專利名稱：前列腺癌中g(shù)stp1高甲基化的檢測(cè)的制作方法
前列腺癌中GSTP1高甲基化的檢測(cè)
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及甲基化基因的檢測(cè)以及其他診斷方法和用于這些方法的試劑盒。表觀遺傳改變(不涉及DNA核苷酸序列改變的基因表達(dá)改變)主要由DNA甲 基化修飾和染色質(zhì)重建構(gòu)成。DNA甲基化變異已經(jīng)在多種腫瘤和基因的文獻(xiàn)中記載 (Esteller 等人(2001) ； Bastian 等人(2004)；和 Esteller (2005))。特定 CpG 位點(diǎn)的甲基 化程度隨患者樣本而變化(Jeronimo等人(2001)；和Pao等人(2001))。最近已經(jīng)公開了多種潛在的甲基化標(biāo)記物。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)為示例性 蛋白質(zhì)，表達(dá)它們的基因的甲基化狀態(tài)對(duì)于前列腺癌具有重要的預(yù)后和診斷價(jià)值。該蛋 白質(zhì)催化細(xì)胞內(nèi)的排毒反應(yīng)，包括通過使化學(xué)活性親電體與谷胱甘肽結(jié)合而使親電致癌 物失活(Pickett 等人(1989) ； Coles 等人(1990)；和 Rushmore 等人(1993))。由若干不 同基因在不同位點(diǎn)編碼的人類GST被分為四個(gè)家族，分別稱為α、μ、Ji和θ (Mannerv ik等人(1992))。由表觀遺傳改變導(dǎo)致的GSTPl表達(dá)量減少通常與前列腺癌和肝癌相關(guān)。計(jì)算方法(Da s等人(2006))和亞硫酸氫鹽測(cè)序(Chan等人(2005))顯示，CpG 島內(nèi)多個(gè)位點(diǎn)可以被甲基化，并且甲基化程度會(huì)在這些位點(diǎn)之間變化。例如，在口腔癌 中，pl6、上皮鈣粘蛋白基因(E-cadherin)、周期蛋白Al基因(cyclinAl)和細(xì)胞球蛋白基 因(cytoglobin)在各個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度具有顯著差異(Shaw等人(2006))。在前 列腺和膀胱腫瘤中，內(nèi)皮素受體B顯示為甲基化熱點(diǎn)(Pao等人(2001)。)在結(jié)直腸癌和 胃癌中，相比更中心的區(qū)域，幾乎在每個(gè)樣本中都檢測(cè)到死亡相關(guān)蛋白激酶基因的CpG 島的邊緣被甲基化(Satoh等人(2002))。在乳腺癌中，發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因CpG島的甲 基化分布存在差異，并且甲基化會(huì)從第一外顯子逐漸擴(kuò)散到啟動(dòng)子區(qū)(Yan等人(2003)； 和Strannikova等人(2005))。RASSF2在CpG島的5’和3’邊緣存在頻繁的甲基化， 而在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的甲基化則不是那么頻繁(Endoh等人(2005))。在子宮內(nèi)膜癌中， 四種GSTPl設(shè)計(jì)顯示靈敏度在14%和24%之間，但樣本量太 小，無法確定這些差異是否是真實(shí)的(Chan等人(2005))。兩種檢測(cè)設(shè)計(jì)增加了前列腺癌 的檢測(cè)靈敏度(Nakayama等人(2003))；然而，這兩種設(shè)計(jì)共用相同的反向引物，因此 在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)存在較大重疊。pl6、上皮鈣粘蛋白基因、周期蛋白Al基因和細(xì)胞球蛋白 基因的不同CpG序列的甲基化百分比存在差異(Shaw等人(2006))。在乳腺癌中，CpG 位點(diǎn)的甲基化程度存在差異(Yan等人(2003))。腫瘤MLH IRNA表達(dá)和MLH1DNA甲基化之間存在負(fù)相關(guān)性(Yu等人 (2006))。在肺癌細(xì)胞系中，甲基化陽性樣本的DAPK基因表現(xiàn)出較低的RNA表達(dá)水平 (Toyooka等人(2003))。然而，這些研究只檢測(cè)了一個(gè)甲基化位點(diǎn)，因此無法確定與CpG 島內(nèi)多個(gè)位置處的RNA表達(dá)的相關(guān)性。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍的核心區(qū)是提供啟動(dòng)子甲基化 信息的替代標(biāo)記(Eckhardt等人(2006))。在食道鱗狀上皮細(xì)胞癌中，從正常到浸潤(rùn)性癌，各基因處的甲基化頻率增加 (Guo 等人(2006))。TMSl (ρ = 0.002)、DcRl (ρ = -0.01)、DcR2 (ρ = 0.03)和 CRBPl (ρ =0.03)的甲基化與格里森評(píng)分相關(guān)，CRBPl的甲基化與較高分期相關(guān)(ρ = 0.0002)，Repr imo(ρ = 0.02)禾Π TMS 1(ρ = 0.006)的甲基化與較高(> 8ng/ml)PSA 水平相關(guān) (Suzuki等人(2006))。甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌的肌層浸潤(rùn)程度相關(guān)?；颊吣[瘤附近正 常組織內(nèi)的ASC甲基化頻率顯著(ρ = 0.04)升高與生化復(fù)發(fā)相關(guān)，這表明其與侵襲性疾 病的相關(guān)性(Chan等人(2005))。RARb2、PTGS2和EDNRB可能對(duì)接受過根治性前列 腺切除術(shù)的患者具有預(yù)后價(jià)值(Bastian等人(2007))。對(duì)于已知會(huì)在前列腺癌中甲基化的兩種基因GSTPl和RARb2，人們已在多個(gè) 位點(diǎn)進(jìn)行了甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)分析(Lee等人(1994) ； Harden等人(2003)； Jeronimo 等人(2004)；和 Nakayama 等人(2001))。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了基于GSTPl序列(登錄號(hào)X08508)第834-1319位 堿基跨度的CpG島的檢測(cè)分析法。這些新設(shè)計(jì)與現(xiàn)有技術(shù)(本說明書中稱為形式1)并 不交叉。在本說明書中，新設(shè)計(jì)稱為形式2和形式3。這些檢測(cè)分析法大大提高了臨床 靈敏度和分析靈敏度。
具體實(shí)施例方式檢測(cè)可表征前列腺癌存在的若干基因的啟動(dòng)子序列中是否存在高甲基化的分子 檢測(cè)分析法是已知的。一種此類基因?yàn)镚STP1，并且一種檢測(cè)分析法在(例如)全文并 入本文中的美國(guó)專利公布20080254455中有所描述。該檢測(cè)分析法專注于通過啟動(dòng)子的 CpG島內(nèi)的胞嘧啶甲基化而使基因表觀遺傳沉默，因此基因表達(dá)顯著下調(diào)或完全消失。 甲基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)分析法設(shè)計(jì)用于通過區(qū)分甲基化和未甲基化胞嘧啶來檢測(cè) 甲基化序列。在用于PCR反應(yīng)之前，對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，以將未甲基 化DNA中的所有胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而在甲基化DNA中只有不在鳥嘌呤前面的胞嘧 啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。所有鳥嘌呤前面的胞嘧啶(在CpG 二核苷酸中)仍然為胞嘧啶。