位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。圖6中展示了這種方法?；蛘?，位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)可由能 夠與包含編碼標(biāo)記的序列的核酸序列重組的額外核酸序列提供。在本發(fā)明所述的方法中， 兩種或多種核酸能夠相互同源重組以產(chǎn)生一種核酸。由于能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重 組的序列的存在，核酸在靶位點(diǎn)被合并成為一種連續(xù)序列。此外，兩種或多種核酸中的至少 兩種各包含編碼無功能的部分標(biāo)記的序列。
[0166] 因此，在本發(fā)明的方法中，兩種或多種核酸相互重組并與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組。 以這種方式，編碼有功能標(biāo)記的連續(xù)核酸序列可與編碼重組酶的序列和至少兩個(gè)位點(diǎn)特異 性重組位點(diǎn)一起被插入至靶位點(diǎn)。這種編碼有功能標(biāo)記的序列通常被插入在靶位點(diǎn)以使其 側(cè)翼是至少兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。當(dāng)重組酶表達(dá)時(shí)，位于位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的 序列可被外重組（out-recombined)。如果編碼標(biāo)記和/或編碼重組酶的序列位于位點(diǎn)特異 性重組位點(diǎn)之間，那么它/它們將被外重組。然而，如果編碼標(biāo)記和/或編碼重組酶的序列 位于位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之外，那么其將被保留在靶位點(diǎn)。
[0167] 當(dāng)重組發(fā)生后，位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)、標(biāo)記和重組酶序列的側(cè)翼將會(huì)是能夠與靶 位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列。
[0168] 還可以通過單獨(dú)加入重組酶實(shí)施本發(fā)明所述的方法，使用例如質(zhì)粒（包含編碼重 組酶的序列），或者通過使用直接加入的重組酶蛋白。
[0169] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以同時(shí)靶向多于1個(gè)（例如2、3、4、5或更多個(gè)）靶位點(diǎn)。 以這種方式，所述的兩種或多種核酸總共包含能夠與兩個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重 組的序列。以這種方式，所述的兩種或多種核酸相互重組并與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列重組，從而 導(dǎo)致每個(gè)靶位點(diǎn)至少插入兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。所提供的兩種或多種核酸使得編碼有 功能重組酶的核酸序列被插入在至少一個(gè)靶位點(diǎn)，任選地，所述靶位點(diǎn)位于至少兩個(gè)位點(diǎn) 特異性重組位點(diǎn)之間。其它靶位點(diǎn)不必須地包含編碼有功能重組酶的序列，但每個(gè)靶位點(diǎn) 將包含至少兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)（可被重組酶靶向）。至少提供兩種各包含編碼無功 能標(biāo)記的序列的核酸。因此，一種或多種編碼有功能標(biāo)記的序列可被插入在一個(gè)或多個(gè)靶 位點(diǎn)。但也可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以在所有或一些靶位點(diǎn)插入編碼有功能標(biāo)記的序列。
[0170] 再次，在每個(gè)靶位點(diǎn)，所述的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)以及任何編碼標(biāo)記和編碼重組 酶的序列的側(cè)翼都將是能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列。
[0171] 本發(fā)明的方法中，所述的兩種或多種核酸能夠相互重組以產(chǎn)生一種核酸。由于能 夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列的存在，核酸在靶位點(diǎn)被合并成為一種連續(xù)的序 列。
[0172] 更詳細(xì)地，本發(fā)明所提供的兩種或多種核酸總共包含能夠同源重組針對(duì)靶位點(diǎn)的 兩個(gè)或多個(gè)同源重組位點(diǎn)的序列。通常當(dāng)所述方法靶向單一的靶位點(diǎn)時(shí)，所述的兩種或多 種核酸將提供兩種這樣的序列。這些序列被提供以使包含至少兩種或多種核酸的連續(xù)核酸 序列（當(dāng)被相互重組時(shí)）通過與靶序列側(cè)翼的基本同源的序列重組而被插入在靶位點(diǎn)。
[0173] 為了通過雙交換事件實(shí)現(xiàn)同源重組，需要這些側(cè)翼序列出現(xiàn)在通過所述的兩種或 多種核酸的重組得到的連續(xù)序列的兩側(cè)/端且與靶位點(diǎn)兩側(cè)的序列基本同源，這對(duì)技術(shù)人 員而言是顯而易見的，因此，能夠同源重組的序列通常被提供以使它們位于通過所述的兩 種或多種核酸的重組得到的核酸序列的" 5 "和" 3 "末端。
