專利名稱：抗Cry1Ac毒素單鏈抗體的編碼基因及免疫PCR檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗CrylAc毒素單鏈抗體的編碼基因，以及運(yùn)用其翻譯、表達(dá)的活性多肽結(jié)合該基因進(jìn)行免疫PCR檢測CrylAc毒素的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌{Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種在自然界廣泛分布的需氧型革蘭氏陽性細(xì)菌。其分泌的CrylAc毒素對(duì)鱗翅目害蟲的毒殺效果很好，目前已成為廣泛使用的生物殺蟲劑，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，使其更大規(guī)模地用于防治農(nóng)業(yè)害蟲。為了滿足廣大消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，以及出于國際貿(mào)易的需要，對(duì)于轉(zhuǎn)Bt基因植物環(huán)境安全性評(píng)價(jià)和標(biāo)識(shí)管理的研究急需發(fā)展快速有效的檢測技術(shù)作為支持?，F(xiàn)階段圍繞Bt毒素安全檢測監(jiān)控評(píng)價(jià)技術(shù)已經(jīng)有了突出的進(jìn)展。生物測定法、免疫檢測法(如協(xié)同凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附、Western-blot、試紙條法、蛋白生物芯片等)、核酸檢測法、儀器檢測法(如流式細(xì)胞儀、電泳、質(zhì)譜等)均有研究報(bào)道，上述方法在毒素的毒力鑒定和安全檢測中發(fā)揮了較好的作用。噬菌體抗體技術(shù)是將抗體基因片段與噬菌體外殼蛋白基因拼接后插入到噬菌體載體中，抗體與外殼蛋白氨基端融合展示在噬菌體顆粒表面，并保持獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。用卩遼菌體抗體技術(shù)可以制備出單鏈抗體(Single-chain variable fragments,scFv)，該抗體由連接肽將重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)拼接而成，其具有親代抗體全部特異性，是保持結(jié)合能力的最小結(jié)構(gòu)單位，大小為完整IgG分子的1/6。目前，利用噬菌體展示技術(shù)篩選制備抗Bt毒素的單鏈抗體或多肽的研究，已有少量報(bào)道。2009年申請(qǐng)人曾在《細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志》上報(bào)導(dǎo)了用Tomlinson抗體庫篩選抗CrylAc單鏈抗體的方法,但是該篩選方法容易產(chǎn)生假陽性，且當(dāng)時(shí)篩選出的抗體并未做相關(guān)的應(yīng)用。1992年Sano首創(chuàng)了免疫-PCR法，其本質(zhì)是以PCR擴(kuò)增DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來放大抗原抗體結(jié)合率的改良型ELISA方法。傳統(tǒng)ELISA用顏色反應(yīng)來表明陰性或陽性結(jié)果或根據(jù)顏色深淺判斷待測物的含量，而免疫PCR由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量，該方法將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)核酸的檢測，因此更為靈敏。而針對(duì)CrylAc的單鏈抗體的核酸序列以及利用噬菌體單鏈抗體進(jìn)行免疫PCR檢測CrylAc的方法并未見報(bào)道。因此該研究具有較好的理論研究價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，針對(duì)傳統(tǒng)單抗、多抗制備需要免疫動(dòng)物，過程較繁瑣，利用噬菌體抗體庫技術(shù)簡化了制備抗體的過程，結(jié)合競爭洗脫可以提高篩選效率。本發(fā)明提供了一種抗-CrylAc單鏈抗體的基因及運(yùn)用噬菌體抗體進(jìn)行免疫PCR檢測CrylAc的方法，解決·了傳統(tǒng)抗體進(jìn)行免疫PCR過程中需要標(biāo)記DNA報(bào)告分子的難題。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種抗CrylAc毒素的單鏈抗體的編碼基因，其特征在于所述的單鏈抗體的編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)所示1)其核酸序列是序列表中SEQID No. I所不DNA分子；
