一種pgii快速定量檢測試劑盒及其制作、檢測方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術領域，特別涉及一種PGII快速定量檢測試劑盒及其制作、檢測方法。
【背景技術】
[0002]胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃蛋白酶的前體，包括胃蛋白酶原I(PGI)和胃蛋白酶原n(PGII)兩類。PGI主要由胃體的主細胞和黏液細胞分泌，絕大部分分泌至胃腔體，少量可通過一些途徑進入血液。PGII主要由胃竇部的幽門腺和十二指腸近段的Bruner腺粘膜的主細胞和頸細胞分泌產生，少量可通過一些途徑進入血液。當胃部環(huán)境發(fā)生變化如胃黏膜發(fā)生病理變化，PG1、PG Π的分泌量會受到影響，進而影響血液中PG1、PGΠ的含量，反過來說，血液中PG1、PGII的含量能夠反映胃黏膜的分泌功能。大量研究表明胃部病變發(fā)展過程中:由幽門螺桿菌(Hp)感染，發(fā)展為慢性胃炎，再到萎縮性胃炎，最終發(fā)展到胃癌，均伴隨著PG1、PGΠ的變化，隨著胃病發(fā)展，血清中PGI的含量先升高后降低;PGΠ的含量升高之后維持在一個較高水平，因此PG1、PGII的含量，與PGI/PGII的比值的異常，能夠提示不同程度的胃部疾病。簡而言之，PG1、PG Π的指標與胃炎、Hp感染、胃潰瘍、胃出血、胃癌等有關，它們作為胃病的體外檢測已越來越受到關注。我國是胃癌高發(fā)國家之一，一些胃癌高發(fā)區(qū)胃癌高發(fā)率為1%，各種胃病患病率達82%，胃癌是國家重點防治的四大腫瘤之一。對人群進行大規(guī)模的篩查，建立靈敏、便捷的PG1、PG Π含量檢測方法可利于胃病的輔助診斷和胃癌的早期輔助診斷。目前定量檢測PG1、PGII的試劑盒有放免法(RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、時間分辨熒光分析法(TRFIA)等。放免法有潛在放射性污染、需要特種儀器，專業(yè)的工作人員操作，不利于推廣使用;酶聯(lián)免疫分析法和時間分辨熒光法盡管使用比例相對較高，但操作耗時長，價格高，為液相的均相體系，試劑受限于保存條件和保質期，不利于基層醫(yī)院的項目開展。免疫層析技術以多種膜材組合為固定相，作為液相的樣品通過毛細流原理從加樣一端泳流至標記物墊上，與固定在標記物墊上的抗原或抗體標記物(如膠體金、焚光稀土元素等)反應形成免疫復合物，該帶有標記的免疫復合物繼續(xù)通過涌流到達反應膜上固定的檢測線，與檢測線上的抗原或抗體發(fā)生免疫反應從而被截留富集顯色，達到快速檢測的目的。免疫層析技術最常見的標記物是膠體金，應用非常廣泛，也非常成功。由于膠體金標記是通過靜電吸附的原理，在流體中不穩(wěn)定，標記的分子容易脫落，且只有膠體金顆粒富集到一定肉眼可見的量的時候才能判讀，同時，膠體金免疫層析技術只可對被檢物定性分析。目前，并無相關的量子點免疫層析技術來快速檢測PGII。
【發(fā)明內容】
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種PGII快速定量檢測試劑盒及其制作、檢測方法，能夠準確、快速、靈敏、定量的檢測人血中PGII。
[0004]本發(fā)明解決其技術問題，所采用的技術方案是提供一種PGII快速定量檢測試劑盒及其制作、檢測方法，具體的，包括一個檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括PGII檢測卡，卡內裝有PGII檢測試紙條。檢測卡可由熒光分析儀測出PGII濃度值。所述試紙條包括在粘性底板上依次搭接的樣本墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙;所述的結合物墊上噴涂有PGII單克隆抗體偶聯(lián)的量子點，所述的硝酸纖維素膜上包被有PGII單克隆抗體作為檢測線，硝酸纖維素膜上還包被有羊抗鼠抗體作為質控線。檢測卡是以雙抗體夾心法模式檢測PGII。
