基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明屬于基因突變檢測(cè)領(lǐng)域,尤其設(shè)及利用Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類EGFR基 因突變的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]人類表皮生長(zhǎng)因子受體(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)是一種由原 癌基因C-erbB-1 (肥R-1)編碼的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,廣泛表達(dá)于大部分正 常上皮細(xì)胞中。然而在許多實(shí)體腫瘤巧日非小細(xì)胞肺癌)中往往存在EGFR高表達(dá)或異常表達(dá) 的情況,運(yùn)與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移及調(diào)亡的抑制有關(guān),因此EGFR已經(jīng)成 為相關(guān)腫瘤(尤其是非小細(xì)胞肺癌)祀向治療的一個(gè)重要祀點(diǎn)。目前應(yīng)用于臨床的EGFR祀 向藥物包括:EGH?酪氨酸激酶抑制劑(TKIs,如吉非替尼即易瑞沙和厄羅替尼即特羅凱), W及EGFR單克隆抗體如西妥昔單抗。大量研究表明,吉非替尼(Gefitinib)和厄羅替尼 (化lotinib)的療效與EGFR基因尤其是其18-21號(hào)外顯子的突變狀況密切相關(guān)。攜帶EGFR 基因突變的肺癌患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑高度敏感,患者將得到很大的受益;反之野生型 基因的患者將基本不受益,因此EGFR基因檢測(cè)作為非小細(xì)胞肺癌等癌癥祀向藥物選用的 前提被列入了最新的NCCN(美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò))腫瘤臨床實(shí)踐指南。
[000引 目前報(bào)導(dǎo)的EGFR基因突變檢測(cè)方法包括Sanger測(cè)序、SCO巧ions-ARMS、TaqMan-qPCR、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP等,其中在臨床和科研中較為常用的方法為Sanger 測(cè)序法和Scorpions-ARMS(Scorpions,蝸形探針;Amplificationrefractorymutation system,擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng))法。基于Sco巧ions-ARMS法開(kāi)發(fā)的如德國(guó)Qiagen公司的 EGFR檢測(cè)試劑盒,可同時(shí)檢測(cè)EGFR基因的29種常見(jiàn)突變,具有靈敏度高(可測(cè)出低至1% 水平的突變),操作簡(jiǎn)單,快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn);然而該類進(jìn)口試劑盒檢測(cè)成本過(guò)高(每份標(biāo)本需 3000-5000元)限制了其臨床的推廣和應(yīng)用。Sanger測(cè)序法是基因突變/多樣性檢測(cè)的金 標(biāo)準(zhǔn),具有技術(shù)和平臺(tái)成熟、結(jié)果準(zhǔn)確和全面等優(yōu)點(diǎn),相比于SCO巧ions-ARMS法,檢測(cè)費(fèi)用 低廉并且還能測(cè)出未知突變;然而Sanger測(cè)序法主要的不足在于檢測(cè)靈敏度約10-20%左 右(即突變基因含量要大于10%甚至20%才能被可靠檢出),運(yùn)制約了其臨床應(yīng)用。由于體 細(xì)胞突變組分只占臨床等樣本中的一部分,除此之外還可能存在大量的野生型基因,因此 提高在大量正?;虮尘爸猩倭客蛔儥z測(cè)的靈敏性,是目前改進(jìn)或者開(kāi)發(fā)方法的關(guān)鍵。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 為了克服現(xiàn)有人類EGFR基因突變檢測(cè)方法及試劑盒的不足,本發(fā)明的目的之一 在于提供一種基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類EGFR基因突變的試劑盒;本發(fā)明的另一個(gè)目 的在于提供一種基于Sanger測(cè)序的靈敏檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法。
[0005] 由于本發(fā)明在EGFR基因特定片段的擴(kuò)增體系中加入了耐熱DNA連接酶和針對(duì)突 變位點(diǎn)的連接引物,導(dǎo)致樣品中的野生型EGFR基因片段的擴(kuò)增將受到有效的抑制,而突變 型的擴(kuò)增則基本不受影響;因此使得突變含量低至1%的樣品其最終的擴(kuò)增產(chǎn)物中突變片 段的比例高于50%,從而保證了Sanger測(cè)序?qū)τ陔s合基因片段體系的準(zhǔn)確識(shí)別。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下: 本發(fā)明首先設(shè)及一種基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物,所述引物 由擴(kuò)增引物組和連接引物組組成,所述連接引物組的核巧酸序列如SEQ.IDNO. 9-SE化ID NO. 26所示。
