一種遞送ul128復(fù)合體和預(yù)防cmv感染的mva疫苗的制作方法
【專利說明】-種遞送UL128復(fù)合體和預(yù)防CMV感染的MVA疫苗
[0001] 政府權(quán)益聲明
[0002] 本發(fā)明是由（美國）國家過敏癥和傳染病研宄所授予的批準(zhǔn)號AI063356和（美 國）國立癌癥研宄所授予的批準(zhǔn)號CA030206在（美國）政府支持下完成的。美國政府享 有本發(fā)明的一定權(quán)利。
[0003] 優(yōu)先權(quán)聲明
[0004] 本申請要求享有2012年7月27日提交的美國專利臨時(shí)申請?zhí)?1/676846的優(yōu)先 權(quán)益，在此通過引用引入其全文。
【背景技術(shù)】
[0005]巨細(xì)胞病毒（CMV)基因組很大（大于200kbp)，人類巨細(xì)胞（HCMV)編碼大于等于 165個(gè)開放閱讀框架（ORF)，其編碼的蛋白質(zhì)使它能夠感染多種細(xì)胞類型、建立潛伏期和從 潛伏期重激活，并在免疫感受態(tài)宿主維持終生的持久性（Murphy等2003;Barry&Chang 2007 ;Hansen等 2003;Jarvis&Nelson2007;Rivailler等 2006;Schleiss等 2008 ; Oxford等2008)。60 %以上的ORF對于纖維原細(xì)胞中的HCMV復(fù)制是非必要的（Dunn等 2003 ;Yu等2003)，這表明大部分HCMVORF的功能只能在非纖維原細(xì)胞的細(xì)胞中和/或在 體內(nèi)觀察到。對HCMV的更廣泛的理解應(yīng)包括涉及ORF及其相關(guān)的非纖維原細(xì)胞的細(xì)胞類 型、這些細(xì)胞在HCMV傳播中起到的作用以及適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型的使用的研宄。
[0006] 內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞（合稱，"Epi/EC"）是對于HCMV感染和傳播重要的細(xì)胞類型。 在從主要感染部位血原性傳播之后，HCMV感染對于水平傳播重要的組織的Epi/EC細(xì)胞，如 腎、唾液和乳腺（Sinzger等2008)。多項(xiàng)研宄已經(jīng)報(bào)道，在原發(fā)性感染消退之后病毒仍可分 泌于唾液和尿液中，并能分泌于連續(xù)的懷孕和哺乳期間的母乳中（Schleiss2006a;Britt 2008 ;Wang等2008 ;Mansat等1997 ;Stagno等1975)。在垂直傳播期間，HCMV從子宮血管 傳播到細(xì)胞滋養(yǎng)層祖細(xì)胞，胎盤絨毛的Epi/EC是HCMV感染的第一類胚胎細(xì)胞（Maidji等 2006 ;Maidji等2002)。因?yàn)镋pi/EC同時(shí)在水平和垂直傳播中起到重要作用，HCMV疫苗的 保護(hù)效力很可能取決于成功生成對抗預(yù)防感染該種細(xì)胞類型的抗原性HCMV蛋白的高效價(jià) 中和抗體（NAb)。
[0007] 在沒有起作用的免疫系統(tǒng)的個(gè)體中，如移植接受者、同時(shí)感染HIV的個(gè)體、或先天 感染的胎兒/新生兒中，HCMV是發(fā)病率和死亡率的重要來源。目前，還沒有已獲得批準(zhǔn)的 疫苗來預(yù)防HCMV感染和/或疾病，然而，（美國）國家科學(xué)院醫(yī)學(xué)研宄所在2000年發(fā)布了 一項(xiàng)報(bào)告，由于這種疫苗將帶來的對人類健康的改善而將HCMV疫苗的研發(fā)放在了最高優(yōu) 先級類別中。因此，研發(fā)一種針對介導(dǎo)Epi/EC和纖維原細(xì)胞感染的病毒抗原（Ags)的疫苗 將大有益處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了一種用于表達(dá)UL128復(fù)合體（UL128C;其包括 UL128、UL130、UL131A、糖蛋白H、糖蛋白L)的表達(dá)系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)可以包括一種細(xì)菌人 工染色體（BAC)構(gòu)建體，其中該BAC構(gòu)建體包括一種插入了一組編碼UL128C的DNA序列的 病毒載體。