2)與I)限定的DNA序列雜交并編碼所述單鏈抗體的DNA分子；
3)與序列表中SEQID No. I自5’端起第27-821位核酸具有90%以上的同源性且編碼所述抗CrylAc毒素單鏈抗體的DNA分子。本發(fā)明所述編碼基因翻譯的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示及該活性多肽。本發(fā)明所述的活性多肽，是將抗CrylAc毒素的單鏈抗體的編碼基因與噬菌粒載體拼接并導(dǎo)入宿主菌培養(yǎng)獲得。 一種CrylAc毒素的免疫PCR檢測方法，其特征在于檢測抗體為權(quán)利要求3所述 的活性多肽；檢測DNA為權(quán)利要求I所述的編碼核酸序列。在所述的CrylAc毒素的免疫PCR檢測方法中它包括下列步驟
A、PCR管預(yù)處理
采用戊二醛溫育法處理聚乙烯PCR管；
B、優(yōu)化融合型單鏈抗體添加量；
融合型單鏈抗體以IO8 pfu/mL為添加濃度；
C、免疫-PCR步驟
1)加入50UL包被抗原CrylAc ；
2)洗滌，加入封閉液；
3)洗滌，加入融合型單鏈抗體上清液；
4)洗滌；
5)進(jìn)行PCR檢測。所述的免疫-PCR檢測是指定性或定量檢測CrylAc毒素，其中定性是UV檢測；定量檢測是測定熒光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測物的含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
I)獲得抗-CryIAc單鏈抗體的基因及氨基酸序列，傳統(tǒng)的抗體制備不易獲得抗體的編碼序列。2)首次將融合型單鏈抗體表現(xiàn)型和基因型統(tǒng)一的特點(diǎn)運(yùn)用于免疫PCR方法檢測CrylAc毒素，該方法與傳統(tǒng)的ELISA相比，檢測信號(hào)高；與傳統(tǒng)免疫PCR方法相比避免了報(bào)告DNA標(biāo)記的過程，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，降低了成本。


圖I是免疫PCR定性檢測結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物通過I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1-7分別為O. 5，1,2,4,8,16，32 ng/mL的CrylAc對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是免疫PCR熒光定量測定CrylAc的曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例I.抗-CrylAc單鏈抗體的篩選
本發(fā)明在親和篩選過程中，所用的人源半合成抗體庫(Tomlinson J)含有的單鏈抗體基因是被插入在噬菌粒PIT2中，單鏈抗體表達(dá)時(shí)與PIII蛋白一起融合表達(dá)在噬菌體衣殼蛋白上，為融合型單鏈抗體。將4 mL 100 μ g/mL無關(guān)蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部4 °C過夜。次日用2%MPBS封閉后加入噬菌體抗體庫溶液，室溫孵育2 h，將上清液轉(zhuǎn)移至包被有CrylAc并封閉好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，室溫孵育2 h，用含O. 5% Tween-20的PBS洗去未結(jié)合或結(jié)合活性不高的重組噬菌體(第I輪洗10次，以后每輪增加10次)。結(jié)合力較高的先加入200 μ L 100 μ g/mL的CrylAc溶液,洗脫30 min (逐輪降低洗脫濃度,每一輪減少25 μ g/mL);之后用胰蛋白酶洗脫10 min。洗脫后侵染處于對(duì)數(shù)生長期的TGl細(xì)胞，取10 μ L梯度稀釋測定cfu。剩余的用2 X TY-AG培養(yǎng)，經(jīng)Ml3超感染，2 X TY-AKG培養(yǎng)過夜。次日離心回收上清，用PEG/NaCl沉淀，得到重組噬菌體抗體次級(jí)庫。重復(fù)三次。實(shí)施例2.陽性克隆鑒定及序列測定