GSTPl啟動(dòng)子的高甲基化及其與前列腺癌的關(guān)系已經(jīng)廣泛地描述于文獻(xiàn)中。本 發(fā)明的檢測(cè)分析法大大改善了對(duì)GSTPl的啟動(dòng)子序列甲基化的檢測(cè)方法。新檢測(cè)分析法 更靈敏和更具特異性，并且其與相同基因的一個(gè)以上擴(kuò)增子結(jié)合使用提高了可靠性。本 發(fā)明描述了新設(shè)計(jì)及其與采用福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本的現(xiàn)有設(shè)計(jì)的比較。當(dāng) 處理來自FFPE組織的降解DNA、脫落進(jìn)入尿液中的極少數(shù)前列腺細(xì)胞中的DNA以及前 列腺癌患者血液中自由漂浮的DNA時(shí)，分子檢測(cè)分析的高靈敏度和高特異性尤其具有價(jià) 值。對(duì)基因組內(nèi)具有表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或mRNA的潛能的核酸序列(這些序列被稱為 “基因”)的修飾本身已經(jīng)表明，其對(duì)于給定細(xì)胞中是否表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或mRNA具有決
定性。給定基因是否能夠表達(dá)蛋白質(zhì)、肽或mRNA以及這種表達(dá)發(fā)生(如有可能)的程 度取決于多種復(fù)雜因素。不管理解和評(píng)價(jià)這些因素的難度如何，通過測(cè)定基因表達(dá)或修 飾形式可以提供有關(guān)重要事件(例如腫瘤發(fā)生、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡和其他臨床相關(guān) 現(xiàn)象)發(fā)生的有用信息。對(duì)于基因活性或非活性程度的相對(duì)指標(biāo)可見于基因表達(dá)或修飾 譜圖。樣本可以為含有 適于甲基化檢測(cè)的基因組DNA的任何生物流體、細(xì)胞、組織、器官或其一部分。試驗(yàn)樣本可以包括或疑似包括贅生性細(xì)胞，例如來自含有或疑似含有 贅生性細(xì)胞的結(jié)腸、直腸、乳房、卵巢、前列腺、腎、肺、血液、腦或其他器官或組織 的細(xì)胞。該術(shù)語包括存在于個(gè)體中的樣本以及得自或衍生自個(gè)體的樣本。例如，樣本可 以為得自活組織檢查的標(biāo)本的組織切片或置于組織培養(yǎng)物中的細(xì)胞或適合組織培養(yǎng)的細(xì) 胞。樣本還可以為亞細(xì)胞部分或提取物，或者為粗的或基本上純的核酸分子或蛋白質(zhì)制 品。標(biāo)準(zhǔn)樣本可用來確定基準(zhǔn)水平，并且因此可得自具有用來比較試驗(yàn)樣本的特定表型 特征的源組織。用于確定基因修飾譜圖的樣本可通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。樣本可按照 標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)得自作為基因組DNA通常來源的所有類型的生物來源，包括(但不限于)含有 DNA的細(xì)胞或細(xì)胞組分、細(xì)胞系、活檢樣本、體液(例如血液、痰、糞便、尿液、腦脊 液、精液)、石蠟包埋組織(例如來自眼、腸、腎、腦、心臟、前列腺、肺、乳房或肝的 組織)、組織切片、以及它們的所有可能的組合。合適的生物樣本可以在配制用于診斷 目的的標(biāo)記物之后采集和獲取。樣本可以得自細(xì)胞群或預(yù)測(cè)患有疾病或?yàn)榧膊”硇偷慕M 織?；蚪MDNA可以得自優(yōu)質(zhì)源，使得樣本只含有所關(guān)注的組織類型、污染最低并且 DNA片段化最低。制備樣本需要收集患者樣本。本發(fā)明的方法中使用的患者樣本是指疑似含有患 病細(xì)胞(例如，取自結(jié)腸樣本內(nèi)的原發(fā)腫瘤的上皮細(xì)胞或取自外科手術(shù)切緣的上皮細(xì)胞) 的樣本。激光捕獲顯微切割(LCM)技術(shù)是選擇待研究細(xì)胞的一種方式，該技術(shù)可以最大 限度減少因細(xì)胞異質(zhì)性導(dǎo)致的變異性。因此，很容易檢測(cè)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間在基因 表達(dá)方面的中等或微小變化。樣本也可以包括提取自周邊血液的循環(huán)上皮細(xì)胞。這類樣 本可以采用多種方法獲得，但最優(yōu)選的方法是美國(guó)專利6136182中描述的磁分離技術(shù)。 在已經(jīng)獲得含有所關(guān)注細(xì)胞的樣本之后，提取和擴(kuò)增DNA，并獲得胞嘧啶甲基化譜圖， 以用于適當(dāng)組合中的基因。DNA甲基化及其相關(guān)方法在(例如)下列專利中有所討論美國(guó)專利公 布 No.20020197639, 20030022215, 20030032026, 20030082600, 20030087258, 20030096289, 20030129620, 20030148290, 20030157510, 20030170684, 20030215842, 20030224040, 20030232351, 20040023279, 20040038245, 20040048275, 20040072197, 20040086944, 20040101843, 20040115663, 20040132048, 20040137474, 20040146866, 20040146868, 20040152080, 20040171118, 20040203048, 20040241704, 20040248090, 20040248120, 20040265814, 20050009059, 20050019762, 20050026183, 20050053937, 20050064428, 20050069879, 20050079527, 20050089870, 20050130172, 20050153296, 20050196792, 20050208491, 20050208538, 20050214812, 20050233340、20050239101、20050260630、20050266458、20050287553 以及美國(guó)專禾Ij No.5786146、 6214556、 6251594、 6331393 和 6335165。DNA修飾試劑盒可商購(gòu)獲得，這些試劑盒可以將具有未甲基化胞嘧啶的純化基 因組DNA轉(zhuǎn)化為缺少未甲基化胞嘧啶但具有額外的尿嘧啶的基因組。該處理方法是一個(gè) 兩步驟的化學(xué)過程，其包括由亞硫酸氫鹽催化的脫氨基反應(yīng)步驟和由氫氧化鈉催化的脫 磺酸基反應(yīng)步驟。通常，脫氨基反應(yīng)是在液體中進(jìn)行，并通過在冰上孵育來 終止反應(yīng)，然后加入柱結(jié)合緩沖液。固相結(jié)合和洗滌之后，洗脫DNA，并且在液體中進(jìn)行脫磺酸基 反應(yīng)。加入乙醇終止反應(yīng)，然后通過沉淀凈化修飾過的DNA。然而，可商購(gòu)獲得的兩 種試劑盒(Zymo和Chemicon)都是在DNA結(jié)合到反應(yīng)柱的情況下進(jìn)行脫磺酸基反應(yīng)，然 后通過洗滌反應(yīng)柱終止反應(yīng)。將處理過的DNA從反應(yīng)柱上洗脫，準(zhǔn)備進(jìn)行MSP檢測(cè)分 析。DNA分離步驟可以按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。DNA可以從任何合適的身體樣本(例 如，來自組織的細(xì)胞(新鮮或固定樣本)、血液(包括血清和血漿)、精液、尿液、淋巴 或骨髓)中分離。對(duì)于某些類型的身體樣本，尤其是諸如血液、精液、尿液和淋巴之類 的液體樣本，優(yōu)選的是首先對(duì)樣本進(jìn)行處理，以富集某些細(xì)胞類型(如前列腺細(xì)胞)的濃 度。一種合適的富集方法涉及使用與磁珠結(jié)合的細(xì)胞特異性抗體和磁性細(xì)胞分離裝置分 離所需細(xì)胞。