[0007] 其次,本發(fā)明的基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類EGFR基因突變的試劑盒,是在EGFR 基因片段擴(kuò)增體系中加入了所述的連接引物組、耐熱DM連接酶及其緩沖液。
[0008] 更具體地,基于Sanger測(cè)序靈敏檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法及其試劑盒,具體 步驟和本發(fā)明試劑盒相關(guān)內(nèi)容如下: (1)樣本采集和基因組DNA提取 采集或取出待測(cè)生物樣本如患者的腫瘤組織或外周血等,利用相應(yīng)的試劑盒提取其基 因組DNA。
[0009] (2)EGFR基因特定片段擴(kuò)增 采用本發(fā)明試劑盒分別配制EGFR基因外顯子組合的含連接酶擴(kuò)增體系,一共需要配 制5管;所配制的5管擴(kuò)增體系除了擴(kuò)增引物和連接引物不同外其余均相同,如表1所示: 表1EGFR基因外顯子擴(kuò)增體系(2加L)
同時(shí)配制對(duì)應(yīng)的不含連接引物、耐熱DNA連接酶緩沖液和耐熱DNA連接酶運(yùn)Ξ種組分 的對(duì)照擴(kuò)增體系5管,體系配制參照表1,所缺組分添加量由滅菌去離子水替補(bǔ),其余組份 同對(duì)應(yīng)的正常體系。
[0010] 共5管正常體系冷連接酶體系)和5管對(duì)照體系壞含連接酶體系)在基因擴(kuò)增 儀上進(jìn)行EGFR基因片段的擴(kuò)增,擴(kuò)增條件均為:95°C預(yù)變性5-lOmin;94°C變性15-30S, 50-53°C退火 45-90s,72°C延伸l-2min,循環(huán) 30-36 次;72°C終延伸 10-12min。
[0011] (3)目的基因片段的割膠回收 所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在0.加g/ml的邸溶液中染色20min并用清水 脫色后置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照和分析。在對(duì)照體系成功擴(kuò)增出目的基因片段的情況下, WDNAMarker條帶為標(biāo)準(zhǔn),選擇正常體系中各外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不低于lOng/uL的條帶 進(jìn)行割膠,并用凝膠純化試劑盒進(jìn)行回收。
[0012] (4)目的基因片段序列測(cè)定 對(duì)于割膠回收產(chǎn)物,按照DNA片段測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行雙向測(cè)序和分析,依據(jù)所有測(cè) 序峰圖最終分析目的基因片段的序列。
[001引(5)EGFR突變結(jié)果判定 在對(duì)照體系正常擴(kuò)增的情況下,如果正常體系中的各外顯子擴(kuò)增條帶均無(wú)滿足割膠回 收的目的條帶,則無(wú)需進(jìn)行割膠回收及后續(xù)操作直接判定樣品的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果為陰 性即野生型;如果有滿足割膠回收的目的條帶,且雙向測(cè)序結(jié)果顯示為對(duì)應(yīng)連接引物祀向 的已知突變,則判定樣品的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性即突變型,突變類型W實(shí)際測(cè)出的已 知突變?yōu)闇?zhǔn);如果雙向測(cè)序結(jié)果均為同一未知差異位點(diǎn),則需進(jìn)一步判定樣品的EGFR基因 檢測(cè)結(jié)果為新突變還是多態(tài)性,突變/多態(tài)性類型W實(shí)際測(cè)出的為準(zhǔn);如果雙向測(cè)序結(jié)果 均為野生型,則判定樣品的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果為無(wú)法判斷,需要重新測(cè)定;如果雙向測(cè)序 結(jié)果是一向?yàn)橐吧鸵幌驗(yàn)橥蛔冃?,則判定樣品的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果為無(wú)法判斷,需要重 新測(cè)定。
[0014] 其中,步驟(1)中樣本的采集對(duì)象若為腫瘤患者則應(yīng)在其充分知情同意的前提下 進(jìn)行;采集或取出的組織樣本包括但不限定于新鮮組織、冰凍組織、甲醒浸泡組織和甲醒固 定石蠟包埋組織切片,血液樣本包括但不限定于新鮮血液、血漿和血清,其它生物樣本包括 但不限定于胸水、腹水和腫瘤脫落細(xì)胞,樣本采集或取用量等取樣要求和前處理按照對(duì)應(yīng) 的基因組提取試劑盒執(zhí)行;提取樣本基因組DNA后,利用瓊脂糖凝膠電泳或吸亮度法評(píng)估 其提取量(濃度)和純度,需要保證EGFR基因片段的有效擴(kuò)增:如基因組DNA的提取量不少 于200ng,純度W0〇2日。/0〇28。在1. 8-2. 0之間為宜。
[0015] 其中,步驟(2)中采用的擴(kuò)增試劑盒組分如表2所示: 表2本發(fā)明擴(kuò)增試劑盒組分
表2組分中,DNA聚合酶的酶活力單位濃度為抓/祉,具有耐熱性能;10XPCR緩沖液 是由lOOmmol/LTris-肥 1 (pH=8. 3)、500mmol/LKC1 和 15mmol/LMgClz組成;dNTPs是由 dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2. 5mmol/L混合而成的;對(duì)應(yīng)于EGFR基因的第18、19、20和21 號(hào)外顯子,每個(gè)外顯子各自都有一對(duì)擴(kuò)增引物