲(chǔ)存碳水化合物）和被稱為木質(zhì)纖維素的 碳水化合物與木質(zhì)素的集合。木質(zhì)纖維素的主要碳水化合物組分是纖維素、半纖維素和果 膠。這些復(fù)雜的聚合物通常被統(tǒng)稱為木質(zhì)纖維素。
[0004] 從由于OPEC減少石油輸出而導(dǎo)致石油危機(jī)爆發(fā)的70年代開(kāi)始，可再生的木質(zhì)纖 維素生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖吸引了研宄人員強(qiáng)烈的注意力，所述可發(fā)酵的糖隨后被 發(fā)酵以產(chǎn)生作為液體燃料的替代品的醇（例如乙醇）。在過(guò)去二十年間，乙醇在美國(guó)作為與 汽油的10 %的摻合物或在巴西作為車輛的純?nèi)剂弦驯粡V泛使用。更近期，實(shí)現(xiàn)了E85 (85 % 乙醇摻合物）的使用，特別是用于清潔城市應(yīng)用。燃料生物乙醇的重要性將會(huì)隨著油價(jià)的 提高及油來(lái)源的逐漸耗盡而提高。另外，可發(fā)酵的糖被用于生產(chǎn)塑料、聚合物和其他基于生 物的產(chǎn)品，并且預(yù)期這一工業(yè)將大幅增長(zhǎng)，從而提高了對(duì)豐富低成本的可發(fā)酵糖的需求，所 述可發(fā)酵糖可以被用作原料來(lái)代替基于石油的原料。
[0005] 這類大量碳水化合物在植物生物質(zhì)中的儲(chǔ)集提供了糖（五碳糖以及六碳糖）形式 的大量潛在的能量來(lái)源，所述糖能夠被用于大量工業(yè)和農(nóng)業(yè)過(guò)程。然而，這些碳水化合物的 大量能源潛力目前利用不足，因?yàn)樘欠忾]在復(fù)雜聚合物中并因此不容易進(jìn)行發(fā)酵。從植物 生物質(zhì)產(chǎn)生糖的方法會(huì)提供大量的、經(jīng)濟(jì)上有競(jìng)爭(zhēng)性的原料，用于發(fā)酵成化學(xué)品、塑料例如 琥珀酸和（生物）燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液體燃料和沼氣。
[0006] 無(wú)論何種纖維素原料，酶的成本和水解效率是限制生物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化方法商業(yè)化的 主要因素。微生物生產(chǎn)的酶的生產(chǎn)成本與產(chǎn)酶菌株的生產(chǎn)力和發(fā)酵液中最終活性產(chǎn)率密切 相關(guān)。
[0007] 盡管過(guò)去幾十年為了理解酶促木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解和纖維素酶生產(chǎn)而進(jìn)行了 持續(xù)的研宄，但是仍然期望發(fā)現(xiàn)或者改造新的有高度活性的纖維素酶和半纖維素酶。還高 度期望構(gòu)建能夠進(jìn)行迅速和有效的木質(zhì)纖維素材料生物降解的高效的酶組合物。
[0008] 此類酶組合物可被用來(lái)生產(chǎn)糖以用于發(fā)酵為化學(xué)品、塑料例如琥珀酸和（生物） 燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液體燃料和沼氣；用于青貯；并在其他工業(yè)方法例如食品 或飼料、紡織、制漿或造紙或洗滌劑工業(yè)和其他工業(yè)中用作酶。
[0009] 已知生產(chǎn)用于酶促木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解的合適的酶的微生物的一個(gè)屬是 Rasamsonia屬。Rasamsonia是絲狀真菌，它有時(shí)被稱Talaromyces。
[0010]Jain，S.etal，MolGenGenet(1992)，234,489-493 公開(kāi)了真菌Talaromycessp CL240的轉(zhuǎn)化體系。沒(méi)有公開(kāi)多肽的表達(dá)。