在擴(kuò)增步驟之前，優(yōu)選地對(duì)分離的DNA進(jìn)行處理，使得未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化 為尿嘧啶或能夠與腺嘌呤形成堿基對(duì)的另一種核苷酸，而甲基化的胞嘧啶則保持不變或 轉(zhuǎn)化為能夠與鳥嘌呤形成堿基對(duì)的核苷酸。優(yōu)選地，在對(duì)分離的DNA進(jìn)行處理和擴(kuò)增之后進(jìn)行試驗(yàn)，以確認(rèn)未甲基化的胞 嘧啶已經(jīng)有效轉(zhuǎn)化為尿嘧啶或能夠與腺嘌呤形成堿基對(duì)的另一種核苷酸，而甲基化的胞 嘧啶則保持不變或有效轉(zhuǎn)化為能夠與鳥嘌呤形成堿基對(duì)的另一種核苷酸。優(yōu)選地，對(duì)分離的DNA的處理涉及按照標(biāo)準(zhǔn)方案將分離的DNA與亞硫酸氫鹽 反應(yīng)。在用亞硫酸氫鹽處理過程中，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧 啶則保持不變。通過下列步驟可以驗(yàn)證未甲基化的胞嘧啶已經(jīng)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化 的胞嘧啶保持不變G)用合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)處理和擴(kuò)增后的DNA的等分試樣進(jìn)行 限制性酶切，所用限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別亞硫酸氫鹽產(chǎn)生的或耐受亞硫酸氫鹽的限制性 酶切位點(diǎn)；以及Gi)通過電泳評(píng)價(jià)限制性片段模式。作為另外一種選擇，可使用靶向處 理過的DNA的特定區(qū)域(該區(qū)域的未甲基化胞嘧啶已轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保 持不變)的特異性寡核苷酸進(jìn)行差異雜交來加以驗(yàn)證。擴(kuò)增步驟可以涉及聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增、連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增等。優(yōu)選地，擴(kuò)增步驟按照PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行，在這種情況下，反應(yīng)物通常 為合適的引物、dNTP和熱穩(wěn)定DNA聚合酶，并且反應(yīng)條件為循環(huán)變化的溫度和時(shí)間， 以交替進(jìn)行雙鏈變性、引物退火(如在高度嚴(yán)格的雜交條件下)和后續(xù)的DNA合成。為了實(shí)現(xiàn)用亞硫酸氫鹽處理的DNA進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增，可利用弓I物和條件來 區(qū)分包含異常胞嘧啶甲基化位點(diǎn)的靶區(qū)與沒有異常胞嘧啶甲基化位點(diǎn)的靶區(qū)。因此，為 了只擴(kuò)增異常胞嘧啶甲基化發(fā)生的所述位點(diǎn)被甲基化的靶區(qū)，用于對(duì)亞硫酸氫鹽處理過 的DNA退火的引物(即反向引物)可以包含位于其與甲基化胞嘧啶形成堿基對(duì)的位點(diǎn)處 的鳥嘌呤核苷酸。如果分離的DNA內(nèi)的靶區(qū)在異常胞嘧啶甲基化發(fā)生的位點(diǎn)處具有未 甲基化的胞嘧啶核苷酸(該核苷酸經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理已轉(zhuǎn)化為尿嘧啶)，此類引物將形 成失配。用于對(duì)相對(duì)鏈退火的引物(即正向引物)可以包含在對(duì)應(yīng)于亞硫酸氫鹽處理的 DNA內(nèi)的甲基化胞嘧啶的位點(diǎn)的任何位點(diǎn)處的胞嘧啶核苷酸。擴(kuò)增步驟用來擴(kuò)增GST-Pi基因和/或其調(diào) 控旁側(cè)序列內(nèi)的靶區(qū)。調(diào)控旁側(cè)序列 可以看作GST-Pi基因的5'和3'旁側(cè)序列，該序列包括調(diào)控(單獨(dú)或與另一個(gè)類似元件一起)GST-Pi基因表達(dá)的元件?？梢酝ㄟ^不涉及選擇性擴(kuò)增的方法來檢測(cè)異常胞嘧啶甲基化的位點(diǎn)，以對(duì)疾病 進(jìn)行診斷或預(yù)后。例如，可以將寡核苷酸/多核苷酸探針設(shè)計(jì)為在采用亞硫酸氫鹽處理 的DNA進(jìn)行的雜交研究(如Southern印跡)中使用，該DNA在適當(dāng)嚴(yán)格的雜交條件下， 選擇性地僅與包含胞嘧啶異常甲基化位點(diǎn)的DNA雜交。作為另外一種選擇，適當(dāng)選擇的 特征性限制性內(nèi)切酶可用來產(chǎn)生區(qū)分包含胞嘧啶異常甲基化的位點(diǎn)的DNA和不包含該位 點(diǎn)的DNA的限制性片段模式。本發(fā)明的方法還可以包括將含核酸標(biāo)本與修飾未甲基化胞嘧啶的試劑接觸； 利用CpG特異性寡核苷酸引物擴(kuò)增標(biāo)本內(nèi)的含CpG的核酸；以及檢測(cè)甲基化的核酸。優(yōu) 選的修飾為將未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化為另一種核苷酸，以將未甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧 啶區(qū)分開。優(yōu)選地，試劑將未甲基化胞嘧啶修飾為尿嘧啶，并且該試劑為亞硫酸氫鈉， 然而，也可以使用修飾未甲基化胞嘧啶而不能修飾甲基化胞嘧啶的其他試劑。亞硫酸氫 鈉(NaHSO 3)修飾是最優(yōu)選的，亞硫酸氫鈉很容易與胞嘧啶的5，6-雙鍵反應(yīng)，卻很難 與甲基化胞嘧啶反應(yīng)。胞嘧啶與亞硫酸氫根離子反應(yīng)形成易發(fā)生脫氨基反應(yīng)的磺化胞嘧 啶反應(yīng)中間體，從而產(chǎn)生磺化尿嘧啶。堿性條件下可以去除磺酸基，從而導(dǎo)致尿嘧啶形 成。Taq聚合酶將尿嘧啶識(shí)別為胸腺嘧啶，因而在PCR之后所得產(chǎn)物只在起始模板內(nèi)出 現(xiàn)5-甲基胞嘧啶的位置含有胞嘧啶。Scorpion報(bào)告基因和試劑以及其他檢測(cè)體系也可以 類似地將以此方式處理過的修飾類與未修飾類區(qū)分開。在本發(fā)明中，用于對(duì)標(biāo)本中修飾(例如用亞硫酸氫鹽)之后的含CpG核酸進(jìn)行 擴(kuò)增的引物可特異性地識(shí)別未處理DNA、甲基化DNA和未甲基化DNA。在甲基化特異 性PCR(MSPCR)中，擴(kuò)增未甲基化DNA的引物或引發(fā)序列優(yōu)選地在3' CG堿基對(duì)內(nèi)具 有T，以便將其與甲基化DNA內(nèi)保留的C區(qū)分開，并且互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)用于反義引物。擴(kuò) 增未甲基化DNA的MSP引物或引發(fā)序列通常在序列中含有相對(duì)較少的C或G，因?yàn)檎x 引物中不含C，反義引物中不含G(C被修飾為U(尿嘧啶)，U又被擴(kuò)增為擴(kuò)增產(chǎn)物中的 T(胸腺嘧啶))。本發(fā)明的引物為具有足夠長(zhǎng)度和正確序列的寡核苷酸，以在多態(tài)性位點(diǎn)內(nèi)的大 量核酸上特異性地引發(fā)聚合反應(yīng)。當(dāng)接觸適當(dāng)?shù)奶结樆驁?bào)告基因時(shí)，被擴(kuò)增的序列顯現(xiàn) 甲基化狀態(tài)，從而提供診斷信息。優(yōu)選引物最優(yōu)選為能夠引發(fā)引物延伸產(chǎn)物合成的八個(gè) 或更多個(gè)脫氧核苷酸或核糖核苷酸，該引物延伸產(chǎn)物與多態(tài)性位點(diǎn)鏈基本上互補(bǔ)。有利 于合成的環(huán)境條件包括存在核苷三磷酸和用于聚合反應(yīng)的試劑(例如DNA聚合酶)以及 適當(dāng)?shù)臏囟扰cpH。