一種甲基化dna檢測(cè)的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，即一種甲基化DNA檢測(cè)的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞癌變與基因的異常甲基化改變有關(guān)，通過(guò)對(duì)樣品中甲基化基因的檢測(cè)，可以提不相應(yīng)樣品中癌細(xì)胞的存在。
[0003]甲基化DNA是在DNA鏈的C殘基上修飾有一個(gè)甲基。人類異常的DNA甲基化多發(fā)生在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，引起相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉，使基因喪失功能。多種癌癥的發(fā)生與DNA異常甲基化有關(guān)，通過(guò)對(duì)DNA甲基化的檢測(cè)，可以提供體內(nèi)是否存在癌細(xì)胞的信息。
目前，對(duì)甲基化基因的檢測(cè)，通常是用重亞硫酸鹽處理樣品DNA，將DNA鏈上所有不發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)變?yōu)閁，而一般DNA聚合酶識(shí)別U為T(mén)。對(duì)經(jīng)重亞硫酸鈉處理過(guò)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物，DNA鏈上所有未發(fā)生甲基化的C，均置換為T(mén)，使得非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物的變性溫度比甲基化DNA的PCR產(chǎn)物的變性溫度顯著降低，據(jù)測(cè)定，每個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)與相應(yīng)的非甲基化位點(diǎn)相比，經(jīng)重亞硫酸鈉處理之后，將導(dǎo)致其PCR產(chǎn)物的變性溫度產(chǎn)生0.5度的差異。當(dāng)對(duì)這些PCR產(chǎn)物加熱時(shí)，非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物將先于甲基化DNA的PCR產(chǎn)物而發(fā)生解鏈變性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種甲基化DNA檢測(cè)的新方法，其目的在于提高檢測(cè)樣品中的甲基化DNA的靈敏度和檢測(cè)的穩(wěn)定性提供一種新方法。
[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)提供的一種甲基化DNA檢測(cè)的新方法采用了如下的技術(shù)方案:
本發(fā)明經(jīng)優(yōu)化PCR引物的設(shè)計(jì)，使每個(gè)PCR擴(kuò)增區(qū)域至少包含10個(gè)C盤(pán)G位點(diǎn)，所累積的變性溫度差異將超過(guò)5度。溫度通過(guò)加熱，使PCR產(chǎn)物部分解鏈變性，即加熱到一個(gè)特定溫度，只使非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物發(fā)生變性。用對(duì)單鏈DNA特異的核酸外切酶消化這樣處理的PCR產(chǎn)物，非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物將被消化，而甲基化DNA的PCR產(chǎn)物維持不變，從而可以提尚甲基化DNA的檢測(cè)靈敏度。
[0006]一種甲基化DNA檢測(cè)的新方法，其特征在于:
第一步:篩選出一組12個(gè)基因，根據(jù)目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域甲基化DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理轉(zhuǎn)化后是的序列，設(shè)計(jì)PCR引物，使每條引物序列中包含2-3個(gè)CpG位點(diǎn)，以提高引物對(duì)甲基化DNA的偏向性擴(kuò)增；使這一組基因的每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度，呈梯度分布；使每個(gè)PCR擴(kuò)增區(qū)域含有至少10個(gè)CpG位點(diǎn)；使每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的變性溫度在82-84度；
第二步:從人糞便樣品中提取的DNA，用重亞硫酸鈉處理并純化；
第三步:配制甲基化DNA的PCR擴(kuò)增體系，包括PCR緩沖液、四種dNTP混合物，Taq DNA聚合酶； 第四步:加入步驟1所設(shè)計(jì)的引物混合，加入經(jīng)重亞硫酸鈉處理并純化的樣品DNA，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增；
第五步:步驟四的PCR產(chǎn)物加熱至80度，使PCR產(chǎn)物獲得部分變性；
第六步:用單鏈DNA特異性外切酶對(duì)步驟5的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化處理；
第七步:以步驟六的經(jīng)消化處理的PCR產(chǎn)物為模板，與步驟一設(shè)計(jì)的PCR引物混合物，在步驟三的PCR擴(kuò)增體系中，進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)；