從第三輪和第四輪篩選的計(jì)數(shù)平板中隨機(jī)挑取單菌落分別接種至200 μ L/孔 2 X TY-AG培養(yǎng)基的96微孔板中，37 1下250 rpm培養(yǎng)過夜，次日從每孔中吸取2 μ L菌液對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)接至加有200 μ L/孔2 X TY-AG培養(yǎng)基的96微孔板中，37 °C, 250 rpm條件下培養(yǎng)2 h。重新接種的微孔板培養(yǎng)2 h后，加入25 UL 2 X TY-AG培養(yǎng)基添加IO9 pfu輔助噬菌體，繼續(xù)于37 V 250 rpm培養(yǎng)I h,最后于I 800 條件下離心10 min,棄去上清。菌體沉淀則重新懸浮至200 UL 2 X TY-AK培養(yǎng)基中，并于30 °C >250 rpm條件下培養(yǎng)過夜。次日，于1800 g條件下離心10 min后取上清液按照如下操作進(jìn)行Phage-ELISA
①包被每孔100 μ L，5
μ g/mL CrylAc包被96微孔板過夜。②封閉PBST洗板三次后，每孔加入200 μ L 2%的MPBS于室溫條件下靜置孵育2 h進(jìn)行封閉。③加樣PBST再次洗板三次后，每孔加入50 μ L上述上清液和50 μ L 2%的MPBS
于室溫條件下靜置孵育I h。④加酶標(biāo)二抗傾去噬菌體溶液，PBST洗板三次后每孔加入100 μ L 1:5000倍稀釋的HRP-抗Ml3抗體，室溫孵育I h。⑤顯色PBST洗板三次后，每孔加入100 μ L TMB底物溶液并于室溫下反應(yīng)10_20min至出現(xiàn)藍(lán)色，最后每孔加入50 μ L濃度為2 M的H2SO4快速終止反應(yīng)，藍(lán)色變?yōu)辄S色后用酶標(biāo)儀測定0D·。當(dāng)所選取的克隆在CrylAc抗原包被孔和無關(guān)抗原包被反應(yīng)孔的讀數(shù)比值大于3時(shí)，定義此克隆為陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行核酸序列測定，測序引物如下
LMB3 : CAGGAA ACAGCT ATGAC pHEN CTA TGC GGC CCC ATT CA
結(jié)合ELISA鑒定和測序結(jié)果選取結(jié)合率最高的一株陽性克隆。單鏈抗體編碼基因如序列表中SEQ ID No. I所示，序列如下
AATTCTATTT CAAGGAGACA GTCATAATGA AATACCTATT GCCTACGGCA GCCGCTGGAT 60TGTTATTACT CGCGGCCCAG CCGGCCATGG CCGAGGTGCA GCTGTTGGAG TCTGGGGGAG 120
HCDRl
GCTTGGTACA GCCTGGGGGG TCCCTGAGAC TCTCCTGTGC AGCCTCTGGA TTCACCTTTA 180GCAGCTATGC CATGAGCTGG GTCCGCCAGG CTCCAGGGAA GGGGCTGGAG TGGGTCTCAA 240
HCDR2
CTATTGGTAA TGCTGGTTAT AGTACATATT ACGCAGACTC CGTGAAGGGC AGGTTCACCA 300TCTCCAGAGA CAATTCCAAG AACACGCTGT ATCTGCAAAT GAACAGCCTG AGAGCCGAGG 360
HCDR3
ACACGGCCGT ATATTACTGT GCGAAAGGTG CTGCTTCTTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA 420
Linker
CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC GGTGGAGGCG GTTCAGGCGG AGGTGGCAGC GGCGGTGGCG 480GGTCGACGGA CATCCAGATG ACCCAGTCTC CATCCTCCCT GTCTGCATCT GTAGGAGACA 540
LCDRl
GAGTCACCAT CACTTGCCGG GCAAGTCAGA GCATTAGCAG CTATTTAAAT TGGTATCAGC 600
LCDR2
AGAAACCAGG GAAAGCCCCT AAGCTCCTGA TCTATGCTGC ATCCACTTTG CAAAGTGGGG 660TCCCATCAAG GTTCAGTGGC AGTGGATCTG GGACAGATTT CACTCTCACC ATCAGCAGTC 720
LCDR3
TGCAACCTGA AGATTTTGCA ACTTACTACT GTCAACAGGC TGCTAGTTCT CCTACTACGT 780(His)6
TCGGCCAAGG GACCAAGATG GAAATCAAAC GGGCGGCCGC ACATCATCAT CACCATCACG 840GGGCOGCAGA ACA853