[0011]Murray，F(xiàn).R.etal，CurrGenet(1997)，32, 367-375 公開(kāi) 了來(lái)自Talaromyces flavus的葡萄糖氧化酶基因在Talaromycesmacrosporus中的過(guò)表達(dá)。研宄了真菌分離株 對(duì)V.dahliae的生長(zhǎng)抑制作用。
[0012] W0200170998公開(kāi)了Talaromyces emersonii 0-葡聚糖酶。在16頁(yè)，其描述了 0-葡聚糖酶的多核苷酸可在宿主例如酵母細(xì)胞中異源表達(dá)。
[0013] W0200224926 公開(kāi)了Talaromycesemersonii木聚糖酶。在 24 頁(yè)第 5 段，其描述 了可通過(guò)木聚糖酶DNA序列在合適的同源或異源宿主細(xì)胞中重組表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)多肽的生產(chǎn)。 在第7段，其講述了宿主細(xì)胞可過(guò)表達(dá)多肽，用于工程制造過(guò)表達(dá)的技術(shù)是從W099/32617 中已知的。W099/32617涉及表達(dá)克隆，但沒(méi)公開(kāi)在Talaromyces宿主中的克隆。
[0014] W02007091231公開(kāi)了熱穩(wěn)定的并編碼熱穩(wěn)定酶的Talaromycesemersonii菌株， 還公開(kāi)了由Talaromycesemersonii菌株生產(chǎn)的酶組合物。沒(méi)有公開(kāi)同源或異源多肽的重 組生產(chǎn)。在表1中顯示了誘導(dǎo)性碳源被以0.2-6%的量添加。Solkafloe和葡萄糖（2%) 被包括用于比較目的。在78頁(yè)28行，其講述了"葡萄糖未完全抑制通過(guò)T.emersonii菌株 的葡糖苷外切酶生產(chǎn)"（表31A)。表31A示出了用葡萄糖作為碳源，頂1393751產(chǎn)生31.90IU 的e-葡糖苷酶活性，但沒(méi)有其他纖維素酶活性例如葡聚糖酶或木糖酶活性。由于缺少此 類酶活性，菌株IMI393751不適于生產(chǎn)葡萄糖作為碳源時(shí)用于轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素的纖維素 酶。
[0015] W02011054899公開(kāi)了Talaromyces轉(zhuǎn)化體和利用Talaromyces轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)多肽的 方法。利用選擇標(biāo)記（例如抗腐草霉素標(biāo)記）選擇感興趣的多核苷酸被引入的轉(zhuǎn)化體，其 中所述選擇標(biāo)記與感興趣的多核苷酸被同時(shí)引入。
[0016] 額外的遺傳工具是必需的以更有效地利用Rasamsonia生產(chǎn)酶或其它工業(yè)相關(guān)產(chǎn) 品。
[0017] 發(fā)明概沐
[0018] 本發(fā)明涉及在Rasamsonia細(xì)胞的靶位點(diǎn)（例如在靶基因組內(nèi)）實(shí)施重組的方法。 本發(fā)明所述的重組方法導(dǎo)致靶位點(diǎn)的改變，例如在靶位點(diǎn)插入核酸序列。可實(shí)施所述的方 法以使在靶位點(diǎn)插入新的序列并伴隨從靶位點(diǎn)除去現(xiàn)存的序列。也就是說(shuō)，所述方法可被 用于將靶位點(diǎn)上的序列替換為替代性序列。所述方法可便于在宿主細(xì)胞體內(nèi)實(shí)施。
[0019] 通常，當(dāng)在體內(nèi)實(shí)施時(shí)，不對(duì)人類或動(dòng)物細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明所述的方法。也就是說(shuō)， 通常不以治療方法的形式實(shí)施本發(fā)明所述的方法?？梢噪x體或體外方式實(shí)施本發(fā)明所述的 方法。術(shù)語(yǔ)離體或體外應(yīng)被理解為包括對(duì)微生物（對(duì)完整活細(xì)胞或非細(xì)胞物質(zhì)二者）實(shí)施 的方法，但排除對(duì)人類或動(dòng)物實(shí)施的方法。