[0005]所述量子點為包括18、118、11^、1￥4、￥4、￥^族中的兩種以上元素組成的單個晶核結構，如 CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe 等，或是核殼結構，如 CdSe/ZnS、ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0006]量子點由以上元素構成外，還具有表面修飾基團，如-C00H、-NH2、-SH、-CH0等基團，可以通過一些化學試劑如戊二醛、碳二亞胺等偶聯(lián)生物大分子，如蛋白質、核酸及其他有機分子。
[0007]所述量子點的粒徑范圍為5?500nm，激發(fā)光波長范圍為200?600nm，發(fā)射光波長為400?800nm。
[0008]一種PGII快速定量檢測試劑盒的制作方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0009]a.用量子點偶聯(lián)PGII單克隆抗體得到量子點-PGII單克隆抗體復合物，并將其噴涂在結合物墊上；
[0010]b.將另一株PGn單克隆抗體包被到硝酸纖維素膜上作為檢測線，將羊抗鼠抗體包被到硝酸纖維素膜上作為質控線，檢測線和質控線間的距離為3?10mm;
[0011]C.在粘性底板上依次搭接樣本墊、噴涂有量子點-PGΠ單克隆抗體復合物的結合物墊、設置有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，并裁切成所需寬度即為PGII檢測試紙條；
[0012]d.將制作好的PGII檢測試紙條裝入PGII快速定量檢測卡內，再將PGII快速定量檢測卡及樣品緩沖液裝入試劑盒內。
[00?3]所述PG Π單克隆抗體偶聯(lián)量子點的方法:將PG Π單克隆抗體加入到已活化的量子點溶液中或是將已活化的量子點加入到PGΠ單克隆抗體溶液中偶聯(lián)得到量子點-PGΠ單克隆抗體復合物;量子點的活化方法可以是一步法，也可以是兩步法。一步法為先混合量子點與待偶聯(lián)的PGII單克隆抗體，后加入一定量的活化劑EDC，進行一步活化偶聯(lián);兩步法為先將活化劑EDC(可同時加入NHS或sulfo-NHS)加入到量子點溶液中活化，再將PG Π單克隆抗體加入到活化后的量子點溶液中進行偶聯(lián)，得到量子點-PG Π單克隆抗體復合物。
[0014]結合物墊上噴涂量子點-PGII單克隆抗體復合物的條件是:將量子點-PGII單克隆抗體復合物稀釋到稀釋5-50倍，用噴膜儀按2-100yl/Cm的量噴涂到結合物墊上，在環(huán)境濕度小于30%，溫度在35-37°C的環(huán)境下烘烤l_5h，干燥后封存。
[0015]本發(fā)明還提供了一種PGII的檢測方法，包括以下步驟:
[0016]1)先用試劑盒上的標定芯片標定熒光分析儀，保存標定數(shù)據(jù)；
[0017]2)將血清、血漿樣品或全血樣品加入檢測卡加樣孔內；
[0018]3)將PGII快速定量檢測卡插入熒光分析儀的檢測孔，放置5分鐘，熒光分析儀即可讀出PGII的濃度值。
[0019]有益效果:將量子點和免疫層析技術相結合，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析法和時間分辨熒光分析法，該檢測方法還具有檢測時間短，效率高的特點，也可以很好的檢測出PGΠ的存量。本發(fā)明利用量子點免疫層析法，非創(chuàng)傷、低風險、安全、廉價、精確和快速的定量檢測血清、血漿和全血中的PGII含量，可以為胃癌的初篩和病情監(jiān)測提供輔助作用。
【具體實施方式】
[0020]一種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括PGII檢測卡，卡內裝有PGII檢測試紙條。所述試紙條包括在粘性底板上依次搭接的樣本墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。所述的結合物墊上噴涂有PG Π單克隆抗體偶聯(lián)的量子點，所述的硝酸纖維素膜上包被有PG Π單克隆抗體作為檢測線，硝酸纖維素膜上還包被有羊抗鼠抗體作為質控線。檢測卡是以雙抗體夾心法模式檢測PGII。
[0021]所述量子點為包括18、118、11^、1￥4、￥4、￥^族中的兩種以上元素組成的單個晶核結構，如 CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、InP、InAs、HgCdTe 等，或是核殼結構，如 CdSe/ZnS、ZnCdS/ZnS、MnSe/ZnSe/ZnS、CuInZnS/ZnS等。