[0009] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于預(yù)防HCMV感染的疫苗組合物。該疫苗組合 物可以包括一種能夠表達(dá)UL128C的病毒載體，和一種藥學(xué)可接受的載體、輔劑、添加劑或 其組合。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防HCMV侵入細(xì)胞的方法，該方法可包括使細(xì) 胞與有效量的病毒載體接觸，所述病毒載體包括一組編碼UL128C的DNA序列。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在某一對象中治療HCMV感染的方法。該方法可 以包括給對象施用治療有效量的HCMV疫苗，其中所述HCMV疫苗包括一種能夠表達(dá)UL128C的病毒載體和一種藥學(xué)可接受的載體、輔劑、添加劑（例如，CD40L)或其組合。
[0012] 根據(jù)以上所述的一些實(shí)施方案，該病毒載體是一種經(jīng)過改良的痘苗病毒安卡拉 (MVA)，該UL128C包括一組5種HCMV蛋白或其抗原片段：UL128、UL130、UL131A、糖蛋白 L(gL)和糖蛋白H(gH)。在一些實(shí)施方案中，該病毒載體進(jìn)一步插入一種或多種額外的DNA 序列，該序列編碼一種或多種額外的HCMV蛋白或其抗原片段，例如pp65、gB。這些額外的 蛋白既可以是細(xì)胞介導(dǎo)免疫的主要目標(biāo)，例如PP65和IEl，也可以是其他重要的刺激NAb的 侵入介質(zhì)，例如糖蛋白gB、gM、gN或g0。
【附圖說明】
[0013] 圖1是一對示意圖，闡明根據(jù)一些實(shí)施方案的基因表達(dá)盒的插入（圖1A)和RhCMV 基因在MVA-BAC中的插入位點(diǎn)（圖1B)。圖IA顯示了一種通過Enpassant誘變將痘病毒 基因表達(dá)盒插入MVA-BCA的方案。首先，產(chǎn)生了一種轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，其包括帶有上游牛痘病毒 mH5啟動(dòng)子、下游轉(zhuǎn)錄終端信號（TS)以及一個(gè)基因I-Scel限制性內(nèi)切位點(diǎn)和卡那霉素抗性 (KanK)標(biāo)記的基因序列，后兩者均側(cè)接于50bp基因復(fù)制（點(diǎn)畫框）。該構(gòu)建體隨后通過PCR 擴(kuò)增并利用同源的50bp引物延伸，通過Red重組插入MVA-BAC。接著，通過在I-Scel位點(diǎn) I-Scel表達(dá)介導(dǎo)的雙鏈斷裂的引入和隨后的50bp基因復(fù)制的第二次Red重組，將1(&1^篩 選標(biāo)記無縫移除。圖IB顯示了插入位點(diǎn)（Del2、IGR3、G1L/18R，BAC⑶載體結(jié)束于Del3) 和在MVA-BAC中的RhCMV基因UL128、UL130、UL131A、gL和gH或gHATM的方向。插入順 序由數(shù)字1-5表示。
[0014] 圖2顯示蛋白質(zhì)印跡法（WBs)用兔多克隆抗血清檢測從MVA表達(dá)的RhUL128C亞 基的共表達(dá)。圖2A顯示感染了MVA-RhUL128C或MVA-RhUL128CA的BHK細(xì)胞的總細(xì)胞裂 解物的WB分析。圖2B顯示CEF細(xì)胞總細(xì)胞裂解物的WB分析，該CEF細(xì)胞感染了表達(dá)不同 的RhUL128-UL131A亞基組合的MVA或感染了MVA-RhUL128C或MVA-RhUL128CA。未受感染 的或MVA-感染的細(xì)胞被用作陰性對照。作為上樣對照，裂解物用對于牛痘病毒BR5蛋白有 特異性的單克隆抗體19C2進(jìn)行分析。標(biāo)記物蛋白大小以千道爾頓（kD)給出。
[0015] 圖3顯示W(wǎng)Bs檢測MVA-RhUL128C在BHK細(xì)胞上繁殖期間（5次病毒傳代）的 RhUL128、RhUL130、RhUL131A、RhgL和RhgH的表達(dá)。用對應(yīng)于每個(gè)RhCMV基因的肽特異性 兔多克隆抗血清分析5代不同的病毒傳代（P1-P5)的總細(xì)胞裂解物。作為上樣對照，裂解 物用對于牛痘病毒BR5蛋白有特異性的單克隆抗體19C2進(jìn)行分析。用感染MVA的和未感 染的BHK細(xì)胞作為對照。
[0016] 圖4顯示W(wǎng)Bs檢測在由MVA_RhUL128A表達(dá)的RhgHATM的免疫沉淀之后的 RhgHATM與RhUL128C亞基的免疫共沉淀。感染了MVA-RhUL128CA的BHK細(xì)胞的裂解物用 于與蛋白質(zhì)A/G瓊脂糖和小鼠單克隆抗c-myc標(biāo)記的抗體或無關(guān)的IgG對照抗體的免疫沉 淀。該免疫沉淀樣本之后用特異于每個(gè)獨(dú)立亞基的兔多克隆抗血清通過WB進(jìn)行分析。感 染MVA的BHK細(xì)胞作為對照進(jìn)行分析。