[0020] 通常，實(shí)施所述的方法使至少部分插入在靶位點(diǎn)的序列隨后被移除。如果實(shí)施所 述的方法以在靶位點(diǎn)替換序列并隨后移除插入的序列，那么結(jié)果可以是使靶位點(diǎn)的序列缺 失。
[0021] 因此，可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以改變靶位點(diǎn)的序列。這種改變可以是，例如添加 新的序列、替換現(xiàn)存的序列和/或缺失/去除現(xiàn)存的序列。
[0022] 因此，所述方法可被用于產(chǎn)生Rasamsonia無(wú)標(biāo)記的缺失菌株。也就是說(shuō)，可以用 標(biāo)記序列替換靶序列，然后移除標(biāo)記序列。
[0023] 在Rasamsonia細(xì)胞體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明。優(yōu)選地，Rasamsonia細(xì)胞可產(chǎn)生感興趣的 化合物，例如酶，特別是一種或多種纖維素酶。
[0024] 應(yīng)用本發(fā)明的方法之前，Rasamsonia細(xì)胞可以能夠產(chǎn)生感興趣的化合物。在這種 情況下，可利用本發(fā)明的方法修飾靶位點(diǎn)以改變宿主細(xì)胞對(duì)感興趣的化合物的生產(chǎn)，例如 可增加產(chǎn)量?；蛘?，作為應(yīng)用本發(fā)明的方法的結(jié)果，宿主細(xì)胞可產(chǎn)生感興趣的化合物。
[0025] 特別地，可利用所述方法產(chǎn)生非同源重組（NHR)/同源重組（HR)的比率降低的 Rasamsonia細(xì)胞，以使所產(chǎn)生的細(xì)胞在靶位點(diǎn)靶向整合多核苷酸的效率提高。此外，可利用 所述方法使編碼蛋白酶P印A的基因缺失，以使所產(chǎn)生的細(xì)胞顯示出異源基因的生產(chǎn)的增 加。
[0026] 因此，利用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的Rasamsonia細(xì)胞可以不含標(biāo)記、顯示較高程度的 HR和顯示活性降低或有缺陷的蛋白酶p印A。這些細(xì)胞形成了本發(fā)明的一部分。
[0027] 因此，本發(fā)明提供在Rasamsonia細(xì)胞的靶位點(diǎn)實(shí)施重組的方法，其中所述方法包 括：
[0028] _提供兩種或多種核酸，它們總共包含：(a)能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的 序列；(b)兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)；（C)編碼識(shí)別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的重組酶的 序列；和⑷編碼標(biāo)記的序列，
[0029] 其中所述的兩種或多種核酸能夠相互同源重組以產(chǎn)生一種核酸，和
[0030] 其中所述的兩種或多種核酸中的至少兩種各包含編碼無(wú)功能的部分標(biāo)記的序列； 和
[0031]-在Rasamsonia細(xì)胞中，使所述的兩種或多種核酸相互重組并與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序 列重組，以在靶位點(diǎn)插入編碼有功能標(biāo)記的連續(xù)核酸序列和編碼重組酶的序列，所述編碼 標(biāo)記和/或編碼重組酶的序列的側(cè)翼是至少兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)且所述位點(diǎn)特異性 重組位點(diǎn)的側(cè)翼是能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列，
[0032] 從而在Rasamsonia細(xì)胞的靶位點(diǎn)實(shí)施重組。
