一種檢測胰腺癌相關(guān)多肽dap44的elisa試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗腫瘤技術(shù)領(lǐng)域，涉及一對經(jīng)抗體配對實驗篩選的胰腺癌相關(guān)多肽 DTNBPlAssociatedPeptide44 (DAP44)單克隆抗體，及上述單克隆抗體制備的ELISA檢測 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺位于上腹部，屬腹膜后器官，解剖位置隱蔽，周圍緊鄰胃、十二指腸、肝、脾、腎 等重要器官。胰腺癌起病隱匿，缺少典型的早期臨床癥狀，早期便直接向胰周侵犯或經(jīng)淋巴 管和/或血管向遠(yuǎn)近器官組織轉(zhuǎn)移。因此，大部分胰腺癌患者確診時已為晚期，失去了根治 性手術(shù)切除和放射治療的胰腺癌的機(jī)會。當(dāng)前，我國胰腺癌的發(fā)病率正以驚人的速度持續(xù) 上升。研究證實，胰腺癌的早期診斷是提高胰腺癌病人治療效果和生存率的關(guān)鍵所在。而 腫瘤標(biāo)志物是目前用于胰腺癌臨床篩查和預(yù)測的主要依據(jù)。但目前能用于胰腺癌特異性診 斷的腫瘤標(biāo)志物尚不多，其中最常用的是CA19-9,但本身也存在假陽性和假陰性等局限，對 直徑<2cm的小胰腺癌診斷陽性率僅為30 %-40 %，而進(jìn)展期可達(dá)80 %-90 %。因此，篩選 新的胰腺癌特異性腫瘤標(biāo)志物并應(yīng)用于臨床檢測具有重要的意義。
[0003] 本研究前期收集了胰腺癌病人術(shù)前術(shù)后血清，經(jīng)高效色譜分選和蛋白質(zhì)譜檢 測，發(fā)現(xiàn)了一種胰腺癌相關(guān)糖蛋白，在胰腺癌病人術(shù)前血清中高表達(dá)而術(shù)后血清中表達(dá) 下降，經(jīng)測序確定其氨基酸序列與DTNBP1高度同源，命名為DTNBPlAssociatedP印tide 44(DAP44)，可能是一種胰腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。同時設(shè)計并制備了DAP44單克隆抗體， 經(jīng)抗體配對實驗篩選了兩株特異性強(qiáng)、敏感性高的單克隆抗體及雜交瘤細(xì)胞株。本研究在 前期基礎(chǔ)上制備DAP44ELISA檢測試劑盒，并應(yīng)用于胰腺癌的臨床檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測胰腺癌相關(guān)多肽DAP44的ELISA試劑盒，該ELISA 試劑盒對胰腺癌患者的檢測具有很好的敏感性。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種檢測胰腺癌相關(guān)多肽DAP44的ELISA試劑盒，包括：特 異性DAP44抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)試劑、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、顯色劑A液、顯色劑B 液、終止液、DAP44標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。
[0006] 酶標(biāo)板上的單克隆抗體由保藏號為CCTCCC201564的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生，酶標(biāo)試 劑中的單克隆抗體由保藏號為CCTCCC201565的另一株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
[0007] 酶標(biāo)試劑包含5. 8g/L磷酸氫二鈉、0? 593g/L磷酸二氫鈉、8.Og/L氯化鈉、200ml/L 小牛血清、0. 5ml/LProclin-300和0. 4mg/L辣根過氧化物酶標(biāo)記的胰腺癌相關(guān)抗原DAP44 單克隆抗體。
[0008] 洗滌緩沖液（PH7. 4 0? 15MPBS) :KH2P040 . 2 克，Na2HP04 ? 12H20 2. 9 克，NaCl8. 0 克，KC1 0? 2 克，Tween- 200. 05% 0? 5ml，加蒸餾水至 1000ml。
[0009] 樣品稀釋液：牛血清白蛋白（BSA)O. 1克，加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血 清等與洗滌液配成5~10%使用。
[0010] 顯色劑A液為H202,顯色劑B液為TMB。
[0011] 終止液為 2MH2S04。
[0012] DAP44ELISA試劑盒的制備方法：
[0013] (1)酶標(biāo)板包被：用純化的保藏號為CCTCCC201564的抗DAP44抗體包被96孔板 (12X8)酶標(biāo)板，并封閉、拋光。
[0014] (2)酶標(biāo)記抗體的制備：用辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記 保藏號為CCTCCC201565的抗DAP44單克隆抗體；
[0015] DAP44ELISA試劑盒的使用方法：
[0016] (1)加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本至相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，使標(biāo)準(zhǔn)品或樣本中的DAP44分子 與酶標(biāo)板中的抗體充分結(jié)合，洗去未結(jié)合的雜質(zhì)；
[0017] (2)加入酶標(biāo)試劑，使已結(jié)合的DAP44與HRP標(biāo)記的DAP44單克隆抗體結(jié)合，洗去 未結(jié)合酶標(biāo)抗體；
[0018] (3)加入顯色劑A、B液，充分混勻，終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測0D值。
[0019] 本發(fā)明利用前期合成和篩選的一對高效特異DAP44單克隆抗體，制備了ELISA檢 測試劑盒。
[0020] 本發(fā)明采用雙抗體夾心ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被DAP44抗體，血清樣本中的 DAP44結(jié)合固定在酶標(biāo)板微孔表面的抗體，加入HRP偶聯(lián)DAP44抗體后，形成抗體-抗原-酶 標(biāo)抗體復(fù)合物，底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成 最終的藍(lán)色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（0D值），將樣本吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較 即可得出相應(yīng)DAP44的含量。
[0021 ] 本發(fā)明試劑盒具有高敏感性，有助于胰腺癌臨床檢測。
【附圖說明】
[0022] 圖1是采用本發(fā)明的試劑盒繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023] 圖2是采用本發(fā)明的試劑盒檢測健康血清樣本與胰腺癌血清中DAP44含量檢測值 (ng/ml)
【具體實施方式】
[0024] 實施例1DAP44ELISA檢測試劑盒的制備。、
[0025]1包被：用pH9. 5包被緩沖液稀釋保藏號為CCTCCC201564純化抗體（10ug/ml)， 包被96孔板，100y1/孔，4°C包被過夜?？瞻讓φ湛自O(shè)4孔/板，加入包被液100y1。包 被液標(biāo)準(zhǔn)配方：Na2C03l. 59克，NaHC032. 93克，加蒸餾水至1000ml。
[0026] 2洗板：用自動洗板機(jī)洗板三次，5分鐘/次，洗滌緩沖液（pH7. 4 0. 15MPBS): KH2P040 . 2 克，Na2HP04 ? 12H20 2. 9 克，NaCl8. 0 克，KC1 0? 2 克，Tween-20 0? 05% 0? 5ml，加 蒸餾水至l〇〇〇ml。
[0027] 3封閉：用1 %BSA封閉酶標(biāo)板上沒有結(jié)合上抗體的位點。200y1/孔，室溫作用1 小時，洗板。
[0028] 4抗體的標(biāo)記：（1)稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中；（2)于上液中加入0. 2ml新 配的0. 1MNaI04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘；（3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImMpH 4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜；(4)加20y1 0. 2MpH9. 5碳酸鹽緩沖液，使pH升高到 9. 0~9. 5,然后立即加入10mgIgG(抗體，或SPA5mg在lml0? 01M碳酸鹽緩沖液中），室溫 避光輕輕攪拌2小時。（5)加0.lml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4°C2小時。（6) 將上述液裝入透析袋中，對0. 15MpH7.4PBS透析