[0174] 此外，根據(jù)本發(fā)明所提供的至少兩種核酸能夠相互重組。因此，核酸的末端被方便 地設(shè)計(jì)以使相互重組能夠發(fā)生且核酸將以期望的方向和順序被組裝。因此，所提供的核酸 的末端序列將與想要與之重組的核酸的末端序列基本同源。
[0175] 本發(fā)明所使用的術(shù)語"基本同源"的意思是：第一個(gè)核酸序列與想要與之重組的第 二個(gè)核酸序列在不多于約3kb，優(yōu)選地不多于約2kb，更優(yōu)選地不多于約lkb，甚至更優(yōu)選地 不多于約0. 5kb，甚至更優(yōu)選地不多于約0. 2kb，甚至更優(yōu)選地不多于約0.lkb，如不多于約 0. 05kb，例如不多于約0. 03kb的區(qū)域中的同一性程度為至少約70%，至少約80%，優(yōu)選地 至少約90 %，至少95 %，至少98 %，至少99 %，最優(yōu)選地100 %。在絲狀真菌中，最佳大小可 從約500bp至約2. 5kb。因此，所需的同一性程度可取決于基本同源序列的長度。同源序列 越短，同源性百分比可越高。
[0176] 在本發(fā)明中，所述的兩種或多種核酸總共包含兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。 這些位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)被由兩種或多種核酸總共編碼的重組酶識(shí)別。
[0177] 所述的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)和重組酶被選擇以使重組酶可以靶向位點(diǎn)特異性重 組位點(diǎn)，從而導(dǎo)致位于重組位點(diǎn)之間的序列被外重組（out-recombination)。
[0178] 術(shù)語"重組酶"或"位點(diǎn)特異性重組酶"或其類似物指的是識(shí)別和結(jié)合至短核酸位 點(diǎn)或"位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)"（即重組酶識(shí)別位點(diǎn)）并催化與這些位點(diǎn)相關(guān)的核酸重組的酶 或重組酶。這些酶包括重組酶、轉(zhuǎn)座酶和整合酶。
[0179]"位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)"或其類似物指的是短核酸位點(diǎn)或序列（即重組酶識(shí)別 位點(diǎn)），其被序列或位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別并在位點(diǎn)特異性重組事件過程中變成交換 (crossover)區(qū)域。序列特異性重組酶祀位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于Iox位點(diǎn)、att位點(diǎn)、dif 位點(diǎn)和frt位點(diǎn)。
[0180] 本文中使用的術(shù)語"lox位點(diǎn)"指的是一種核酸序列，其中噬菌體Pl的ere基因 的產(chǎn)物（即Cre重組酶）能夠在該序列上催化位點(diǎn)特異性重組事件。本領(lǐng)域已知的多種 Iox位點(diǎn)，包括天然存在的l〇XP、l〇XB、IoxL和IoxR以及大量突變的或變體Iox位點(diǎn)，例如 lox66、lox71、loxP511、loxP514、IoxA86、IoxA117、loxC2、loxP2、loxP3 和IoxP23〇
[0181] 本文中使用的術(shù)語"frt位點(diǎn)"指的是一種核酸序列，其中酵母2微米質(zhì)粒的FLP 基因的產(chǎn)物（即FLP重組酶）能夠在該序列上催化位點(diǎn)特異性重組。
[0182] 位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)可使重組酶表達(dá)后的外重組在靶位點(diǎn)產(chǎn)生不被重組酶識(shí)別 的單個(gè)突變位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。特別地，所述Iox位點(diǎn)可以是lox66和lox71 (Albert， H. ,Dale,E.C. ,Lee,E. , &0w,D.ff. (1995)).Site-specificintegrationofDNAinto wild-typeandmutantIoxsitesplacedintheplantgenome.PlantJournal，7(4)， 649-659)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，lox66和lox71位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)可使重組酶表 達(dá)后的外重組在靶位點(diǎn)產(chǎn)生不被重組酶識(shí)別的l〇x72突變位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。
[0183] 本發(fā)明所實(shí)施的方法中，除了重組酶、位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)和能夠與靶位點(diǎn)的側(cè) 翼序列同源重組的序列之外，兩種或多種核酸總共還包含編碼標(biāo)記的序列以使所述的兩種 或多種核酸的重組導(dǎo)致所述的編碼標(biāo)記基因的序列被插入在靶位點(diǎn)。這種編碼標(biāo)記的序列 可位于至少兩種能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列之間。