[0033] 因此，所述的兩種或多種核酸中的至少兩種各包含編碼無(wú)功能的部分標(biāo)記基因的 序列，即各包含重組后編碼有功能標(biāo)記的部分序列（其中所述部分自身不編碼有功能標(biāo) 記）。本發(fā)明還提供：
[0034]-通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的Rasamsonia細(xì)胞；
[0035]-無(wú)標(biāo)記的Rasamsonia細(xì)胞；
[0036]-Rasamsonia細(xì)胞，其是親本Rasamsonia的變體，其中突變體中的NHR/HR的比率 比在相同條件下在所述親本細(xì)胞中測(cè)量到的所述比率低；
[0037]-Rasamsonia細(xì)胞，其中NHR/HR的比率低于約50,優(yōu)選地低于約10,甚至更優(yōu)選地 低于約1，最優(yōu)選地低于約0. 001。
[0038]-Rasamsonia細(xì)胞，其基因組中具有修飾以使其在產(chǎn)生至少一種天冬氨酸蛋白酶 pepA方面存在缺陷；
[0039]-用于生產(chǎn)一種或多種酶的多肽組合物的方法，其包括下述步驟：
[0040] (a)通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明所述的Rasamsonia細(xì)胞生產(chǎn)多肽組合物， 其中所述細(xì)胞能夠產(chǎn)生期望的多肽，例如酶，任選地其由重組核酸編碼；和
[0041] (b)任選地，回收所述多肽組合物；
[0042] _用于生產(chǎn)包含纖維素、半纖維素和/或果膠中的一種或多種的多肽組合物的方 法，其包括下述步驟：
[0043] (a)通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明所述的Rasamsonia細(xì)胞生產(chǎn)多肽組 合物，其中所述細(xì)胞能夠產(chǎn)生纖維素、半纖維素和/或果膠中的一種或多種，任選地其由重 組核酸編碼；和
[0044] (b)任選地，回收所述多肽組合物；
[0045]-可來(lái)源于Rasamsonia細(xì)胞、優(yōu)選的是Rasamsoniaemersonii細(xì)胞的核酸序列， 其編碼參與非同源末端連接的多肽，其中所述核酸序列是：
[0046]a.SEQIDNO:20、SEQIDNO:23、SEQIDNO:26、SEQIDNO:29、SEQIDNO:32、 SEQIDN0:35,SEQIDN0:38,SEQIDN0:4USEQIDN0:44,SEQIDN0:47,SEQIDN0:50 或SEQIDN0:53所示的核酸序列；或者
[0047]b.編碼與SEQIDNOSEQIDNO: 21、SEQIDNO: 24、SEQIDNO: 27、SEQIDNO: 30、 SEQIDNO:33,SEQIDNO:36,SEQIDNO:39,SEQIDNO:42,SEQIDNO:45,SEQIDNO:48, SEQIDN0:51或SEQIDN0:54所示的氨基酸序列有至少60%序列同一性的多肽的核酸序 列；
[0048]-可來(lái)源于Rasamsonia細(xì)胞、優(yōu)選的是Rasamsoniaemersonii細(xì)胞的核酸序列， 其編碼pepA天冬氨酸蛋白酶，其中所述核酸序列是：
[0049]a.SEQIDNO:58所示的核酸序列，或者
[0050]b.編碼與SEQIDNOSEQIDN0:59所示的氨基酸序列有至少60%序列同一性的 多肽的核酸序列；
[0051]-包含本發(fā)明所述的核酸序列的重組核酸構(gòu)建體；和
[0052]-由本發(fā)明的DNA序列編碼的多肽。
[0053]附圖簡(jiǎn)沐
[0054] 圖1展示了質(zhì)粒pDELNicB-3的示意圖，其是用于使A.niger中的nicB基因失活的 替換盒的基礎(chǔ)。替換盒包含nicB的側(cè)翼區(qū)域、hygB標(biāo)記盒、突變IoxP位點(diǎn)和E.coliDNA。 在實(shí)施例部分（參見(jiàn)下文）可以找到關(guān)于PDELNicB-3的更多細(xì)節(jié)。