引物或引發(fā)序列的引發(fā)片段優(yōu)選為單鏈，以使擴(kuò)增效率最大化，但 也可以為雙鏈。如果為雙鏈，則在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先應(yīng)處理引物，以分離兩條 鏈。引物必須足夠長(zhǎng)，以在存在聚合反應(yīng)誘發(fā)劑的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的 精確長(zhǎng)度取決于諸如溫度、緩沖液、陽離子和核苷酸組合物之類的因素。寡核苷酸引物 最優(yōu)選地含有約12-20個(gè)核苷酸，但也可以含有更多或更少核苷酸，優(yōu)選根據(jù)熟知的設(shè) 計(jì)指南或準(zhǔn)則設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)為與待擴(kuò)增的基因組位點(diǎn)的每條鏈基本上互補(bǔ)，并且包含 上述適當(dāng)?shù)腉或C核苷酸。這意味著引物必須具有足夠的互補(bǔ)性，以便在允許聚合反應(yīng) 試劑作用的條件下與它們各自的鏈雜交。換句話講，引物應(yīng)具有與5'和3'旁側(cè)序列的 足夠互補(bǔ)性，以便雜交并允許基因組位點(diǎn)擴(kuò)增。引物用于擴(kuò)增過程。也就是說，相對(duì)于所涉及的反應(yīng)步驟數(shù)，反應(yīng)(優(yōu)選為酶鏈反應(yīng))產(chǎn)生更多靶位點(diǎn)。在最優(yōu)選實(shí)施例中， 反應(yīng)產(chǎn)生數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增加的更多靶位點(diǎn)。諸如此類的反應(yīng)包括PCR反應(yīng)。通常，一 條引物與該位點(diǎn)的負(fù)(_)鏈互補(bǔ)，另一條引物與正(+)鏈互補(bǔ)。將引物與變性的核酸退 火之后，用諸如DNA聚合酶I大片段(Klen0w)之類的酶和核苷酸進(jìn)行延伸，會(huì)產(chǎn)生含有 靶位點(diǎn)序列的新合成的+鏈和-鏈。鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物為離散的核酸雙鏈，其末端對(duì)應(yīng)于 所采用的特異性引物的末端。引物可以使用任何合適的方法制備，例如包括自動(dòng)化方法在內(nèi)的常規(guī)磷酸三酯 和磷酸二酯方法。在一個(gè)此類自動(dòng)化實(shí)施例中，使用二乙基亞磷酰胺作為原料，并按照 Beaucage等人(1981)所述方法進(jìn)行合成。美國(guó)專利No.4458066描述了一種用于在改性 的固體載體上合成寡核苷酸的方法。采自尿液或尿 道沖洗液的任何核酸標(biāo)本，不論是否為純化形式，都可以用作起 始核酸，前提是其包含或疑似包含含有靶位點(diǎn)(如CpG)的特異性核酸序列。因此，該方 法可以采用(例如)DNA或RNA(包括信使RNA)。DNA或RNA可以為單鏈或雙鏈。 當(dāng)RNA用作模板時(shí)，將采用最適于將模板反轉(zhuǎn)錄成DNA的酶和/或條件。此外，可以 采用含有各自的一條鏈的DNA-RNA雜合體。也可以采用核酸混合物，或者也可以采用 在上述擴(kuò)增反應(yīng)中使用相同或不同引物產(chǎn)生的核酸。待擴(kuò)增的特異性核酸序列(即靶位 點(diǎn))可以為大分子的一部分，或者可以最初以離散分子形式存在，以使得該特異性序列 構(gòu)成整個(gè)核酸。如果提取的樣本不純，則可以在擴(kuò)增之前用適量的試劑對(duì)樣本進(jìn)行處理，試劑 數(shù)量應(yīng)可以有效裂開樣本的細(xì)胞、流體、組織或動(dòng)物細(xì)胞膜，并且可以暴露和/或分離 核酸的鏈。用以暴露和分離鏈的這一裂解和核酸變性步驟會(huì)使擴(kuò)增更容易發(fā)生。當(dāng)樣本的靶核酸序列含有兩條鏈時(shí)，需要在用作模板前將核酸的兩條鏈分 離。鏈分離可以作為單獨(dú)的步驟進(jìn)行，或者與引物延伸產(chǎn)物的合成同時(shí)進(jìn)行。鏈分 離可以采用多種合適的變性條件(包括物理、化學(xué)或酶方法)實(shí)現(xiàn)。一種分離核酸鏈 的物理方法涉及加熱核酸直至其變性。典型的熱變性可以涉及約80至105°C范圍內(nèi)的 溫度和長(zhǎng)達(dá)10分鐘的加熱時(shí)間。鏈分離也可以由被稱為解旋酶的一類酶或RecA酶 誘發(fā)，RecA酶具有解旋酶活性，并且已知在存在riboATP的情況下也可以使DNA變 性。KuhnHoffmann-Berling(1978)描述了適合使用解旋酶對(duì)核酸解鏈的反應(yīng)條件。 C.Radding(1982)綜述了使用RecA的技術(shù)。這些技術(shù)的改進(jìn)技術(shù)現(xiàn)在也為人們所熟知。當(dāng)互補(bǔ)的核酸鏈被分離時(shí)，不論核酸原來是雙鏈或是單鏈，分離后的鏈都適合 用作合成另外的核酸鏈的模板。這種合成在允許引物與模板雜交的條件下進(jìn)行。通常， 合成是在緩沖的水溶液中進(jìn)行，該緩沖的水溶液優(yōu)選的pH值為7-9，最優(yōu)選的pH值為約 8。在含有分離的模板鏈的緩沖液中優(yōu)選地加入摩爾過量的兩種寡核苷酸引物(對(duì)于基因 組核酸，引物與模板的比率通常為約108 1)。當(dāng)本發(fā)明的方法用于診斷應(yīng)用時(shí)，互補(bǔ) 鏈的數(shù)量可能是未知的，因此無法始終確切知道引物的數(shù)量相對(duì)于互補(bǔ)鏈的數(shù)量。然而 在實(shí)踐中，當(dāng)復(fù)雜核酸長(zhǎng)鏈的混合物中含有待擴(kuò)增序列時(shí)，所添加的引物的摩爾量通常 超出互補(bǔ)鏈(模板)的摩爾量。優(yōu)選采用較大的摩爾過量，以提高該方法的效率。將足量的脫氧核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP單獨(dú)或與引物一起加入 合成混合物，并將所得溶液加熱至約90-10(TC，加熱時(shí)間最多10分鐘，優(yōu)選1至4分鐘。加熱之后，將溶液冷卻至室溫，以有利于引物雜交。向冷卻的混合物中加入用于 進(jìn)行引物延伸反應(yīng)的適當(dāng)?shù)脑噭?“聚合反應(yīng)試劑”)，并在本領(lǐng)域已知的條件下進(jìn)行反 應(yīng)。如果聚合反應(yīng)試劑具有熱穩(wěn)定性，則也可以與其他試劑一起加入。該合成(或擴(kuò)增) 反應(yīng)可以在從室溫到聚合反應(yīng)試劑不再起作用的溫度下進(jìn)行。聚合反應(yīng)試劑可以為會(huì)實(shí) 現(xiàn)引物延伸產(chǎn)物合成的任何化合物或體系，優(yōu)選為酶。用于此目的的合適的酶包括(例 如)大腸桿菌DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、 其他可用的DNA聚合酶、聚合酶突變型、逆轉(zhuǎn)錄酶和其他酶，其中包括熱穩(wěn)定酶(例如 在經(jīng)受足以引起變性的高溫之后仍能進(jìn)行引物延伸的酶)。優(yōu)選試劑為Taq聚合酶。合 適的酶將有利于核苷酸以正確的方式組合，從而形成與每個(gè)位點(diǎn)核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸 產(chǎn)物。通常，合成將在每個(gè)引物的3'端開始，并沿著模板鏈的5'端方向繼續(xù)進(jìn)行，直 到合成結(jié)束，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的分子。然而，也可能存在在5'端開始合成并在其他方向繼 續(xù)的聚合反應(yīng)試劑，其方法與上述相同。最優(yōu)選地，擴(kuò)增方法為PCR擴(kuò)增。只要使用本發(fā)明引物通過PCR擴(kuò)增的甲基化 和未甲基化位點(diǎn)按照替代方式類似地?cái)U(kuò)增，也可以采用替代擴(kuò)增方法。