[0184] 關(guān)鍵地，兩種或多種核酸被提供以使至少兩種核酸各包含編碼無功能的部分標(biāo)記 編碼序列的序列。當(dāng)所述的兩種或多種核酸被重組時(shí)，將產(chǎn)生編碼有功能標(biāo)記的連續(xù)序列。 因此，本發(fā)明的方法被稱為"分開標(biāo)記"法。
[0185] 在本發(fā)明的上下文中，無功能指的是無法編碼能夠擔(dān)當(dāng)有功能選擇標(biāo)記的產(chǎn)物的 序列。因此，如果可供使用的標(biāo)記集合有限，則本發(fā)明特別適用。
[0186] 通常，可實(shí)施所述方法以使編碼標(biāo)記的序列位于兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn) 之間。以這種方式，標(biāo)記基因可通過重組酶的表達(dá)被外重組。因此，所述方法可被用于顯性 標(biāo)記和反向選擇標(biāo)記。
[0187] 以這種方式，可以使用相同的標(biāo)記以重復(fù)模式實(shí)施所述方法，其中所述重復(fù)模式 具有不止一個(gè)循環(huán)的與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列的同源重組，然后在重組酶表達(dá)后外重組?？蛇M(jìn) 一步將這種方法與突變位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的使用相結(jié)合，其中一旦標(biāo)記被外重組，所述 位點(diǎn)就不能被重組酶靶向。
[0188] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于：它允許同時(shí)、連續(xù)或分別實(shí)施多個(gè)重組事件。
[0189] 因此，可使用相同的標(biāo)記以具有不止一個(gè)重組循環(huán)的重復(fù)模式實(shí)施所述方法。因 此，本發(fā)明特別適用于可供使用的標(biāo)記集合有限的情況?？蛇M(jìn)一步將這種方法與突變位點(diǎn) 特異性重組位點(diǎn)的使用相結(jié)合，其中一旦標(biāo)記被外重組，所述位點(diǎn)就不能被重組酶靶向。由 于標(biāo)記通過重組酶的激活而被消除，因此這個(gè)方法允許靶向多個(gè)位點(diǎn)且被靶向的位點(diǎn)的數(shù) 目不受不同標(biāo)記的可用性的限制。
[0190] 在本發(fā)明的方法中，兩種或多種核酸總共可包含兩種或多種不同的標(biāo)記編碼序列 以使所述的兩種或多種核酸的重組導(dǎo)致所述的兩種或多種不同的標(biāo)記基因編碼序列被插 入在靶位點(diǎn)。可提供能夠與兩個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列以實(shí)施這種方 法。進(jìn)一步，可以使用一種標(biāo)記靶向至少兩個(gè)靶位點(diǎn)，使用不同的標(biāo)記靶向一個(gè)或多個(gè)其它 靶位點(diǎn)。
[0191] 在本發(fā)明的方法中，編碼標(biāo)記的序列之一將是分開的。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方式中，兩種或更多種或甚至所有的編碼標(biāo)記的序列通常都將是分開的。也就是說，對(duì) 于每一個(gè)標(biāo)記，兩種或多種核酸被提供以使至少兩種核酸各包含編碼無功能的部分標(biāo)記編 碼序列的序列。所述的兩種或多種核酸的重組產(chǎn)生編碼有功能標(biāo)記的連續(xù)序列。本發(fā)明所 述的方法可包括至少一種分開的標(biāo)記。通常，所用的所有編碼標(biāo)記的序列都以分開的形式 被提供。
[0192] 可實(shí)施所述的方法以使一種或多種相同的或不同的標(biāo)記被重組至細(xì)胞，其中每個(gè) 標(biāo)記的側(cè)翼均為Iox位點(diǎn)。然后，本發(fā)明所述的方法可被用于提供進(jìn)一步的重組事件，同時(shí) 除去所有這些標(biāo)記。
[0193] 在本發(fā)明所述的方法中，靶位點(diǎn)包含被破壞和/或部分或全部缺失的編碼序列。 通常，所述方法在靶位點(diǎn)增加新序列；這種新序列通常將替換、缺失和/或修飾靶位點(diǎn)的序 列。
[0194] 如上所述，當(dāng)在宿主細(xì)胞體內(nèi)實(shí)施重組時(shí)，替換序列可以例如賦予可選擇的表型。 在這種情況下，所述替換序列包含選擇標(biāo)記。優(yōu)選地，實(shí)施這種方法以使標(biāo)記可通過重組酶 的表達(dá)被外重組。
[0195] 替換序列還可以是靶序列的經(jīng)修飾形式，例如以改變對(duì)感興趣的序列的調(diào)控或表 達(dá)與原始基因產(chǎn)物相比性質(zhì)改變的經(jīng)修飾的基因產(chǎn)物。
[0196] 替換序列還可以組成已存在于宿主細(xì)胞基因組中的感興趣的序列的額外拷貝，以 擴(kuò)增所述的感興趣的序列。
[0197] 替換序列可以相對(duì)于宿主細(xì)胞是同源的或異源的序列。其可以從任何合適的來源 獲得或者可通過訂制合成制備。
