一種定量檢測b型鈉尿肽的試劑盒及b型鈉尿肽的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測B型鈉尿肽的試劑盒，還 涉及利用該試劑盒的B型鈉尿肽的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]B型鈉尿肽（Btypenatriureticpeptide,BNP)是心衰的標(biāo)志物，與充血性心力 衰竭有密切關(guān)系，其主要來源于心室肌細(xì)胞，左心室容量或壓力負(fù)荷的增加是刺激BNP分 泌與釋放的主要因素，BNP水平的增高已被視為心功能衰竭程度和慢性心力衰竭患者病死 率的一個獨立的預(yù)后指標(biāo)。因而BNP成為當(dāng)前國際上心血管疾病研究的熱點之一。
[0003] 目前，檢測BNP主要有放射免疫法（RIA)、高靈敏度的免疫放射法（IRMA)、酶免疫 法（EIA)、微粒子酶免疫法(MEIA)、免疫熒光法（FIA)等。RIA法有放射性污染，而IRMA法 費時費力，自動化程度不高。目前國內(nèi)外常用的實驗室檢測方法是電化學(xué)發(fā)光法，該方法結(jié) 果精準(zhǔn)，但是不能快速提供檢查結(jié)果。
[0004]目前，關(guān)于BNP快速診斷試劑盒的研制處于起步階段，其中獲得抗BNP的抗體或多 肽、并采用合適的方法將其應(yīng)用于檢測是制備BNP快速診斷試劑盒的關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測B型鈉尿肽的試劑盒，能夠快速、準(zhǔn)確的定 量檢測BNP，特異性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明還提供了使用該試劑盒的BNP的檢測方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是： 一種定量檢測B型鈉尿肽的試劑盒，其包括免疫磁珠和雙抗體夾心熒光免疫ELISA試 劑盒，所述雙抗體夾心熒光免疫ELISA試劑盒包括抗體B型鈉尿肽的單克隆抗體及免疫熒 光ELISA緩沖液。
[0007] 進(jìn)一步的，所述免疫磁珠為抗B型鈉尿肽的多克隆抗體通過鏈霉親和素-生物素 偶聯(lián)納米磁微粒制備。
[0008] 進(jìn)一步的，所述多克隆抗體由B型鈉尿肽多肽段aar6_18,aarl〇-22和aarll-26 混合免疫兔子得到的抗體混合物。
[0009] 進(jìn)一步的，所述免疫磁珠的制備方法為：將B型鈉尿肽偶聯(lián)KLH作為抗原免疫新西 蘭大白兔，所得抗B型鈉尿肽血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，待用；采用活潑酯的方法，將 180nm磁珠與鏈霉親和素偶聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化多抗與鏈霉親和素磁珠 連接制成鏈霉親和素免疫磁珠，具體為：洗滌磁珠后，依次加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和 二氯乙烷，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)，37°C活化2h;將活化后的磁珠與鏈霉親和素 偶聯(lián)，獲得的鏈霉親和素磁珠，再將其與待用的抗B型鈉尿肽血清置于混勻儀上偶聯(lián)，形成 免疫磁珠，4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0010] 進(jìn)一步的，雙抗體夾心熒光免疫ELISA試劑盒的一抗和二抗通過多肽合成的B型 鈉尿肽偶聯(lián)KLH作為抗原免疫BALB/c雌性6周齡健康小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀 釋法制備和篩選得到；一抗亞型是IgGl，親和力常數(shù)在1X101(]L/mol，效價為20. 48萬，特 異性良好；二抗選用選用堿性磷酸酶標(biāo)記，二抗亞型是IgG2a，親和力常數(shù)在1X101(]L/mol， 特異性良好，并且一抗和二抗經(jīng)相加試驗計算相加指數(shù)AI=98. 6%。
[0011] 進(jìn)一步的，所述一抗的包被緩沖液為〇? 01MPBS，pH7. 2,包被濃度為2. 5yg/mL。
[0012] 進(jìn)一步的，所述二抗與堿性磷酸酶標(biāo)記摩爾比例為4 :1。
[0013] 進(jìn)一步的，酶標(biāo)二抗的濃度為1. 65yg/mL，或1. 8yg/mL，優(yōu)選1. 8yg/mL。
[0014] 一種抗B型鈉尿肽的檢測方法，其選用所述試劑盒。