在一個(gè)此類最優(yōu) 選的實(shí)施例中，檢測(cè)分析法為巢式PCR法。在巢式PCR法中，進(jìn)行了兩個(gè)或更多個(gè)分階 段的聚合酶鏈反應(yīng)。在第一階段聚合酶鏈反應(yīng)中，采用一對(duì)寡核苷酸外引物擴(kuò)增第一序 列，這對(duì)寡核苷酸外引物由分別與特定第一靶核苷酸序列兩側(cè)在5'和3'位置相連的上 下游引物組成。在后續(xù)階段，利用第二組寡核苷酸內(nèi)引物或巢式引物(也由上下游引物 組成)擴(kuò)增包含在第一靶核苷酸序列內(nèi)的較小的第二靶核苷酸序列。上下游內(nèi)引物分別與第二靶核苷酸序列兩側(cè)在5'和3'位置相連。旁側(cè)引物互 補(bǔ)于PCR過程中擴(kuò)增的雙鏈靶核苷酸序列的3'端部分的片段。第一階段聚合酶鏈反應(yīng) 中靶向擴(kuò)增的基因區(qū)內(nèi)的第一核苷酸序列旁側(cè)的5'端上游位置連有上游引物和3'端下 游位置連有下游引物。第一靶核苷酸序列以及相應(yīng)的第一階段聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物 具有預(yù)測(cè)的堿基對(duì)長(zhǎng)度，該長(zhǎng)度取決于外引物對(duì)的上游引物的5'端上游雜交位置與下游 引物的3'端下游雜交位置之間的堿基對(duì)距離。在第一階段聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)束時(shí)，對(duì)所得混合物的等分試樣繼續(xù)進(jìn)行第二階 段聚合酶鏈反應(yīng)。該反應(yīng)優(yōu)選地在密封或密閉的容器(例如得自Cepheid的“SMART CAP”裝置)內(nèi)自動(dòng)進(jìn)行。在第二階段反應(yīng)中，將第一階段反應(yīng)的產(chǎn)物與特異性內(nèi)引物 或巢式引物相混合。這些內(nèi)引物來自第一靶核苷酸序列內(nèi)的核苷酸序列，并且連接于包 含在第一靶核苷酸序列內(nèi)的較小的第二靶核苷酸序列兩側(cè)。對(duì)該混合物進(jìn)行初始變性、 退火和延伸步驟，然后再進(jìn)行與前述方式一樣的熱循環(huán)，從而可使第二靶核苷酸序列反 復(fù)進(jìn)行變性、退火和延伸或復(fù)制。該第二靶核苷酸序列旁側(cè)的5'端上游位置連有上游引 物和3'端下游位置連有下游引物。第二靶核苷酸序列以及相應(yīng)的第二階段PCR的擴(kuò)增 產(chǎn)物也具有預(yù)測(cè)的堿基對(duì)長(zhǎng)度，該長(zhǎng)度取決于內(nèi)引物對(duì)的上游引物的5'端上游雜交位置 與下游引物的3'端下游雜交位置之間的堿基對(duì)距離。擴(kuò)增產(chǎn)物優(yōu)選地用該產(chǎn)物的特異性探針或報(bào)告基因識(shí)別為甲基化或未甲基化 的，如美國(guó)專利4683195所描述。用于檢測(cè)多核苷酸的探針和報(bào)告基因領(lǐng)域的進(jìn)展是本 領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。任選地，可通過 其他技術(shù)(例如限制性內(nèi)切酶酶切和Southern印跡分析)驗(yàn)證核酸的甲基化模式。可用來檢測(cè)5' CpG甲基化的甲基化敏感限制性內(nèi)切酶的例子包括 SmaK SacIK EagK MspK HpaIK BstUI 禾P BssHII。在本發(fā)明的另一方面，采用甲基化比率。這可通過確定所得標(biāo)記物的擴(kuò)增的甲 基化類與擴(kuò)增的基準(zhǔn)標(biāo)記物或擴(kuò)增的未甲基化標(biāo)記物區(qū)域的數(shù)量之間的比率來進(jìn)行。采 用甲基化比率時(shí)，最好使用定量實(shí)時(shí)PCR。高于已確定或預(yù)定的截止值或閾值的比率將 視為高甲基化并表征患有諸如癌癥(對(duì)于GSTPl來說為前列腺癌)之類增生性疾病。按 照已知的方法確定截止值，這些方法用于至少兩組樣本具有已知的疾病狀態(tài)的樣本和具有已知的正常狀態(tài)的樣本。本發(fā)明的基準(zhǔn)標(biāo)記物也可以用作內(nèi)參?；鶞?zhǔn)標(biāo)記物優(yōu)選為 在樣本的細(xì)胞內(nèi)組成型表達(dá)的基因，例如β肌動(dòng)蛋白基因(β-Actin)。確定值或預(yù)定值(截止值或閾值)也可以在根據(jù)本發(fā)明的不使用比率的方法中確 定和使用。在這種情況下，截止值是相對(duì)于某些基線值而確定的甲基化數(shù)量或程度，其 中基線值的例子有正常樣本的甲基化數(shù)量或程度、或者癌癥在臨床上不明顯(被認(rèn)為 未發(fā)展到臨床上顯著的狀態(tài)或非侵襲性)的樣本的甲基化數(shù)量或程度。就像其在基于甲 基化比率的方法中的應(yīng)用一樣，這些截止值是按照熟知的方法確定的。由于與標(biāo)記物相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄水平降低往往是由多核苷酸序列和/或表達(dá)控 制序列(如啟動(dòng)子序列)的特定元件的高甲基化引起，制備了為匹配這些序列而制備的引 物。因此，本發(fā)明提供了通過檢測(cè)特定區(qū)域(優(yōu)選地在標(biāo)記物的表達(dá)控制區(qū)或啟動(dòng)子區(qū) 內(nèi))的甲基化而檢測(cè)或診斷細(xì)胞增殖疾病的方法。在此類診斷或預(yù)后方法中可以使用用 于檢測(cè)這些區(qū)域的甲基化的探針。本發(fā)明的試劑盒可由多種組分構(gòu)成，前提條件是這些組分都含有至少一種引物 或探針或檢測(cè)分子(如Scorpion報(bào)告基因)。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括用于擴(kuò)增和檢 測(cè)甲基化標(biāo)記物片段的試劑。任選地，試劑盒包括樣本制備試劑和/或制品(如試管)， 以從樣本提取核酸。在優(yōu)選試劑盒中，包括了一管式MSP所需的試劑，例如，對(duì)應(yīng)的PCR引物組、 熱穩(wěn)定DNA聚合酶(如Taq聚合酶)和合適的檢測(cè)試劑(如水解探針或分子信標(biāo))。在 任選的優(yōu)選試劑盒中，檢測(cè)試劑為Scorpion報(bào)告基因或試劑。也可以使用單染料引物或 雙鏈DNA特異性熒光染料(例如溴化乙錠)。引物優(yōu)選為產(chǎn)生高濃度的量。試劑盒中的 額外材料可以包括合適的反應(yīng)試管或管形瓶、屏蔽組分，通常是蠟珠，任選包括鎂； 必要的緩沖液和試劑，例如dNTP;可用于MSP反應(yīng)的對(duì)照核酸和/或任何額外的緩沖 液、化合物、輔因子、離子組分、蛋白質(zhì)和酶、聚合物等?？扇芜x地，試劑盒包括核酸 提取試劑和材料。生物標(biāo)記為核酸/蛋白質(zhì)指示標(biāo)記物的任何標(biāo)記。核酸可以為本領(lǐng)域已知的任 何核酸，包括(但不限于)細(xì)胞核、線粒體(同質(zhì)、異質(zhì))、病毒、細(xì)菌、真菌、支原 體等的核酸。標(biāo)記可以為直接或間接的，并且可在給定生理參數(shù)條件下以及與內(nèi)參、安 慰劑、正常組織或另一惡性腫瘤進(jìn)行比較時(shí)，測(cè)量基因過表達(dá)或低表達(dá)。生物標(biāo)記包 括(但不限于)核酸和蛋白質(zhì)(均有過表達(dá)和低表達(dá)以及直接和間接之分)。使用核酸 作為生物標(biāo)記的方法可以包括本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于)測(cè)量DNA的擴(kuò) 增、缺失、插入和復(fù)制；測(cè)量RNA;測(cè)量微RNA(miRNA)；測(cè)量雜合性丟失(LOH)； 直接或經(jīng)基因組擴(kuò)增后測(cè)量單核苷酸多態(tài)性(SNPs，Brookes(1999)),拷貝數(shù)多態(tài)性(CNPs)；測(cè)量微衛(wèi)星DNA ；測(cè)量表觀遺傳改變(例如DNA高甲基化或低甲基化)和 FISH。