[0055] 圖2展示了質(zhì)粒pDEL_PdxA_2的示意圖，其是用于使A.niger中的pdxA基因失活 的替換盒的基礎(chǔ)。替換盒包含PdxA的側(cè)翼區(qū)域、ble標(biāo)記盒、突變IoxP位點(diǎn)和E.coliDNA。 在實(shí)施例部分（參見(jiàn)下文）可以找到關(guān)于pDEL_PdxA-2的更多細(xì)節(jié)。
[0056] 圖3展示了質(zhì)粒pDEL_EP0_Hyg-l的示意圖，其包含使A.niger中的epo基因失活 的替換盒的一部分。替換盒包含epo的側(cè)翼區(qū)域、hygB標(biāo)記盒的一部分、突變IoxP位點(diǎn)和 E.coliDNA。在實(shí)施例部分（參見(jiàn)下文）可以找到關(guān)于pDEL_EP0_Hyg_l的更多細(xì)節(jié)。
[0057] 圖4展示了質(zhì)粒pDEL_EP0_CRE_l的示意圖，其包含使A.niger.中的印〇基因失 活的替換盒的一部分。替換盒包含epo的側(cè)翼區(qū)域、hygB標(biāo)記盒的一部分、突變IoxP位 點(diǎn)、ere重組酶表達(dá)盒和E.coliDNA。在實(shí)施例部分（參見(jiàn)下文）可以找到關(guān)于pDEL_EP0_ CRE-I的更多細(xì)節(jié)。
[0058] 圖5展示了片段產(chǎn)生以及A.niger中的轉(zhuǎn)化和重組中這些片段的使用的示意圖。 頂部展示了利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)生"二重左"（"bipartiteleft"）和"二重右"（"bipartite right"）片段。底部圖中展示了通過(guò)二重左片段和二重右片段在基因組內(nèi)的同源重組轉(zhuǎn)化 A.niger〇
[0059] 圖6展示了片段產(chǎn)生以及A.niger中的轉(zhuǎn)化和重組中這些片段的使用的示意圖 (同樣展示于圖5)。這個(gè)特定實(shí)施例中的各二重（bipartit)片段不同，因?yàn)樗鼈兞硗獍珻re重組酶盒。最后的圖展示了Cre誘導(dǎo)的重組事件之后產(chǎn)生的基因組位點(diǎn)的布局。
[0060] 圖7展示了Cre誘導(dǎo)的側(cè)翼為IoxP的hygB選擇標(biāo)記的丟失。上部板是Cre未誘 導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體。下部板是通過(guò)涂布在作為碳源的木糖上而使Cre被誘導(dǎo)。百分比展示了Cre 誘導(dǎo)后，A.niger菌落中標(biāo)記移除的百分比。
[0061] 圖8描述了用于在真菌中瞬時(shí)表達(dá)ere重組酶的pEBA513的圖譜。pEBA513是 PAMPF21衍生的載體，其包含AMl區(qū)域和CAT氯霉素抗性基因。顯示的是ere重組酶基因 (ere)表達(dá)盒，其包含A.nigerglaA啟動(dòng)子（Pgla)、cre重組酶編碼區(qū)和niaD終止子。此 外，還展示了由A.nidulansgpdA啟動(dòng)子（PgpdA)、hygB編碼區(qū)和P.chrysogenumpenDE終 止子組成的潮霉素抗性盒。
[0062] 圖9展示了利用PCR檢測(cè)R.emersonii基因組中的pGBT0PEBA-205表達(dá)質(zhì)粒。 分離并利用PCR分析來(lái)自轉(zhuǎn)化體A-A4(泳道2-4)和空菌株（泳道5-7)的基因組DNA。 質(zhì)粒DNA被用作PCR反應(yīng)的對(duì)照模板：pGBT0PEBA-4(泳道8)、pGBT0PEBA-8 (泳道9)和 pGBTOPEBA-205 (泳道10)。在PCR反應(yīng)中，加入針對(duì)pGBT0PEBA-4(泳道2、5和8,預(yù)計(jì)片 段：256bp)、pGBT0PEBA-8 (泳道 3、6 和 9,預(yù)計(jì)片段：306bp)和pGBT0PEBA-205 (泳道 4、7 和 10,預(yù)計(jì)片段：452bp)的引物。泳道1和11含有分子量標(biāo)記。