[0198] 靶序列可以是任何感興趣的序列。例如，靶序列可以是利用失活或修飾該序列而 被研宄其功能的序列。靶序列還可以是這樣的序列，其失活、修飾或過表達(dá)是期望的以賦予 宿主細(xì)胞期望的表型。通常，本發(fā)明所述的方法將導(dǎo)致靶位點(diǎn)的一些核酸序列被移除。然 而，本發(fā)明所述的方法可被用于在靶位點(diǎn)插入序列而不從靶位點(diǎn)丟失任何序列。
[0199] 在本公開的上下文中，術(shù)語"核酸"、"核酸序列"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核 酸片斷"、"分離的核酸片段"在本文中可被交換使用。
[0200] 這些術(shù)語包括核苷酸序列及其類似物。核酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA的聚 合物，任選地，其含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。
[0201]DNA聚合物形式的核酸可包括cDNA、基因組DNA或合成DNA或其混合物中的一種 或多種區(qū)段。
[0202] 術(shù)語"分離的核酸"和其類似物指的是大體上不含其它核酸序列（例如但不限于 其它染色體的和染色體外的DNA和/或RNA)的核酸?？蓮姆蛛x的核酸天然存在的宿主細(xì) 胞中將其純化。
[0203] 可使用技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法獲得分離的核酸。該術(shù)語還包括重組的 核酸和化學(xué)合成的核酸。通常，可利用本領(lǐng)域已知的任何擴(kuò)增方法（例如PCR、RT_PCR等） 產(chǎn)生適用于本發(fā)明的兩種或多種核酸中的每一種。本文中使用的術(shù)語"擴(kuò)增"或"擴(kuò)增反 應(yīng)"指的是用于增加核酸中靶序列拷貝的任何體外方法。有時(shí)候，擴(kuò)增指的是靶核酸的"指 數(shù)"增加。然而，本文中使用的"擴(kuò)增"還可以指選擇的核酸靶序列的數(shù)目線性增加，但通常 不同于一次、單引物延伸步驟。
[0204] 通常，兩種或多種核酸被引入宿主細(xì)胞以使重組事件可發(fā)生?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技 術(shù)人員公知的多種技術(shù)將所述的兩種或多種核酸引入宿主細(xì)胞。被用于引入異源的核酸至 多種生物體的方法的非限制性實(shí)例包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔、超聲介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、粒子 轟擊等。在某些情況下，加入載體分子能夠增加通常被認(rèn)為很難通過常規(guī)方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 對(duì)DNA的攝取。技術(shù)人員易于得知轉(zhuǎn)化的常規(guī)方法。
[0205] 用于產(chǎn)生兩種或多種核酸以及之后將它們引入宿主細(xì)胞的程序是本領(lǐng)域的技術(shù) 人員公知的。（參見，例如Sambrook&Russell，MolecularCloning:ALaboratoryManual， 3rdEd.，CSHLPress，ColdSpringHarbor，NY，2001 ;和Ausubeletal.，Current ProtocolsinMolecularBiology,WileyInterScience，NY，1995)〇
[0206] 此外，標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)（例如DNA分離、凝膠電泳、核酸的酶促限 制性修飾、Southern分析、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等）是技術(shù)人員已知的且被例如Sambrook etal. (1989)"MolecularCloning:alaboratorymanual"，ColdSpringHarbor Laboratories，ColdSpringHarbor,NewYorkandInnisetal. (1990)〃PCRprotocols， aguidetomethodsandapplications〃AcademicPress，SanDiego描述。
[0207] 可以按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和恰當(dāng) 的寡核苷酸引物擴(kuò)增適用于本發(fā)明所述的方法的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆至恰當(dāng)?shù)?載體（如果期望）和/或通過核酸序列分析被表征。
[0208] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以使兩種或多種核酸被重組為一種核酸，之后其與靶位 點(diǎn)重組。
[0209] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法，其中所述的兩種或多種核酸的相互重組以及與靶位點(diǎn) 的重組同時(shí)發(fā)生。
[0210] 在本發(fā)明所述的方法中，至少兩種核酸中的兩種可各包含編碼標(biāo)記的序列的一部 分以使它們總共包含完整的編碼標(biāo)記的序列。
[0211] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以表達(dá)針對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的重組酶，從而使位于 兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的序列被外重組。
