測定人PON2基因rs7493位點多態(tài)性的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及測定單核巧酸多態(tài)性的方法。
【背景技術】
[0002] SNP(單核巧酸多態(tài)性）是指單個核巧酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式。基因多態(tài)性是個體與生俱來的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測在遺傳學領域和醫(yī)學領域中應用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進化等遺傳學現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史， 闡明物種進化關系。應用于考古學中W確定古人類遺傳變異特征W及不同種群的親緣關 系。2.研究多態(tài)與種群親緣關系等遺傳學研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預防醫(yī)學領域可W用于疾病預防措施。通過研究人體 對毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對某種毒物發(fā)生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸， 保護該易感人群。例如，對準備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態(tài)檢測，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學中可W用于藥物選擇W及劑量確定。通過多態(tài)檢測可W判斷患病個體對某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物W免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效 果的反應程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 對氧憐酶（paraoxonase，P0N)基因家族包括Ξ個成員：P0N1、P0N2和P0N3。其中 P0N2基因位于染色體7q21. 3,其表達產(chǎn)物在體內(nèi)廣泛分布，能水解對氮憐類有機憐化合物 和高密度脂蛋白上的氧化型憐脂。P0N2基因rs7493位點多態(tài)，在人群中存在兩種等位基 因C和G，形成Ξ種P0N2基因的基因型：CC型（人體基因組rs7493多態(tài)位點的兩個等位基 因堿基均為C)，CG型（人體基因組rs7493多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為C和G)和 GG型（人體基因組rs7493多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為G)。 陽0化]聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài)（PCR-RFL巧技術是一種快速、簡便、準 確、低成本測定SNP(單核巧酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來對模板進行 擴增反應，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物，通過對擴增產(chǎn)物的酶切和檢測酶切產(chǎn)物的片 段長度，最終測定出SNP?，F(xiàn)有的應用PCR-RFLP檢測P0N2基因rs7493位點基因多態(tài)性 的PCR反應條件要求苛刻，可用的限制性內(nèi)切酶僅有DdeI、化y1881、BspCNI等，需要開發(fā)新 的檢測技術。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測定人P0N2基因rs7493位 點多態(tài)性的可靠手段。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測定人P0N2基因rs7493位點多態(tài)性的方法， 包括：
[0008] 提供待測人基因組DM;
[0009] 提供擴增人P0N2基因rs7493位點附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引 物具有錯配堿基C;
[0010] W所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應W 獲得含CCATS片段或CATS片段，其中S為人P0N2基因rs7493位點上的待定堿基C或G;
[0011] 提供限制性內(nèi)切酶；
[0012] 利用限制性內(nèi)切酶對所得擴增產(chǎn)物進行酶切（反應）W獲得相應的酶切產(chǎn)物；W 及 陽01引根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人P0N2基因rs7493位點上的待定堿基S是C還是G，其 中，限制性內(nèi)切酶為能夠切開CCATC與CCATG片段或CATC片段與CATG片段之一限制性內(nèi) 切酶。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物的錯配堿基C與S之間相隔兩 個堿基AT。令人驚訝的是，如此設置錯配堿基將使酶切反應進行得極其順利，不會出現(xiàn)酶切 不充分等現(xiàn)象。并且，如此設置上游引物錯配堿基使PCR反應進行順利，提高了PCR的靈敏 度和特異度，運可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結構改變有關。
[0015] 在本發(fā)明的一個可選實施例中，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與S相鄰。
[0016] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基不與S相 鄰。例如，上游引物末端可W是……CA結構。難W想象，具有運種設計的上游引物竟然會 進一步大大促進酶切反應，運可能與擴增結合力有某種關聯(lián)。
[0017] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，限制性內(nèi)切酶可W采用僅能切開CCATC片段的 BccI或其同裂酶。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所得酶切產(chǎn)物包括Ξ種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物W及（通常不能有效觀測到的）切斷后具有 較短片段的擴增產(chǎn)物。通過觀測（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人P0N2基因 rs7493位點上的待定堿基是C還是G。例如，在采用BccI酶的情況下，根據(jù)總片段和切斷 后較長片段運兩個片段的觀察結果來進行判斷：如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有總片段 長度的未切斷擴增產(chǎn)物，則待定堿基為G;如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較長片段（小 于總片段長度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為C;如果觀察到上述二者，則待定堿基既包括C 又包括G。
[0019] 在本發(fā)明的一個實施例中，判斷（或觀測）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照圖對比來進行的。運種情況下，優(yōu)選參照圖是擴增產(chǎn)物在 凝膠電泳標準設定時間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖 像位置，其中第一參照圖像位置針對的是未切斷的總片段長度的擴增產(chǎn)物，而第二參照圖 像位置則針對的是切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照圖是由合成 的128bp和82bp兩個堿基片段同時經(jīng)凝膠電泳相同時間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復合參照圖相比，由于采用了僅具有兩個特定參照圖像位置的參照圖，本發(fā)明的 運種方法能夠直觀快速地觀測或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時最大限度地避免了 誤判。酶切反應后優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進行電泳，增加圖像亮度，提高判斷 準確性。
[0020] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過設計上游引物和下游引物的長度而使得擴增產(chǎn)物 的總片段長度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，優(yōu)選長度40~ 6化P(在該優(yōu)選區(qū)間擴增反應尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段長度 的百分比超過20%。本發(fā)明的運種設計可W使得具有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物與切斷 后具有較長片段的擴增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過長，則電 泳位移將不明顯；過短則圖像會變的模糊一片，無法準確區(qū)分。上游引物的片段長度范圍保 證了PCR擴增反應能夠順利進行，避免了錯配堿基時會出現(xiàn)的擴增不足現(xiàn)象。 陽02U在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中退火溫度的范圍在55~70°C之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴增反應的特異性），使得設計的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的運種設計可W使得PCR擴增產(chǎn)物條帶清楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難W區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s之間，優(yōu)選時間15~30s(該時間可提高擴增反應的效率和擴增產(chǎn)物的特異性），使得設計 的PCR反應時間較短，擴增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的運種設計可W使PCR擴增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶不能 完全擴增而使