[0063] 圖10展示了無(wú)標(biāo)記的R.emersonii轉(zhuǎn)化體的表型分析和PCR分析。用milliQ水 (對(duì)照）或PEBA513構(gòu)建體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體A-A4以使ere重組酶瞬時(shí)表達(dá)，其中轉(zhuǎn)化體A-A4含 有多拷貝的R.emersoniiCbhI和含有側(cè)翼為IoxP的ble表達(dá)盒的pDEL_Pdx-A2質(zhì)粒。
[0064](圖10A):生長(zhǎng)于含10yg/ml腐草霉素的PDA培養(yǎng)基（左側(cè)圖）和無(wú)選擇的 PDA(右側(cè)圖）的轉(zhuǎn)化體和空菌株的MTP板的圖片。行A展示了A-A4的兩種milliQ對(duì)照轉(zhuǎn) 化體，其中A-A4包含具有側(cè)翼為IoxP的ble表達(dá)盒（lox-ble-lox)的pDEL_Pdx_A2。行 B展示了pEBA513轉(zhuǎn)化的兩種A-A4轉(zhuǎn)化體（lox-ble_lox+pEBA513)的生長(zhǎng)。親本轉(zhuǎn)化體 A-A4(lox-ble_lox，轉(zhuǎn)化前）生長(zhǎng)于行C。最后，行D展示了空菌株的生長(zhǎng)。
[0065](圖10B):利用ere重組酶移除標(biāo)記之前和之后的轉(zhuǎn)化體以及ere重組酶構(gòu)建 體的PCR分析。泳道2和泳道3展示了通過(guò)兩種milliQ對(duì)照A-A4轉(zhuǎn)化體的PCR分析得 到的PCR片段，其中使用針對(duì)ble表達(dá)構(gòu)建體中的pdx側(cè)翼的引物。如果轉(zhuǎn)化體仍然含有 ble選擇標(biāo)記，那么2752bp的PCR條帶是預(yù)計(jì)被擴(kuò)增的PCR片段。泳道5和6展示了用 PEBA513轉(zhuǎn)化的兩種A-A4轉(zhuǎn)化體的PCR分析，其中使用針對(duì)pEBA513cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒的 hygB基因的引物（314bp片段）。泳道8和9展示了用pEBA513轉(zhuǎn)化的兩種A-A4轉(zhuǎn)化體的 PCR片段，其中使用針對(duì)bIe表達(dá)構(gòu)建體的pdx側(cè)翼的引物。88Ibp的PCR片段指示來(lái)源于 R.emersonii轉(zhuǎn)化體的ble表達(dá)盒的缺失。泳道1、4和7含有分子量標(biāo)記。
[0066] 圖11描述了pEBAlOOl載體。部分載體片段和pEBA1002載體聯(lián)合用于二重基因 革巴向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu800RF缺失。所述載體包含2500bp5'上游 側(cè)翼區(qū)、lox66位點(diǎn)、由A.nidulansgpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ble編碼序列的5'部分和pUC19 骨架（Invitrogen，Breda，荷蘭）。轉(zhuǎn)化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去 E.coliDNA0
[0067] 圖12描述了pEBA1002載體。部分載體片段和pEBAlOOl載體聯(lián)合用于二重基因靶 向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu800RF缺失。所述載體包含ble編碼區(qū)的3' 部分、A.nidulanstrpC終止子、lox71 位點(diǎn)、ReKu800RF的 2500bp3' 下游側(cè)翼區(qū)和pUC19 骨架（Invitrogen，Breda，荷蘭）。轉(zhuǎn)化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去 E