分子制造
【專利說明】分子制造
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 合成生物學(xué)是相對新的研宄領(lǐng)域，其應(yīng)用生物化學(xué)和工程科學(xué)以設(shè)計和構(gòu)建自然 中未發(fā)現(xiàn)的新的細胞功能和體系。為了實現(xiàn)這些宏偉目標(biāo)，最重要的是簡化分子克隆工具 的設(shè)計和使用。
[0003] 發(fā)明概沐
[0004] 本文提供了通過組裝多種預(yù)制盒（pre-madecassette)來制造多種質(zhì)粒的方法， 所述盒含有相互雜交的互補末端，從而產(chǎn)生能夠被引入宿主細胞的分子的產(chǎn)生。因此，選擇 由含盒的質(zhì)粒分子構(gòu)成的具有期望特性的宿主細胞代表了超越現(xiàn)存分子克隆工具的顯著 改進。本文還提供了用于進行所述方法的試劑盒（kit)。
[0005] 附圖簡沐
[0006] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下述附圖僅用于闡釋目的。附圖不旨在以任何方式限制 本教導(dǎo)的范圍。
[0007] 圖1示意性闡釋了方法中所使用組分的一些特征。
[0008] 圖2示意性闡釋了所述方法的一種實施。
[0009] 圖3示意性闡釋了可如何組裝含5個盒的載體。
[0010] 圖4展示了示例性蛋白表達載體構(gòu)建試劑盒的一些可行組分（N-末端純化標(biāo)簽）。
[0011] 圖5展示了示例性蛋白表達載體構(gòu)建試劑盒的一些可行組分（C-末端純化標(biāo)簽）。
[0012] 圖6展示了示例性蛋白表達載體構(gòu)建試劑盒的一些可行組分（C-末端純化標(biāo)簽和 N-末端純化標(biāo)簽）。
[0013] 圖7展示了可被用于制造雙順反載體的示例性試劑盒的一些可行組分。
[0014] 圖8展示了可被用于制造蛋白相互作用篩選載體的示例性試劑盒的可行組分。
[0015] 圖9展示了可被用于制造蛋白相互作用篩選載體的另一種試劑盒的可行組分。
[0016] 圖10展示了可如何構(gòu)建含有每種可能的被選擇盒的組合的文庫。
[0017] 圖11展示了使用盒組裝方法制造Pfu噬菌體pol基因。
[0018] 圖12展示了隨機挑選的克隆的菌落PCR結(jié)果。泳道M-Ikb標(biāo)記；頂行，泳道1-16， 正確大小的pol基因（4個pol片段+載體；菌落太多無法計數(shù)）；底行，泳道1-8 (無pol 片段+載體，60個菌落）；底行，泳道9-16 (3個pol片段+載體，35個菌落）。
[0019] 圖13是概念原理證明目標(biāo)載體的示意性闡釋。
[0020] 圖14展示了用于原理證明的克隆A、B和C的限制消化。
[0021] 圖15展示了用于原理證明的克隆A、B和C的序列比對。
[0022]
[0023] 在更詳細描述示例性實施方式之前，給出下列定義以闡釋和定義說明書中所用術(shù) 語的含義和范圍。
[0024] 數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另有說明，分別地，核酸是以5'到3'方向 從左往右書寫，氨基酸序列是以氨基到羧基方向從左往右書寫。
[0025] 除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton,等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGY ANDMOLECULARBIOLOGY,第 2 版，JohnWileyandSons,NewYork(1994)，和Hale& Markham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y. (1991)向 技術(shù)人員提供了許多本文所用術(shù)語的一般含義。盡管如此，為了清楚和容易參考，下文對某 些術(shù)語進行定義。
[0026] 必須注意：當(dāng)在本文和所附權(quán)利要求中使用時，除非上下文明確指相反情況出，否 則不使用數(shù)量詞時涵蓋復(fù)數(shù)的指代物。例如，術(shù)語"盒"指一個或兩個或更多個盒，即單個盒 和多個（至少2個）盒。還應(yīng)注意：權(quán)利要求可撰寫成排除任何任選元素。因此，該陳述旨 在作為使用與權(quán)利要求元素的引述相聯(lián)系的這些排他性術(shù)語如"僅僅"、"僅"等或使用"否 定性"限制的在先基礎(chǔ)。
[0027] 術(shù)語"核苷酸"旨在包括那些不僅含有已知嘌呤和嘧啶堿基以及含有已被修飾的 其它雜環(huán)堿基的部分（moiety)。這些修飾包括甲基化的嗓呤或喃啶，?；纳み驶蜞?， 烷基化的核糖或其它雜環(huán)。此外，術(shù)語"核苷酸"包括那些包含半抗原或熒光標(biāo)記以及可以 不僅包含常規(guī)核糖和脫氧核糖的糖，也可以包含其它糖的部分。經(jīng)修飾的核苷或核苷酸也 包括對糖部分的修飾，例如，其中一個或多個羥基被鹵素原子或脂肪族基團取代，官能化為 醚、胺等。