使用蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)記的方法包括本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于) 測(cè)量數(shù)量、活性、修飾(例如糖基化、磷酸化、ADP核糖基化、泛素化等)或免疫組織化 學(xué)(IHC)和代謝周轉(zhuǎn)。其他生物標(biāo)記包括成像、分子譜、細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞凋亡標(biāo)記物。當(dāng)標(biāo)記基因含有SeqJD No.指定的序列時(shí)，其對(duì)應(yīng)于該序列。當(dāng)基因區(qū)段或片 段含有足以表明其為該基因序列的一部分參考序列或其互補(bǔ)序列時(shí)，其對(duì)應(yīng)于此基因序 列。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn)物中的RNA、mRNA或cDNA雜交到含有此序列(如探針)的組合物 上時(shí)，其對(duì)應(yīng)于此序列，或者對(duì)于肽或蛋白質(zhì)來說，其被該mRNA編碼。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn) 物的區(qū) 段或片段含有足以表明其為該基因序列或基因表達(dá)產(chǎn)物序列的一部分參考基因表 達(dá)產(chǎn)物或其互補(bǔ)序列時(shí)，其對(duì)應(yīng)于此基因序列或基因表達(dá)產(chǎn)物序列。本說明書所描述和受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明的方法、組合物、制品或試劑盒 包括一種或多種標(biāo)記基因。在整個(gè)本說明書中使用的“標(biāo)記物”或“標(biāo)記基因”是指 對(duì)應(yīng)于如下任何基因的基因或基因表達(dá)產(chǎn)物該基因的過表達(dá)或低表達(dá)與指示或組織類 型相關(guān)。建立基因表達(dá)譜的優(yōu)選方法包括測(cè)定RNA的量，該RNA由能夠編碼蛋白質(zhì)或肽 的基因生成。此測(cè)定通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、實(shí)時(shí)RT-PCR、差異 顯示RT-PCR、Northern印跡分析和其他相關(guān)的測(cè)試實(shí)現(xiàn)。雖然可以采用單個(gè)PCR反應(yīng)來 實(shí)施這些技術(shù)，但最好擴(kuò)增由mRNA產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA(cDNA)或互補(bǔ)RNA(cRNA)，并 使用微陣列對(duì)其進(jìn)行分析。多種不同的陣列構(gòu)型及其制備方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知 的，并在如下專利中有所描述，例如5445934、5532128、5556752、5242974、5384261、 5405783, 5412087, 5424186, 5429807, 5436327, 5472672, 5527681, 5529756, 5545531、 5554501、 5561071、 5571639、 5593839、 5599695、 5624711、 5658734 和 5700637。微陣列技術(shù)允許同時(shí)測(cè)量數(shù)千種基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平，從而提供了識(shí)別細(xì)胞 增殖失控的效應(yīng)(如啟動(dòng)、阻滯或調(diào)控)的強(qiáng)大工具。目前廣泛使用的微陣列技術(shù)有兩 種。第一種是cDNA陣列，第二種是寡核苷酸陣列。雖然這些芯片的構(gòu)造存在差異，但 是基本上所有的下游數(shù)據(jù)分析和輸出都是相同的。這些分析的結(jié)果通常為接收自標(biāo)記探 針的信號(hào)的強(qiáng)度的測(cè)量值，該標(biāo)記探針用于檢測(cè)來自樣本的cDNA序列，該cDNA序列在 微陣列的已知位置上與核酸序列雜交。信號(hào)強(qiáng)度通常與cDNA的量成比例，因此也與在 樣本細(xì)胞中表達(dá)的mRNA成比例。大量的此類技術(shù)是可得的并且可用的。用于確定基 因表達(dá)的優(yōu)選方法可見于美國(guó)專利6271002、6218122、6218114和6004755。通過比較此類信號(hào)強(qiáng)度可以分析表達(dá)水平。完成該比較最好的方式是生成試驗(yàn) 樣本與對(duì)照樣本中基因表達(dá)強(qiáng)度的比率矩陣。例如，可以將來自患病組織的基因表達(dá)強(qiáng) 度與相同類型的良性或正常組織產(chǎn)生的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行比較。這些表達(dá)強(qiáng)度的比值反映了 試驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本之間在基因表達(dá)上的倍數(shù)變化。選擇可以基于產(chǎn)生序列表的統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)，該序列表與腫瘤起源的原發(fā)部位相關(guān)的 因子之間的每個(gè)基因的差異表達(dá)的顯著性證據(jù)有關(guān)。此類試驗(yàn)的例子包括ANOVA和 Kraskal-Wallis。列表中的名次可以作為模型中的權(quán)重，該模型設(shè)計(jì)用于將這種權(quán)重總和 (最多到截止值)解釋為有利于一類而不利于另一類的優(yōu)勢(shì)證據(jù)。文獻(xiàn)中描述的之前的證據(jù)也可以用來調(diào)整權(quán)重。優(yōu)選的實(shí)施 例通過識(shí)別穩(wěn)定的對(duì)照組，并將此組換算成所有樣本之間的方差為 零，從而將每個(gè)測(cè)量值歸一化。將該對(duì)照組定義為受測(cè)定的系統(tǒng)誤差影響并且已知不會(huì) 獨(dú)立于該誤差而改變的任何單個(gè)內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物或內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物組。所有標(biāo)記物都通過產(chǎn)生零 方差的樣本特異性因子調(diào)整，以用于對(duì)照組的任何描述性統(tǒng)計(jì)量(如平均值或中值)或用 于直接測(cè)量。作為另外一種選擇，如果對(duì)照組方差只與系統(tǒng)誤差有關(guān)的假設(shè)不真，而進(jìn) 行歸一化時(shí)所得分類誤差較小，則對(duì)照組仍然按照規(guī)定使用。非內(nèi)源峰值對(duì)照也可能是 有用的，但不是優(yōu)選的。基因表達(dá)譜可以多種方式顯示。最常見的方式是將原始熒光強(qiáng)度或比率矩陣 布置到樹狀圖中，其中列表示試驗(yàn)樣本，行表示基因。如此布置數(shù)據(jù)可以使有相似 表達(dá)譜的基因彼此相鄰。每個(gè)基因的表達(dá)比率用顏色來直觀表示。例如，小于1的 比率(下調(diào))出現(xiàn)在圖譜的藍(lán)色部分，而大于1的比率(上調(diào))出現(xiàn)在圖譜的紅色部 分?？缮藤?gòu)獲得的計(jì)算機(jī)軟件程序可用于顯示此類數(shù)據(jù)，這些計(jì)算機(jī)軟件程序包括