[0015] 進(jìn)一步的，其步驟為：將待測樣品加入免疫磁珠中，洗脫得到上清液；取上清液加 入包被有一抗的酶標(biāo)板孔內(nèi)，45°C溫育30min;洗板，加入酶標(biāo)二抗，45°C溫育20min;洗板， 加入熒光底物，45°C溫育lOmin;熒光檢測儀檢測、讀數(shù)并計算待測樣品的B型鈉尿肽含量。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于，將納米免疫磁珠分離技術(shù)與化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合， 通過納米磁珠偶聯(lián)多抗，形成免疫磁珠進(jìn)而來富集捕獲樣品中B型鈉尿肽，再將捕獲的B 型鈉尿肽進(jìn)行基于雙抗體夾心原理的免疫熒光ELISA，本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測準(zhǔn)確度高、特 異性強(qiáng)、自動化程度高，而且為高通量檢測，96個血樣只需90min即可檢出，其靈敏度可達(dá) 9pg/mL。本發(fā)明選用三段抗原混合免疫兔子得到抗體，其多抗的免疫位點多樣，提高了捕獲 的特異性和效率；本發(fā)明合成的ELISA-抗和酶標(biāo)二抗相加指數(shù)AI=95. 8%，兩株抗體所結(jié) 合抗原的不同構(gòu)象表位且距離很遠(yuǎn)，特別適合于本發(fā)明雙抗體夾心ELISA過程，能夠大大 提尚檢測的靈敏度。
[0017] 因此，本發(fā)明試劑盒和檢測方法特別很適于快速篩查B型鈉尿肽，具有廣泛的應(yīng) 用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為檢測BNP不同濃度與0D值的關(guān)系示意圖； 圖2為雙抗夾心免疫熒光ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實施方式】
[0019] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面將結(jié)合本發(fā)明實施 例中的附圖和【具體實施方式】，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然， 所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施 例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于 本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020] 實施例1定量檢測B型鈉尿肽的試劑盒 一、免疫磁珠的制備及捕獲B型鈉尿肽檢測 1、納米免疫磁珠的制備 (1)抗體的制備與純化：以B型鈉尿肽多肽段aar6-18,aarl〇-22和aarll-26混合免 疫免疫6周齡健康BALB/c雌性小鼠，按常規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀釋法制備和篩選單克隆 抗體細(xì)胞株，進(jìn)而將抗B型鈉尿肽的特異性抗體細(xì)胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹 水，所得腹水經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行抗體純化；同樣的免疫抗原免疫新西蘭大白兔，所 得抗B型鈉尿肽血清經(jīng)硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化，所得多克隆抗體保存于-80度待用。
[0021] (2)納米磁珠與抗體的偶聯(lián)：采用活潑酯的方法，將鏈霉親和素與180nm磁珠偶 聯(lián)獲得鏈霉親和素磁珠，采用生物素化抗體與鏈霉親和素磁珠連接制成鏈霉親和素免疫磁 珠。取10mg磁珠依次用無水乙醇，依次用lmol/LNaOH，lmol/LHC1各洗滌1次，用PB緩 沖液（0? 02mol/L，pH4. 0)洗5次，MES緩沖液（0? 05mol/L，pH6. 0)重懸。依次加入N-羥基 硫代琥珀酰亞胺（NHSS) 0. 4mg，二氯乙烷（EDC) 0. 35mg，置于混勻儀上保持磁珠懸浮狀態(tài)， 37°C活化2h。將每mg活化磁珠與200yg鏈霉親和素偶聯(lián)；獲得的鏈霉親和素磁珠，按每 mg磁珠加入80mg生物素化多克隆抗體置于混勻儀上37°C偶聯(lián)30min。磁力架回收磁珠， PB洗滌 3 次，lOmLPBS(含 0? 05g/100mLNaN3,0. 5g/100mLBSA，pH7. 4)重懸免疫磁珠并于 4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0022] 二、免疫熒光ELISA試劑盒的制備 1、 以多肽合成的B型鈉尿肽偶聯(lián)KLH作為抗原免疫BALB/c雌性6周齡健康小鼠，按常 規(guī)的雜交瘤技術(shù)和極限稀釋法制備和篩選單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)而將抗B型鈉尿肽的特異 性抗體細(xì)胞株增殖培養(yǎng)，注射到小鼠體內(nèi)制備腹