一種基于熒光素和螢光素酶生物發(fā)光反應(yīng)的免疫分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光素和螢光素酶生物發(fā)光反應(yīng)的免疫分析方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]構(gòu)建高靈敏分析方法一直是分析化學(xué)領(lǐng)域追求的目標(biāo)之一，高靈敏分析方法推動(dòng)了分析化學(xué)的發(fā)展及其在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全、生物成像等領(lǐng)域的應(yīng)用。在重大傳染病、細(xì)菌或病毒感染、癌癥等疾病的早期診斷以及食品和環(huán)境中痕量有毒物質(zhì)的篩查中，高靈敏分析方法顯得尤為重要。以抗體-抗原特異性識(shí)別為基礎(chǔ)的免疫生物標(biāo)記分析方法是一種將生物標(biāo)記技術(shù)的高靈敏性和免疫反應(yīng)的高度特異性結(jié)合在一起的分析方法，具有靈敏度高、特異性好、分析快速等優(yōu)點(diǎn)。酶聯(lián)免疫是其中的代表，該方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、成本低、易于商品化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。但傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法一般都是基于免疫標(biāo)記酶和底物之間的一次酶促信號(hào)放大，其靈敏度只能達(dá)到ng/mL。在需要高靈敏度的分析領(lǐng)域，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法很難滿足需要，因此，如何實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單便捷的高靈敏免疫分析仍是分析化學(xué)領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)之一。
[0003]目前，高靈敏的免疫分析方法的實(shí)現(xiàn)主要依賴:1)樣品中目標(biāo)物的有效富集和擴(kuò)增;2)有效的信號(hào)放大策略?；诩{米磁珠的免疫磁富集方法能有效富集樣品中目標(biāo)物，具有操作簡(jiǎn)單、分離速度快、富集效率高等優(yōu)勢(shì)，在免疫分析中得到了廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，采用合適的信號(hào)放大策略對(duì)于免疫分析方法靈敏度的提高至關(guān)重要。近些年來(lái)，研究者們已經(jīng)發(fā)展出一系列的信號(hào)放大方法，主要包括:(1)基于納米材料的信號(hào)放大系統(tǒng):新型納米材料(納米磁珠，膠體金，量子點(diǎn)，石墨稀，娃基納米材料等)具有比表面積大，穩(wěn)定性和生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，可以偶聯(lián)大量的信號(hào)報(bào)告基團(tuán)如熒光分子或酶，達(dá)到信號(hào)放大的目的。(2)基于click反應(yīng)的信號(hào)放大系統(tǒng):click反應(yīng)是指一類具有立體選擇性，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，反應(yīng)快速的化學(xué)反應(yīng)，已經(jīng)在生物偶聯(lián)、臨床診斷、細(xì)胞成像、生物傳感等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。免疫分析方法中，抗體可以通過(guò)click可控反應(yīng)偶聯(lián)上更多的酶或者其他信號(hào)報(bào)告分子，從而提高了方法的靈敏度。(3)基于核酸擴(kuò)增的信號(hào)放大系統(tǒng):將核酸擴(kuò)增技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與免疫分析方法相結(jié)合，將待分析物的信號(hào)轉(zhuǎn)換為核酸信號(hào)進(jìn)行分析，從而改善現(xiàn)有方法的靈敏度，但該方法操作比較復(fù)雜，影響了其實(shí)際應(yīng)用。上述3類放大系統(tǒng)盡管可以改善分析方法的靈敏度(提高1-2個(gè)數(shù)量級(jí))，但其放大效果還是會(huì)受到多方面的限制。例如，在免疫分析中，基于click反應(yīng)的多步信號(hào)放大系統(tǒng)會(huì)增加實(shí)驗(yàn)步驟，影響了分析的速度和準(zhǔn)確性?；诤怂釘U(kuò)增的信號(hào)放大系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作比較復(fù)雜，影響了其實(shí)際應(yīng)用。因此，有必要研究開發(fā)靈敏度更高、分析速度更快、信號(hào)輸出讀取方式更為簡(jiǎn)單的免疫分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)目前的免疫分析方法在檢測(cè)靈敏度、分析速度和信號(hào)讀出方式等方面不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求的情況，而提供一種基于熒光素和螢光素酶生物發(fā)光反應(yīng)的免疫分析方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的免疫分析方法基于“ATP-熒光素-熒光素酶”生物發(fā)光反應(yīng)而進(jìn)行，具有靈敏度高、信號(hào)讀出方式簡(jiǎn)單、檢測(cè)線性范圍寬、分析速度快等優(yōu)勢(shì)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是:一種基于生物發(fā)光反應(yīng)的免疫分析方法，其包括如下步驟:
