，4°C過夜。（7)攪拌，逐滴加入等體積飽 和硫酸銨，置4°C1小時(shí)。（8)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次， 最后沉淀物溶于少量0. 15MpH7. 4的PBS中。（9)將上述溶液裝入透析袋中，對0. 15MpH 7. 4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測），10,OOOrpm離心30分鐘去除 沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
[0029] 5酶標(biāo)試劑的配制：制備的辣根過氧化物酶標(biāo)記的由保藏號為CCTCCC201565的 抗DAP44單克隆抗體；以1 :2500的比例將酶標(biāo)抗體溶于酶緩沖液中。酶緩沖液配方為： 5. 8g/L磷酸氫二鈉、0. 593g/L磷酸二氫鈉、8.Og/L氯化鈉、200ml/L小牛血清、0. 5ml/L Proclin-300〇
[0030] 6樣品稀釋液的制備：牛血清白蛋白（BSA)0. 1克，加洗滌緩沖液至100ml或以羊 血清、兔血清等與洗滌液配成5~10 %使用。
[0031] 7顯色劑A液為H202，顯色劑B液為TMB。
[0032] 8終止液：2MH2S04,蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸（98% )21. 7ml至200ml。
[0033] 9校準(zhǔn)品的配制：用樣品稀釋液將合成的DAP44純品稀釋，使得校準(zhǔn)品中的抗原濃 度梯度分別為 2000、1000、500、250、125、62.5、0ng/ml。
[0034] 實(shí)施例2本發(fā)明胰腺癌相關(guān)抗原DAP44ELISA試劑盒的使用方法
[0035] 1.加樣孵育：將試劑盒復(fù)溫至室溫，取足夠數(shù)量包被板，分別設(shè)置空白孔（不加樣 品和酶標(biāo)試劑）、校準(zhǔn)孔和待測樣品孔，按順序在校準(zhǔn)孔中加入50ul標(biāo)準(zhǔn)品，在待測樣品孔 中先加入40ul樣品稀釋液，再加入10ul待測樣品（樣品最終稀釋度為5倍）。震蕩混勻， 37°C孵育 30min。
[0036] 2.洗板：洗板機(jī)洗板，每孔加入350ul洗滌緩沖液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗5次， 拍干。
[0037] 3.加酶標(biāo)試劑：每孔加入酶標(biāo)試劑50ul，空白孔除外，37°C孵育30min，重復(fù)洗5 次；
[0038] 4.顯色：每孔加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50ul，輕輕震蕩混勻，37°C避光 顯色10min。
[0039] 5?終止：每孔加入終止液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
[0040] 6.測定：在加入終止液15min以內(nèi)進(jìn)行，以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測定各孔 吸光度（0D值），繪制抗原樣本濃度與0D450值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，方程：y =-3E-07x2+0. 0012x-0. 0238,R2= 0. 999。查標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣本中抗原的濃度。
[0041] 表1抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度與0D450檢測值
[0042]

[0043] 實(shí)施例1利用本發(fā)明的ELISA試劑盒檢測36例胰腺癌患者血清和21例正常體檢 者血清中DAP44水平，結(jié)果如圖2,結(jié)果提示：與正常人相比，胰腺癌患者血清中DAP44水平 顯著升高；該DAP44ELISA試劑盒對胰腺癌患者的檢測具有很高的敏感性。
[0044] 雜交瘤細(xì)胞株的保藏
[0045] 將雜交瘤細(xì)胞株于2015年6月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（湖北省武 漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)），編號No. 2D1C11的雜交瘤細(xì)胞株保藏號為CCTCC C201564,編號為No. 1E8H3的雜交瘤細(xì)胞株保藏號為CCTCCC201565。
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種ELISA試劑盒，其特征在于，包括：特異性DAP44抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)試劑、 洗滌緩沖液、樣品稀釋液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、DAP44標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液， 其中酶標(biāo)板上的單克隆抗體由保藏號為CCTCC C201564的雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生，辣根過 氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體由另一株保藏號為CCTCC C201565的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生； 酶標(biāo)試劑：包含5. 8g/L磷酸氫二鈉、0. 593g/L磷酸二氫鈉、8. Og/L氯化鈉、200ml/L小 牛血清、0. 5ml/L Proclin-300和0. 4mg/L辣根過氧化物酶標(biāo)記的胰腺癌相關(guān)抗原DAP44單 克隆抗體； 洗滌緩沖液 pH 7. 4 0? 15M PBS :KH2P04 0? 2 克，Na2HPO4 ? 12H20 2. 9 克，NaCl 8. 0 克， KCl 0? 2 克，Tween - 200. 05% 0? 5ml，加蒸餾水至 1000 ml ; 樣品稀釋液：牛血清白蛋白〇. 1克，加洗滌緩沖液至100mL或以羊血清、兔血清與洗滌 液配成5~10 %使用； 顯色劑A液為H2O2，顯色劑B液為TMB ; 終止液為2M H2SO4。2. 如權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，ELISA試劑盒的制備方法如下： (1) 酶標(biāo)記抗體的制備：用辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記保藏號為CCTCC C201565的抗 DAP44單克隆抗體； (2) 酶標(biāo)板包被：用純化的保藏號為CCTCC C201564的抗DAP44抗體包被96孔板酶標(biāo) 板，并封閉、拋光。3. 如權(quán)利要求1所述的ELISA試劑盒，其特征在于，ELISA試劑盒的使用方法如下： (1) 加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本至相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，使標(biāo)準(zhǔn)品或樣本中的DAP44分子與酶 標(biāo)板中的抗體充分結(jié)合，洗去未結(jié)合的雜質(zhì)； (2) 使已結(jié)合的DAP44與HRP標(biāo)記的DAP44單克隆抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合酶標(biāo)抗體； (3) 加入顯色劑A、B液，充分混勻，終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測OD值。
【專利摘要】本發(fā)明利用前期合成和篩選的一對高效特異DAP44單克隆抗體，制備了DAP44ELISA檢測試劑盒。所合成的ELISA試劑盒包括特異性DAP44抗體包被的酶標(biāo)板、酶標(biāo)試劑、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、DAP44標(biāo)準(zhǔn)品。采用雙抗體夾心ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被DAP44抗體，使血清樣本中的DAP44結(jié)合固定在酶標(biāo)板微孔表面的抗體，加入HRP偶聯(lián)DAP44二抗后，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，將樣本吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)DAP44的含量。本發(fā)明試劑盒具有高敏感性，有助于胰腺癌臨床檢測。CCTCC 20156420150610
【IPC分類】G01N33/577, G01N33/543, G01N33/574, G01N33/68
【公開號】CN105021825
【申請?zhí)枴緾N201510400227
【發(fā)明人】陳勇, 白泉, 姚雪彪, 趙寧, 方誠, 郭欣, 呂行
【申請人】陳勇
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月9日