“Genespring" (SiliconGenetics， Inc.)禾口 ‘‘Discovery” 與"Infer" (Partek, Inc.)。就測(cè)量蛋白質(zhì)含量來確定基因表達(dá)而言，本領(lǐng)域任何已知的方法都是合適的， 只要其可導(dǎo)致足夠的特異性和靈敏度。例如，可通過使蛋白質(zhì)結(jié)合至該蛋白質(zhì)特異性的 抗體或抗體片段，并測(cè)量抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的量來測(cè)量蛋白質(zhì)含量?？捎梅派湫詿晒庠?劑或其他可檢測(cè)試劑標(biāo)記抗體，以方便檢測(cè)。檢測(cè)方法包括(但不限于)酶聯(lián)免疫吸附 測(cè)定法(ELISA)和免疫印跡技術(shù)。在本發(fā)明的方法中使用的調(diào)控基因在“實(shí)例”中有所描述。相對(duì)于不同起源惡 性腫瘤患者而言，差異表達(dá)的基因在特定起源惡性腫瘤患者中或者上調(diào)或者下調(diào)。上調(diào) 和下調(diào)為相對(duì)術(shù)語，其表示基因表達(dá)量相對(duì)于某些基線存在可識(shí)別差值(超出用來測(cè)量 的系統(tǒng)中的噪音的貢獻(xiàn))。在這種情況下，根據(jù)算法確定基線。然后使用相同的測(cè)量方法 可測(cè)得患病細(xì)胞中所關(guān)注的基因相對(duì)于基線水平或者上調(diào)或者下調(diào)。在上下文中，“患 病的”是指由細(xì)胞不可控制的增殖引起的阻斷或干擾或潛在干擾機(jī)體功能正常發(fā)揮的機(jī) 體狀態(tài)變化。當(dāng)某人的基因型或表型的某些方面與疾病的存在相符時(shí)，此人被診斷為患 有此疾病。然而，進(jìn)行診斷或預(yù)后的行為可以包括確定疾病/狀況事宜，例如確定復(fù)發(fā) 可能性、治療類型和治療監(jiān)控。在治療監(jiān)控中，通過比較基因表達(dá)隨時(shí)間的變化，確定 是否基因表達(dá)譜已經(jīng)變化為或正變化為更符合正常組織的模式，從而就給定療程的效果 做出臨床判斷?？梢詫?duì)基因進(jìn)行分組，以便獲得的關(guān)于在此組中基因集合的信息提供作出臨床 相關(guān)判斷(例如診斷、預(yù)后或治療選擇)的重要依據(jù)。這些基因集合構(gòu)成本發(fā)明的組合。 對(duì)于大部分診斷標(biāo)記物，通常希望使用足以作出正確醫(yī)療判斷的數(shù)量最少的標(biāo)記物。這 樣可以防止為等待進(jìn)一步分析而延誤治療，并防止無謂地浪費(fèi)時(shí)間和資源。確定基因表達(dá)組合的一種方法是通過使用優(yōu)化算法，例如在確定股票投資組合 時(shí)廣泛使用的均值方差算法。該方法在20030194734中有詳細(xì)描述?；旧希摲椒?需要確定一組輸入值(金融應(yīng)用中的股票，此處則為用強(qiáng)度衡量的表達(dá))，該輸入值會(huì) 優(yōu)化使用它所獲得的收益(如產(chǎn)生的信號(hào))，同時(shí)又使收益的不確定性最低。許多商業(yè) 軟件程序可以進(jìn)行這種運(yùn)算。優(yōu)選使用本說明書中稱為“Wagner軟件”的“WagnerAssociatesMean-Variance Optimization Application” (Wagner Associates 均值-方差優(yōu)化應(yīng) 用程序)。該軟件使用 “Wagner Associates Mean—VarianceOptimization Library” (Wagner Associate s均值-方差優(yōu)化庫)中的函數(shù)確定有效邊界，優(yōu)選采用馬可維茨理論中的優(yōu)化 投資組合(Markowitz(1952))。使用這類軟件需要轉(zhuǎn)化微陣列數(shù)據(jù)，以便以股票收益方 式將該數(shù)據(jù)作為輸入處理，并且在該軟件用于所需財(cái)務(wù)分析目的時(shí)，需要使用風(fēng)險(xiǎn)測(cè)量 值。選擇組合的方法也可以包括啟發(fā)式規(guī)則的使用。優(yōu)選地，在生物學(xué)基礎(chǔ)上和為 得出臨床結(jié)果而對(duì)該技術(shù)的理解的基礎(chǔ)上制定啟發(fā)式規(guī)則。更優(yōu)選地，將這些規(guī)則用于 優(yōu)化方法中的輸出。例如，可以將選擇組合的均值-方差方法應(yīng)用于在患有癌癥的受試 者中差異表達(dá)的多種基因的微陣列數(shù)據(jù)。該方法的輸出將為最優(yōu)基因集，該基因集可 以包括表達(dá)于周邊血液和患病組織的某些基因。如果試驗(yàn)方法中使用的樣本采自周邊血 液，并且差異表達(dá)于癌癥病例中的某些基因，也可以差異表達(dá)于周邊血液，則可以應(yīng)用 啟發(fā)式規(guī)則，其中組合選自不包括差異表達(dá)于周邊血液的那些樣本的有效邊界。當(dāng)然， 也可以在形成有效邊界之前應(yīng)用該規(guī)則，例如，在數(shù)據(jù)預(yù)選過程中應(yīng)用該規(guī)則?？梢允褂梦幢嘏c所考慮的生物學(xué)相關(guān)的其他啟發(fā)式規(guī)則。例如，可以應(yīng)用這樣 一條規(guī)則，即只有指定百分比的組合可以由特定的基因或一組基因表示?？缮藤?gòu)獲得的 軟件(例如Wagner軟件)很適合這些類型的啟發(fā)式方法。例如，當(dāng)除了準(zhǔn)確度和精度 之外的因素(如預(yù)期許可費(fèi))對(duì)是否愿意包括一個(gè)或多個(gè)基因有影響時(shí)，這種方法是可用 的。本發(fā)明的基因表達(dá)譜也可以結(jié)合在癌癥診斷、預(yù)后或治療監(jiān)控方面有用的其他 非基因診斷方法一起使用。例如，在一些情況下，將上述基于基因表達(dá)的方法的診斷作 用與來自諸如血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物(如癌癥抗原27.29 ( "CA 27.29"))之類的常規(guī)標(biāo)記物 的數(shù)據(jù)結(jié)合具有有益效果。存在一系列此類標(biāo)記物，其中包括諸如CA 27.29之類的被分 析物。在一種此類方法中，從接受治療的患者體內(nèi)定期采集血樣，然后對(duì)血樣進(jìn)行有關(guān) 上述一種血清標(biāo)記物的酶免疫分析。當(dāng)標(biāo)記物濃度顯示腫瘤復(fù)發(fā)或治療失敗，則采集適 于基因表達(dá)分析的樣本來源。當(dāng)存在可疑腫塊時(shí)，則通過細(xì)針穿刺術(shù)(FNA)采樣，然后 再按上述方法分析從腫塊中抽取的細(xì)胞的基因表達(dá)譜。作為另外一種選擇，可以從之前 移除腫瘤的組織的鄰近區(qū)域采集組織樣本。當(dāng)其他試驗(yàn)會(huì)得到含混結(jié)果時(shí)，該方法尤其 有用。分離核酸和蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見(例如)可見于萬維網(wǎng)上的 Ambion網(wǎng)址和美國(guó)專利20070054287中的有關(guān)RNA的討論。DNA分析可以為本領(lǐng)域已知的任何方法，包括(但不限于)甲基化、去甲基 化、染色體核型分析、倍體分析(非整倍體、多倍體)、DNA完整性分析(通過凝膠或 分光光度測(cè)定評(píng)價(jià))、易位、突變、基因融合、活化-鈍化、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、 拷貝數(shù)或用于檢測(cè)基因構(gòu)成的全基因組擴(kuò)增。RNA分析包括本領(lǐng)域已知的任何方法，包 括(但不限于)q-RT-PCR、miRNA或轉(zhuǎn)錄后修飾。蛋白質(zhì)分析包括本領(lǐng)域已知的任何 方法，包括(但不限于)抗體檢測(cè)、翻譯后修飾或代謝周轉(zhuǎn)。蛋白質(zhì)可以為 細(xì)胞表面標(biāo) 記物，優(yōu)選為上皮、內(nèi)皮、病毒或細(xì)胞型。