第八步:將步驟七的反應(yīng)產(chǎn)物，用全自動(dòng)毛細(xì)管電泳分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)DNA片段出現(xiàn)的時(shí)間，判斷甲基化DNA的存在。
[0007]優(yōu)選的，所述的第一步中一組12個(gè)基因，具體如下:SNCA、SPG20、ADAMTS1、SFRP5、SLC5A8、IGFBP3、GALR2、SLC16A12、SP0CK2、TLX2、HLTF、HPP1。
[0008]優(yōu)選的，所述第四步中PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性95度10分；熱循環(huán)95度30秒，62度30秒，72度60秒，42個(gè)循環(huán)。
[0009]優(yōu)選的，所述的第六步中單鏈DNA特異性外切酶是綠豆核酸酶。
[0010]優(yōu)選的，所述綠豆核酸酶的反應(yīng)條件是:lx綠豆核酸酶反應(yīng)緩沖液，0.05u/ul綠豆核酸酶，反應(yīng)溫度為37度，30分。
[0011]優(yōu)選的，所述第七步中PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性95度10分；熱循環(huán)95度30秒，62度30秒，72度60秒，25個(gè)循環(huán)。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明在甲基化DNA特異性多重PCR擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)引物序列的選擇，使設(shè)計(jì)的引物不僅保證PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度呈梯度分布，各PCR產(chǎn)物的退火溫度保持接近，實(shí)現(xiàn)多重PCR條件下的非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物在特定溫度下的部分變性，從而可以被單鏈DNA特異性外切核酸酶消化移除，使甲基化DNA的檢測(cè)靈敏度得到提高，通過(guò)使用毛細(xì)管電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，有效提高甲基化DNA檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，多重PCR 一次性檢測(cè)多個(gè)甲基化基因，提尚檢測(cè)效率，提尚檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)的穩(wěn)定性。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1人通用甲基化DNA和非甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳檢測(cè)系統(tǒng)的迀移時(shí)間圖。
[0014]圖2大腸癌患者糞便中甲基化DNA檢測(cè)實(shí)例。
【具體實(shí)施方式】
[0015]為了更清楚的理解本發(fā)明提供的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例
[0016]近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞癌變與基因的異常甲基化改變有關(guān)，通過(guò)對(duì)樣品中甲基化基因的檢測(cè)，可以提示相應(yīng)樣品中癌細(xì)胞的存在。對(duì)甲基化基因的檢測(cè)，通常是用重亞硫酸鹽處理樣品DNA，將DNA鏈上所有不發(fā)生甲基化的C堿基轉(zhuǎn)變?yōu)閁，而一般DNA聚合酶識(shí)別U為T(mén)。對(duì)經(jīng)重亞硫酸鈉處理過(guò)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物，DNA鏈上所有未發(fā)生甲基化的C，均置換為T(mén)，使得非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物的變性溫度比甲基化DNA的PCR產(chǎn)物的變性溫度顯著降低，據(jù)測(cè)定，每個(gè)甲基化CpG位點(diǎn)與相應(yīng)的非甲基化位點(diǎn)相比，經(jīng)重亞硫酸鈉處理之后，將導(dǎo)致其PCR產(chǎn)物的變性溫度產(chǎn)生0.5度的差異。當(dāng)對(duì)這些PCR產(chǎn)物加熱時(shí)，非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物將先于甲基化DNA的PCR產(chǎn)物而發(fā)生解鏈變性。本發(fā)明經(jīng)優(yōu)化PCR引物的設(shè)計(jì)，使每個(gè)PCR擴(kuò)增區(qū)域至少包含10個(gè)C盤(pán)G位點(diǎn)，所累積的變性溫度差異將超過(guò)5度。溫度通過(guò)加熱，使PCR產(chǎn)物部分解鏈變性，即加熱到一個(gè)特定溫度，只使非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物發(fā)生變性。用對(duì)單鏈DNA特異的核酸外切酶消化這樣處理的PCR產(chǎn)物，非甲基化DNA的PCR產(chǎn)物將被消化，而甲基化DNA的PCR產(chǎn)物維持不變，從而可以提高甲基化DNA的檢測(cè)靈敏度。
[0017]本發(fā)明的實(shí)施例的技術(shù)方案是:
第一步:篩選出一組12個(gè)基因，根據(jù)目標(biāo)檢測(cè)區(qū)域甲基化