[0212] 標(biāo)記和重組酶的表達(dá)通常受控制序列調(diào)控，其中所述控制序列包括能夠使重組酶 在宿主細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子。也就是說，編碼標(biāo)記和重組酶的序列通常與啟動(dòng)子序列可操作 地連接。
[0213] 術(shù)語"可操作地連接"或其類似物在本文中被定義為下述構(gòu)型：其中控制序列被放 置在相對(duì)于DNA序列的編碼序列的恰當(dāng)位置以使控制序列指導(dǎo)mRNA或多肽的產(chǎn)生。
[0214] 術(shù)語"控制序列"在本文中被定義為包括對(duì)在體外或宿主細(xì)胞中產(chǎn)生mRNA或多肽 而言是必須的或有益的所有組分。每個(gè)控制序列相對(duì)編碼多肽的核酸序列而言可以是天然 或外源的。這種控制序列包括但不限于引導(dǎo)子（leader)、Shine-Delgarno序列、最佳的翻 譯起始序列（如Kozak，1991，J.Biol.Chem. 266:19867-19870中所述）、聚腺苷酸化序列、 原-肽序列（pro-peptidesequence)、前-原-肽序列（pre-pro-peptidesequence)、啟 動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎?dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及翻譯起始信號(hào) 和翻譯終止信號(hào)?？舍槍?duì)控制序列的特定目的而對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明中使用的優(yōu)選的優(yōu) 化控制序列是W02006/077258中描述的那些。
[0215] 術(shù)語"啟動(dòng)子"在本文中被定義為下述DNA序列：其與RNA聚合酶結(jié)合并且將聚合 酶引導(dǎo)至編碼生物化合物的核酸序列的正確下游轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶有 效地催化與編碼區(qū)的合適DNA鏈互補(bǔ)的信使RNA的組裝。術(shù)語"啟動(dòng)子"還可被理解為包 括用于在轉(zhuǎn)錄成mRNA之后的翻譯的5'-非編碼區(qū)（啟動(dòng)子和翻譯起點(diǎn)之間）、順式作用轉(zhuǎn) 錄控制元件（如增強(qiáng)子）和能與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的其它核苷酸序列。
[0216] 因此，可通過提供位于第一核酸上的啟動(dòng)子和位于第二核酸上的編碼序列以分開 標(biāo)記，從而使啟動(dòng)子和編碼序列通過重組被可操作地連接，即重組將產(chǎn)生有功能的編碼標(biāo) 記的序列。
[0217]啟動(dòng)子可以是適用于顯示轉(zhuǎn)錄活性的真核或原核宿主細(xì)胞的任何適當(dāng)?shù)膯?dòng)子 序列，其包括突變的啟動(dòng)子、截短的啟動(dòng)子和雜合的啟動(dòng)子，可以從編碼相對(duì)于細(xì)胞是同源 的（天然的）或異源的（外源的）的胞外或胞內(nèi)多肽的多核苷酸中獲得啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可 以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。通過誘導(dǎo)性啟動(dòng)子表達(dá)重組酶將允許位于位點(diǎn)特異性重組位 點(diǎn)之間的序列的外重組被控制，例如包括編碼重組酶的序列。
[0218] 啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0219] 可使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是淀粉_、纖維素_、半纖維素（比如木聚糖-和/ 或木糖_誘導(dǎo)型）、銅_、油酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可選自下述組，該組包括但不限于從 編碼以下的多核苷酸中獲得的啟動(dòng)子：A.oryzaeTAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨 酸蛋白酶、A.niger中性a-淀粉酶、A.niger酸穩(wěn)定的a-淀粉酶、A.niger或A.awamori 葡糖淀粉酶（glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖內(nèi)切酶（xlnA)或|3 -木糖苷酶（xlnD)、 T.reesei纖維二糖水解酶I(CBHI)、R.miehei脂肪酶、A.oryzae堿性蛋白酶、A.oryzae磷 酸丙糖異構(gòu)酶、A.nidulans乙酰胺酶、Fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、 FusariumvenenatumDania(W000/56900)、FusariumvenenatumQuinn(W000/56900)、 Fusariumoxysporum類膜蛋白酶蛋白酶（W096/00787)、Trichodermareesei0-葡萄糖 苷酶、Trichodermareesei纖維二糖水解酶I、Trichodermareesei纖維二糖水解酶II、T