[0007](1)將包被物質(zhì)包被在固相載體上，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0008](2)加入具有不同濃度梯度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0009](3)加入以ALP標(biāo)記的二抗，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗，所述二抗為抗待測(cè)物的抗體；
[0010](4)加入ATP溶液反應(yīng)后，再加入生物發(fā)光底物進(jìn)行反應(yīng)，最后檢測(cè)發(fā)光值，獲得結(jié)果I;
[0011](5)將步驟(2)中所述的不同濃度梯度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液替換成待測(cè)樣品溶液，重復(fù)進(jìn)行步驟(1)?(4)的操作，最后檢測(cè)發(fā)光值，獲得結(jié)果II，將結(jié)果II參比結(jié)果I，判斷待測(cè)樣品溶液中待測(cè)物的濃度；
[0012]其中，當(dāng)待測(cè)物為完全抗原時(shí)，所述包被物質(zhì)為能夠與所述完全抗原對(duì)應(yīng)結(jié)合且與所述二抗具有不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，當(dāng)待測(cè)物為抗體時(shí)，所述包被物質(zhì)為與所述抗體對(duì)應(yīng)的完全抗原或半抗原分子與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)形成的人工抗原；
[0013]所述的生物發(fā)光底物為含有熒光素和熒光素酶的溶液。
[0014]本發(fā)明中，步驟(1)為:將包被物質(zhì)包被在固相載體上，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗。
[0015]如本領(lǐng)域常規(guī)，所述的包被物質(zhì)為捕獲物質(zhì)，一般是抗體，如果是半抗原分子，則將半抗原分子與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)后再進(jìn)行包被。所述的包被物質(zhì)能夠特異性結(jié)合步驟(2)中所述的待測(cè)物。
[0016]所述的固相載體為免疫檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)所述的各類固相載體，其對(duì)于具體材質(zhì)和規(guī)格并沒(méi)有特殊的要求，只要其適于包被以及進(jìn)行其他常規(guī)免疫反應(yīng)操作即可。優(yōu)選地，所述的固相載體為酶標(biāo)板，本領(lǐng)域各種常規(guī)材質(zhì)和規(guī)格的酶標(biāo)板均適用于本發(fā)明。
[0017]所述孵育為本領(lǐng)域的常規(guī)操作，一般是將包被后的固相載體置于合適的溫度條件下放置數(shù)小時(shí)，待包被物質(zhì)牢固吸附于固相載體即可。優(yōu)選地，所述孵育為將包被后的固相載體置于4?40°C放置0.5?12小時(shí)，更優(yōu)選于37°C放置2小時(shí)。
[0018]所述緩沖液為本領(lǐng)域常規(guī)，各類用于沖洗過(guò)量包被物質(zhì)的緩沖液均適用于本發(fā)明，可以視不同的檢測(cè)反應(yīng)體系而進(jìn)行具體選擇。優(yōu)選地，所述緩沖液為PBS緩沖液，更優(yōu)選含有1%。吐溫-20的PBS緩沖液，所述千分比指體積千分比。
[0019]所述沖洗為本領(lǐng)域的常規(guī)操作，一般是往固相載體上加入緩沖液，靜置數(shù)分鐘后用凈拍干，一般沖洗數(shù)次。
[0020]本發(fā)明中，步驟(2)為:加入具有不同濃度梯度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0021]其中，所述待測(cè)物為待檢測(cè)的物質(zhì)，其與步驟(1)中所述的包被物質(zhì)能夠發(fā)生特異性的結(jié)合，其屬性一般為完全抗原或者是抗體。所述抗體的來(lái)源沒(méi)有特別限制，如可以是將步驟(1)中所述的包被物質(zhì)免疫各類哺乳動(dòng)物而獲得的抗體，如鼠抗或兔抗，其類型也沒(méi)有特殊要求，既可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。
[0022]所述孵育同步驟(1)，其是本領(lǐng)域的常規(guī)操作，一般是將固相載體置于合適的溫度條件下放置數(shù)小時(shí)，待添加物牢固吸附于固相載體上即可。優(yōu)選地，所述孵育為將固相載體置于4?40°C放置0.5?12小時(shí)，更優(yōu)選于37°C放置2小時(shí)。
[0023]所述緩沖液同步驟(1)，其為本領(lǐng)域常規(guī)，各類用于沖洗過(guò)量添加物的緩沖液均適用于本發(fā)明，可以視不同的檢測(cè)反應(yīng)體系而進(jìn)行具體選擇。優(yōu)選地，所述緩沖液為PBS緩沖液，更優(yōu)選含有1%。吐溫-20的PBS緩沖液，所述千分比指體積千分比。
[0024]所述沖洗同步驟(1)，其為本領(lǐng)域的常規(guī)操作，一般是往固相載體上加入緩沖液，靜置數(shù)分鐘后甩凈拍干，一般沖洗數(shù)次。
[0025]本發(fā)明中，步驟(3)為:加入以ALP標(biāo)記的二抗，孵育后用緩沖液進(jìn)行沖洗，所述二抗為抗待測(cè)物的抗體。
[0026]其中，所述ALP是堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)的英文簡(jiǎn)稱，可以高效地酶解ATP(三磷酸腺苷)生成AMP(單磷酸腺苷)。
[0027]所述二抗的來(lái)源沒(méi)有特別限制，如可以是將步驟(2)中所