生物標(biāo)記可以與病毒/細(xì)菌感染、侵害或抗 原表達(dá)有關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明制備的試劑盒包括用于確定基因表達(dá)譜的格式化檢測(cè)分析法。這些 試劑盒可以包括進(jìn)行檢測(cè)分析所需的一些或全部材料，例如試劑和指令以及在其中進(jìn)行 生物標(biāo)記檢測(cè)分析的介質(zhì)。本發(fā)明的制品包括可用于治療、診斷、預(yù)后和以其他方式評(píng)估疾病的基因表達(dá) 譜的表現(xiàn)形式。這些基因表達(dá)譜的表現(xiàn)形式被壓縮到可以由設(shè)備自動(dòng)讀取的介質(zhì)中，例 如計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)(磁性介質(zhì)、光學(xué)介質(zhì)等)。該制品也可以包括評(píng)估該介質(zhì)中的基因表 達(dá)譜的指令。例如，該制品可以包括CD ROM，該CD ROM具有比較上述基因組合的基 因表達(dá)譜的計(jì)算機(jī)指令。該制品也可以將基因表達(dá)譜以數(shù)字形式記錄在其中，以便將其 與得自患者樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。作為另外一種選擇，基因表達(dá)譜可以不同的 表示格式進(jìn)行記錄。圖 像記錄是一種此類格式。聚類算法(例如上述得自Partek，Inc. 的“DISCOVERY”和“INFER”軟件中所包括的)是可視化此類數(shù)據(jù)的最佳輔助工具。根據(jù)本發(fā)明的不同類型的制品為用來顯示基因表達(dá)譜的介質(zhì)或格式化檢測(cè)分析 法。這些制品可以包括(例如)微陣列，在微陣列中互補(bǔ)序列或探針固定到矩陣上，而表 征所關(guān)注基因的序列與固定有互補(bǔ)序列或探針的矩陣結(jié)合，從而形成對(duì)其存在的可讀判 定。作為另外一種選擇，根據(jù)本發(fā)明的制品可以制成試劑盒，該試劑盒用于進(jìn)行雜交、 擴(kuò)增和產(chǎn)生表征所關(guān)注基因表達(dá)水平的信號(hào)，以檢測(cè)癌癥。本專利申請(qǐng)的GSTPl檢測(cè)分析在測(cè)定樣本中表現(xiàn)出大幅改善的檢測(cè)分析性能。 將相同基因(GSTPl)的一種以上設(shè)計(jì)組合使用，表現(xiàn)出臨床靈敏度更高，同時(shí)具有極高 的特異性。將相同基因的兩種檢測(cè)分析組合，可提供了更簡(jiǎn)單的解決方案，以極高特異 性在給定多重檢測(cè)分析中靶向較少的基因?qū)崿F(xiàn)更高的臨床靈敏度。GSTPl多重檢測(cè)分析 設(shè)計(jì)的良好檢測(cè)分析性能使得可以從多重檢測(cè)分析中除去其他標(biāo)記基因，從而提高特異 性。在高特異性下改善的臨床靈敏度會(huì)產(chǎn)生更好的陰性預(yù)測(cè)值和陽性預(yù)測(cè)值。提供了下面的實(shí)施例以舉例說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)例 1在FFPE組織樣本中對(duì)兩種新設(shè)計(jì)(形式2和形式3)與現(xiàn)有設(shè)計(jì)(形式1)進(jìn)行 了比較。所有三種設(shè)計(jì)均在下表1中示出。表1.GSTP1檢測(cè)分析設(shè)計(jì)的描述
權(quán)利要求
1.一種前列腺癌檢測(cè)分析法，具有用于檢測(cè)多個(gè)甲基化位點(diǎn)的試劑，其中每個(gè)靶標(biāo) 指向相同基因的不同部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)分析法，其中所述基因?yàn)镚STPl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)分析法，其中至少一個(gè)甲基化位點(diǎn)在啟動(dòng)子區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)分析法，其中兩個(gè)或更多個(gè)甲基化位點(diǎn)在啟動(dòng)子區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)分析法，其中試劑檢測(cè)至少三個(gè)不同的甲基化位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)分析法，具有僅用于檢測(cè)多個(gè)甲基化位點(diǎn)的試劑，所述 多個(gè)甲基化位點(diǎn)指向相同基因的不同部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)分析法，其中所述基因?yàn)镚STPl。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)分析法，其中至少一個(gè)甲基化位點(diǎn)在啟動(dòng)子區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)分析法，其中兩個(gè)或更多個(gè)甲基化位點(diǎn)在啟動(dòng)子區(qū)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)分析法，其中試劑檢測(cè)至少三個(gè)不同的甲基化位點(diǎn)。
11.一種前列腺癌檢測(cè)分析法，具有用于檢測(cè)多個(gè)甲基化位點(diǎn)的試劑，其中所述多個(gè) 甲基化位點(diǎn)包括Seq.ID No.2和Seq.ID No.4。
12.根據(jù)權(quán)利要求12所述的檢測(cè)分析法，還包括用于檢測(cè)多個(gè)甲基化位點(diǎn)的試劑，其 中所述多個(gè)甲基化位點(diǎn)包括Seq.ID No.6。
13.—種前列腺癌檢測(cè)分析法，具有用于檢測(cè)多個(gè)甲基化位點(diǎn)的試劑，其中所述多個(gè) 甲基化位點(diǎn)包括Seq.ID No.2和Seq.ID No.6。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的檢測(cè)分析法，還包括用于檢測(cè)多個(gè)甲基化位點(diǎn)的試劑，其 中所述多個(gè)甲基化位點(diǎn)包括Seq.ID No.4。
15.一種試劑盒，包含用于檢測(cè)來自相同基因的多個(gè)甲基化核苷酸序列的試劑和轉(zhuǎn)化 試齊LU
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述轉(zhuǎn)化試劑包括亞硫酸氫鈉。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述基因?yàn)镚STPl。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述試劑設(shè)計(jì)成與FFPE組織樣本一起使用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中所述樣本為前列腺樣本。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述試劑設(shè)計(jì)成與尿液樣本一起使用。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于檢測(cè)前列腺癌的檢測(cè)分析法，包括用于檢測(cè)多個(gè)甲基化標(biāo)記物的試劑，所述多個(gè)甲基化標(biāo)記物來自諸如GSTP1的一種基因內(nèi)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102016067SQ200980107428
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者A·馬宗德, J·F·巴登, J·M·瓦戈, S·A·瓦德 申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司