[0022]量子點由以上元素構成外，還具有表面修飾基團，如-C00H、-NH2、-SH、-CH0等基團，可以通過一些化學試劑如戊二醛、碳二亞胺等偶聯(lián)生物大分子，如蛋白質、核酸及其他有機分子。
[0023]所述量子點的粒徑范圍為5?500nm，激發(fā)光波長范圍為200?600nm，發(fā)射光波長為400?800nm。
[0024]所述PGΠ檢測卡，包括上殼體和下殼體，所述上殼體與下殼體間放置有PG Π檢測試紙條，所述上殼體上設置有加樣孔、觀察窗和信息區(qū)，所述加樣孔與PG Π檢測試紙條上的樣本墊對應，觀察窗與硝酸纖維素膜上的檢測線和質控線對應;所述信息區(qū)上噴涂有用于識別病人ID的二維碼、條形碼或磁卡;所述PGII檢測卡裝在試劑盒內，試劑盒上設置有標定芯片。
[0025]本發(fā)明還提供了一種PGII的檢測方法:包括以下步驟:
[0026]1)先用試劑盒上的標定芯片標定熒光分析儀，保存標定數(shù)據(jù)；
[0027]2)取70微升血清，血漿樣品，或100微升全血樣品加入檢測卡加樣孔；
[0028]3)將檢測卡插入熒光分析儀的檢測孔，放置5分鐘，熒光分析儀即可讀出PGII的濃度值。
[0029]實施例1:
[0030]一種PGII檢測試紙條的制作方法，包括以下步驟:
[0031]a.用量子點偶聯(lián)PGII單克隆抗體得到量子點-PGII單克隆抗體復合物，并將其噴涂在結合物墊上；
[0032]b.分別將PGII單克隆抗體包被到硝酸纖維素膜上作為檢測線，將抗是鼠羊抗鼠抗體包被到硝酸纖維素膜上作為質控線，檢測線和質控線間的距離為5mm。
[0033]c.在粘性底板上依次搭接樣本墊、噴涂有量子點-PGII單克隆抗體復合物的結合物墊、設置有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，各個膜材之間相互重疊1mm，粘好后裁切成4_的寬度的試紙條即SPG Π檢測試紙條。
[0034]PGII單克隆抗體偶聯(lián)量子點制備量子點-PGII單克隆抗體復合物的方法:
[0035]取0.1ml由CdSe/ZnS，表面基團為-C00H組成的量子點(激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長620nm)溶液置于lml濃度為0.lmol/L PH5.0的MES緩沖液中，同時加入0.02ml濃度50mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和0.08ml濃度20mg/ml的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulf o-NHS)，室溫孵育20min后，離心(23000rpm,30min)，棄上清，洗滌得量子點溶劑，相同條件下離心，棄上清，得到最終的量子點溶劑，在最終的量子點溶劑中加入0.lmg的PG Π單克隆抗體，室溫孵育2h，加入1%甘氨酸，室溫孵育0.5h，相同條件下離心，棄上清后加入0.11111保存液(0.0211101/1的磷酸鹽緩沖液，含1%834，0.04%?抓(^11300)，所得的量子點-PG Π單克隆抗體復合物放置于4°C的環(huán)境中保存待用。
[0036]量子點結合物墊的具體制備方法:
[0037]結合物墊預處理:取一條型號為8975的玻璃纖維素膜，用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(內含1%牛血清白蛋白，0.5%的吐溫20)浸泡30min后取出，在37°C的條件下烘干。將上述標記好的量子點-PGII單克隆抗體復合物用量子點工作緩沖液(含1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20，0.05%Proclin30(^^0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)按1: 200稀釋后，用噴膜儀按20yl/cm的量噴涂到上述預處理的玻璃纖維膜上，在環(huán)境濕度小于30%，37°C的環(huán)境下烘