[0028] 術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互換使用，其用于描述任意長度的聚合 物，例如，多于約2個堿基，多于約10個堿基，多于約100個堿基，多于約500個堿基，多于 1000個堿基，高達約10, 000個或更多堿基構(gòu)成的核苷酸，例如，脫氧核糖核苷酸或核糖核 苷酸，并可酶促地或合成地生產(chǎn)（例如，如美國專利號5, 948, 902和其中所引用的參考文獻 中所述的PM)，其可以與天然存在的核酸以序列特異性的方式進行雜交，該方式與兩種天 然存在的核酸雜交類似，例如，能夠參與沃森-克里克堿基配對相互作用。天然存在的核苷 酸包括鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶（分別為G、C、A、T和U)。DNA和RNA分 別具有脫氧核糖和核糖骨架，但PNA的骨架由通過肽鍵相連的重復(fù)N-(2-氨乙基）-甘氨酸 單元構(gòu)成。在PNA中，各種嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基鍵連接到骨架上。鎖核酸（LNA) (通常被稱為無法接近的RNA)是經(jīng)修飾的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被連接2' 氧和4'碳的額外橋修飾。所述橋"封鎖"了 3'-內(nèi)（北（North))構(gòu)象的核糖，這通常發(fā)現(xiàn) 于A-型雙鏈體（duplex)中。只要期望，可將LNA核苷酸與寡核苷酸中的DNA或RNA殘基 混合。術(shù)語"非結(jié)構(gòu)化核酸"或"UNA"是含有相互之間結(jié)合的穩(wěn)定性較低非天然核苷酸的 核酸。例如，非結(jié)構(gòu)化核酸可含有G'殘基和C'殘基，其中這些殘基分別對應(yīng)于G和C的非 天然存在形式（即類似物），它們穩(wěn)定性較低地相互堿基配對，但保留與天然存在的C和G 殘基堿基配對的能力。US20050233340中描述了非結(jié)構(gòu)化核酸，其中關(guān)于UNA的公開內(nèi)容通 過引用被并入本文。
[0029] 本文所使用的術(shù)語"寡核苷酸"表示長度為約2-200個核苷酸，直至500個核苷酸 的單鏈核苷酸多聚體。寡核苷酸可以是合成的或者可通過酶法制成，在一些實施方式中， 其長度為4-150個核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸單體（即，可以是寡核糖核苷酸） 或脫氧核糖核苷酸單體。例如，寡核苷酸的長度可以為10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、 61-70、71-80、80-100、100-150 或 150-200 個核苷酸。
[0030] 本文所使用的術(shù)語"引物"指在純化的限制消化物中天然存在的或者通過合成產(chǎn) 生的寡核苷酸，當(dāng)被放置在與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo)的條件下時，即存 在核苷酸和誘導(dǎo)劑（例如DNA聚合酶）且處于合適的溫度和pH時，其能夠擔(dān)當(dāng)合成起始 點。引物可以是單鏈的或雙鏈的，但必須足夠長以在誘導(dǎo)劑存在時啟動期望延伸產(chǎn)物的合 成。引物的確切長度將取決于許多因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。例如，對于診 斷應(yīng)用，取決于靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物典型地含有15-25個或更多核苷酸，但它也 可含有更少核苷酸。本文的引物被選擇為與特定靶DNA序列的不同鏈基本上互補。這意味 著：引物必需足夠互補以與它們各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序 列。例如，非互補的核苷酸片段可被連接到引物的5'末端，而引物序列的其余部分與鏈互 補?；蛘?，非互補堿基或更長序列可散布在引物中，條件是：引物序列與鏈序列足夠互補以 與其雜交并從而形成合成延伸產(chǎn)物的模板。
[0031] 術(shù)語"雜交"指的是下述過程，其中核酸鏈在正常雜交條件下與第二互補核酸鏈退 火并形成穩(wěn)定雙鏈體（同源雙鏈體或異源雙鏈體），且在相同的正常雜交條件下不與無關(guān) 的核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈體。在雜交反應(yīng)中，通過使兩條互補的核酸鏈退火來實現(xiàn)雙鏈體 的形成?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)發(fā)生的雜交條件（通常被稱為雜交嚴(yán)格性）使雜交反應(yīng)高度 特異，從而兩條核酸鏈之間的雜交將形成穩(wěn)定雙鏈體，例如在正常嚴(yán)格性條件下保留雙鏈 性（double-strandedness)區(qū)域的雙鏈體，除非兩條核酸鏈含有基本上或完全互補的一定 數(shù)目的特定序列核苷酸。對于任何給出的雜交反應(yīng)，"正常雜交或正常嚴(yán)格性條件"易于確 定。參加，例如，Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley& Sons,Inc.，NewYork，或Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold SpringHarborLaboratoryPress。本文使用的術(shù)語"雜交"指的是任何下述過程，通過所 述過程核酸鏈通過堿基配對與互補鏈結(jié)合。
[0032] 如果核酸與參考核酸序列在中度至高度嚴(yán)格性雜交和洗滌條件下特異性相互雜 交，那么可認為這兩種序列"選擇性可雜交"。中度和高度嚴(yán)格性雜交條件是已知的（參見， 例如，Ausube