該序列自第3位至第851位為編碼單鏈抗體的核酸序列。重鏈可變區(qū)為27-440位，其中 HCDRl 區(qū)為 168-191 位，HCDR2 區(qū)為 243-269 位，HCDR3 區(qū)為 384-394 位，連接肽為 441-485位,輕鏈可變區(qū)為486-821位，其中LCDRl區(qū)為555-587位，LCDR2區(qū)為633-653位，LCDR3區(qū)為732-758位，組氨酸標(biāo)簽為822-839位。所述與第27-821位核酸具有90%以上的同源性且編碼所述抗CrylAc毒素單鏈抗體的DNA分子，是指在重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)中的CDRl和/或CDR2和/或CDR3，6個(gè)CDR區(qū)中每個(gè)都不能超過15個(gè)核酸的取代和/或缺失和/或添加和/或多個(gè)CDR區(qū)中核酸的取代和/或缺失和/或添加個(gè)數(shù)累積不超過15個(gè)。其翻譯的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。
Phe Tyr Phe Lys Glu Thr Val He Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr AlaI51015
Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val202530
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 354045
HCDRl
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
權(quán)利要求
1.一種抗CrylAc毒素的單鏈抗體的編碼基因，其特征在于所述的單鏈抗體的編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)所示 1)其核酸序列是序列表中SEQID No. I所示的DNA分子； 2)與I)限定的DNA序列雜交并編碼所述單鏈抗體的DNA分子； 3)與序列表中SEQID No. I自5’端起第27-821位核酸具有90%以上的同源性且編碼所述抗CrylAc毒素單鏈抗體的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述編碼基因翻譯的氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示及對(duì)應(yīng)的活性多肽。
3.一種制備權(quán)利要求2所述的活性多肽，是將權(quán)利要求I的編碼基因與噬菌粒載體拼接并導(dǎo)入表達(dá)宿主菌培養(yǎng)獲得。
4.一種CrylAc毒素的免疫PCR檢測方法，其特征在于檢測抗體為權(quán)利要求3所述的活性多肽；檢測DNA為權(quán)利要求I所述的編碼核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的CrylAc毒素的免疫PCR檢測方法，其特征在于，其包括下列步驟 A、PCR管預(yù)處理 采用戊二醛溫育法處理聚乙烯PCR管； B、優(yōu)化融合型單鏈抗體添加量； 融合型單鏈抗體以IO8 pfu/mL為添加濃度； C、免疫-PCR步驟 1)加入50UL包被抗原CrylAc ； 2)洗滌，加入封閉液； 3)洗滌，加入融合型單鏈抗體上清液； 4)洗滌； 5)進(jìn)行PCR檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的CrylAc毒素的免疫PCR檢測方法，其特征在于免疫-PCR檢測是指定性或定量檢測，其中定性檢測是瓊脂糖凝膠電泳檢測取2μ L產(chǎn)物上樣，電泳·25 min, UV檢測；定量檢測是在上游引物5’修飾FAM熒光基團(tuán)，經(jīng)PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物在黑色96孔板中用多功能微孔板測定儀檢測，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗Cry1Ac單鏈抗體的編碼序列及噬菌體單鏈抗體檢測Cry1Ac的免疫PCR方法。本發(fā)明從天然噬菌體抗體庫中淘選獲得單鏈抗體(scFv)，其特征在于此單鏈抗體的特異性是由其重鏈、輕鏈可變區(qū)序列中CDR區(qū)序列決定。免疫PCR結(jié)果顯示用熒光檢測體系可以對(duì)Cry1Ac進(jìn)行定量檢測，檢測范圍在0.2-100ng/mL之間。本方法快速簡單，具有較高的靈敏度，并且避免了傳統(tǒng)免疫PCR過程中標(biāo)記報(bào)告DNA分子的步驟，更簡化了實(shí)驗(yàn)操作，具有潛在的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102936598SQ20121047469
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者王耘, 劉賢金, 張存政, 劉媛, 王淮慶 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院