[0017] 圖5說明根據(jù)由MVA表達(dá)的RuUL128C亞基表達(dá)的RhgHATM的分泌物。細(xì)胞的或 根據(jù)單表達(dá)、與1^^1的共表達(dá)或與1^^1和1^見128-見13認(rèn)的共表達(dá)分泌的1^^1^了1和 RhgH的WBs。CEF細(xì)胞在MOI為0. 1時(shí)被感染，并在無血清培養(yǎng)基（VP-SFM)中生長36-48 小時(shí)，細(xì)胞裂解物和濃縮培養(yǎng)基用多克隆抗血清分析。分析了非重組MVA作為對照。分析 了牛痘病毒BR5蛋白作為上樣對照。相對條帶強(qiáng)度由每個(gè)泳道下的數(shù)字給出。
[0018] 圖6顯示在RhCMV攻擊前的接種疫苗的RM中的NAb的體外測量。所示A和B是， 對指出的疫苗組疫苗接種（Vx)2周（A)和6周（B)后在猴子的腎臟上皮細(xì)胞（MKE)上測量 的NT50效價(jià)。所示C和D是疫苗接種2周（C)和6周（D)后在纖維原細(xì)胞（Telo-RF)上 測量的NT50效價(jià)。給出的在Telo-RF上測量的接種MVA-RhgB-或MVA-venus的RM的數(shù)值 之前已經(jīng)公開（1)(星號）。中位值由柱狀圖給出。在自然受感染的猴子的MKE或Telo-RF 上測量的標(biāo)準(zhǔn)NT50范圍由虛線表示。箭頭標(biāo)出了化驗(yàn)的檢測極限。將MVA-RhUL128C疫 苗組和MVA-RhUL128CA疫苗組或其它某一個(gè)疫苗組（RhUL128、RhUL130、RhUL128/UL130/ UL131、RhgB、venus)對比的p值，通過單側(cè)秩和檢驗(yàn)計(jì)算得到。C圖中將MVA-RhUL128C或 MVA-RhUL128CA疫苗組與MVA-RhgB疫苗組對比的p值，通過雙側(cè)秩和檢驗(yàn)計(jì)算得到。 [0019]圖7顯示接種了疫苗的RM的血漿中的RhCMV攻擊病毒的病毒載量。所示的是攻 擊16周后在接種了MVA-RhUL128CA、MVA-RhUL128C的RM和未接種一秒的對照動(dòng)物的血漿 中可檢測到的基因組拷貝數(shù)的曲線下的面積。每組的AUC中位值由實(shí)線標(biāo)出。疫苗組和非 疫苗對照組之間的P值通過單側(cè)秩和檢驗(yàn)計(jì)算得到。
[0020] 圖8顯示來自MVA的人UL128C(U-UL128C)亞基的表達(dá)。所示的是在表達(dá)MVA的 HCMVUL128C亞基抗原的獨(dú)立泳道中的全細(xì)胞提取物的結(jié)果。利用UCMV特異性mAb(gH、 UL128、UL130)和來自H-UL128C特異性肽的在兔子中制得的多克隆血清（UL131A，gL)完成 在SDS-PAGE后對PVDF膜上蛋白的檢測。CEF=小雞胚胎纖維原細(xì)胞，BR5 =mAb對抗MVA 內(nèi)源性蛋白質(zhì)作為上樣對照。
[0021] 圖9顯示由MVA表達(dá)的HCMV UL128C亞基的免疫共沉淀。感染了MVA-UL128C的 BHK細(xì)胞的裂解物被用于gH和小鼠單克隆抗體抗HCMV-gH14-4b或偶聯(lián)到蛋白質(zhì)A/G瓊 脂糖的不相關(guān)的對照抗體的免疫沉淀。然后，通過WB用抗HCMV-gH(克隆AP86)、UL128或 UL130的小鼠單克隆抗體和抗HCMV的gL或UL131的兔多克隆抗血清（如所示）分析免疫 沉淀的蛋白。
[0022] 圖10是一張生成自剪切的MVA-BAC的示意圖。首先，包括氯霉素抗性標(biāo)記（CMk)、 mini-F復(fù)制子和由牛痘病毒Pll啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)盒的BAC載體，通過在CEF中的重 組被插入MVA胸苷激酶（TK)位點(diǎn)。其后，重組基因組克隆在大腸桿菌中拯救（rescue)，并 且逆基因組復(fù)制通過2步基于Enpassant誘變的Red重組插入到BAC載體中。在BAC轉(zhuǎn) 染入MVA受納細(xì)胞后，BAC載體序列通過基因組復(fù)制的切除重組去除。
[0023] 圖11說明來自MVA的HCMV插入片段的表達(dá)，該MVA由1974-MVA-BAC重新構(gòu)建。 在圖IlA中，紅色熒光蛋白（RFP)的表達(dá)通過BHK-21細(xì)胞的單一病毒斑塊熒光顯微顯示， 該細(xì)胞感染了在Del2、IGR或GlL插入位點(diǎn)包含mRFP表達(dá)盒的MVA。由于BAC載體構(gòu)建， MVA也表達(dá)GFP(圖右側(cè)）。在圖IlB中，蛋白質(zhì)印跡法分析CE