專利名稱：用于檢測(cè)人類egfr基因突變的引物、探針、試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因突變檢測(cè)技術(shù)老年領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)人類EGFR基因29種突變的引物、探針、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
人類表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowth factor receptor, EGFR)是一種蛋白酪氨酸激酶受體，廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是HER/ErbB家族成員之一，因此又名HERl或ErbBl。EGFR與其配體結(jié)合后在細(xì)胞表面形成二聚體，通過酪氨酸激酶的活性，激活受體自磷酸化，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)出信號(hào)，經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)中銜接蛋白和酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。當(dāng)EGFR發(fā)生突變時(shí)，EGFR自身或其配體過表達(dá)，從而通過自分泌或旁分泌方式刺激細(xì)胞形成失控性增殖。此外，EGFR過度活化還可以啟動(dòng)多種蛋白水解酶和促血管生成因子的表達(dá)，從而加速癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，EGFR過表達(dá)者通常預(yù)后較差。美國食品藥品監(jiān)督管理局于2003年5月批準(zhǔn)了美國阿斯利康(Aotrazeneca)公司生產(chǎn)的小分子基因靶點(diǎn)藥物吉非替尼(Gefitinib，也稱為易瑞沙/Iressa)用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，我國也與2005年2月批準(zhǔn)了吉非替尼進(jìn)入臨床。吉非替尼是一種口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，它可以特異性地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合癌細(xì)胞EGFR激酶功能區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)，通過抑制該酶的活性來抑制腫瘤的增長(zhǎng)、增殖，卻無明顯的化療副作用。美國哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員Lynch等率先報(bào)道，肺癌細(xì)胞中有EGFR酪氨酸激酶基因編碼區(qū)18 21外顯子突變的患者，靶向藥物吉非替尼的有效率高達(dá)80%以上。這種現(xiàn)象可能是由于EGFR突變使EGFR酪氨酸激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)的某些基團(tuán)發(fā)生重構(gòu)，增強(qiáng)了與ATP或其競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突變的患者表現(xiàn)出對(duì)吉非替尼更好的治療反應(yīng)。研究表明，美國非小細(xì)胞肺癌患者中只有約10%有EGFR基因突變，然而在亞洲人中，約30%的非小細(xì)胞肺癌患者有EGFR基因突變。臨床運(yùn)用的結(jié)果表明，EGFR基因外顯子18 21的突變(體細(xì)胞突變)是患者對(duì)此類靶向藥物有效的必要前提，如果病人不攜帶有EGFR基因突變而服用此類藥物，不僅耽誤病情還造成巨額藥費(fèi)的浪費(fèi)。因此，在用藥前篩查檢測(cè)病人是否攜帶有EGFR基因突變顯得尤為重要，也是未來腫瘤個(gè)體化治療的發(fā)展方向。目前，針對(duì)EGFR基因突變的檢測(cè)方法主要有直接測(cè)序法、傳統(tǒng)的熒光定量PCR法和高分辨率熔解曲線法。直接測(cè)序法耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度低，通常只用于科研，難以用于臨床的檢測(cè)。傳統(tǒng)的熒光定量PCR法難以使突變型基因在大量的野生型基因中得到專一性的擴(kuò)增，容易產(chǎn)生假陽性的檢測(cè)結(jié)果。高分辨率熔解曲線法所使用的儀器較特殊，難以在醫(yī)院進(jìn)行普及，而且此方法在檢測(cè)缺失突變時(shí)，效果較差。因此，如何快速準(zhǔn)確的檢測(cè)這些與藥物反應(yīng)性有關(guān)的EGFR基因突變，就成為人們亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)能力的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)人類EGFR基因29種突變的引物、探針、試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物及探針，包括下列5組引物和探針中的至少一
組
(1)5’ - ggtgacccttgtctctgtgttcttgtcc-3’ SEQ ID NO: I 5’ - gtgccgaacgcaccggatg -3’SEQ ID NO: 2
5， - gtgccgaacgcaccggagtt -3，SEQ ID NO: 3
5’ - gccgaacgcaccggagga -3’SEQ ID NO: 4
5， - FAM/ccttcaagatcctcaagagagcttggttggg/BHQl-3， SEQ ID NO: 5
(2)5， - gggcagcatgtggcaccatct-3’SEQ ID NO: 6 5’ - ccttgttggctttcggagatgtcttg -3’ SEQ ID NO: 7
5’ - tccttgttggctttcggttccttg -3’SEQ ID NO: 8
5’ - tccttgttggctttcggagatattttg -3’ SEQ ID NO: 9
5’ - ccttgttggctttcggagccttg -3’SEQ ID NO: 10
5’ - ccttgttggctttcggagattgct -3’SEQ ID NO: 11
5’ - tggctttcggagatgttggttcct -3’SEQ ID NO: 12
5’ - ccttgttggctttcggagattcctt -3’ SEQ ID NO: 13
5’ - gttggctttcggagatggttccttg -3’ SEQ ID NO: 14
5， - FAM/tctcaccttctgggatccagagtccctatga/BHQl-3， SEQ ID NO: 15
(3)5， - cccgtatctcccttccctgattacctt -3， SEQ ID NO: 16 5’ - gcacacaccagttgagcaggtact -3’ SEQ ID NO: 17
5’ - cctccaccgtgcagctcatcct -3’SEQ ID NO: 18
5， - caggaagcctacgtgatggccct -3，SEQ ID NO: 19
5’ - cagcgtggccagcgtggac -3’SEQ ID NO: 20
5’ - tgatggccagcgtggacggt -3’SEQ ID NO: 21
5’ - agcgtggacaacccccaccac -3’SEQ ID NO: 22
5， - FAM/cccttcggctgcctcctggactatgt/BHQl-3， SEQ ID NO: 23
(4)5， - cacagcagggtcttctctgtttca -3，SEQ ID NO: 24 5’ - gcacccagcagtttggcac -3’ SEQ ID NO: 25
5’ - tggtattctttctcttccgcacccaggt -3’ SEQ ID NO: 26
5， - FAM/ tcttgacatgctgcggtgttttcaccagtac/BHQl-3， SEQ ID NO: 27
(5)5， - cttccagtttgccaaggcacgag -3，SEQ ID NO: 28 5’ - cctctgcacataggtaatttccaaattcc -3’ SEQ ID NO: 29
5， - JOE/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQl-3， SEQ ID NO: 305， - FAM/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQl-3， SEQ ID NO: 31。一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，包括以下步驟(1)提供上述5組引物和探針的至少一組；
(2)待測(cè)樣品的處理和模板的提取；
(3)配制熒光定量PCR反應(yīng)體系；
(4)用步驟(I)的引物和探針擴(kuò)增待測(cè)的突變基因靶序列； (5)利用ARMS引物區(qū)分野生型和突變型基因序列，通過反應(yīng)體系的FAM和JOE的熒光強(qiáng)度來判斷檢測(cè)結(jié)果JOE是內(nèi)標(biāo)信號(hào)，用于檢測(cè)上樣的DNA量是否在允許范圍內(nèi)，JOE信號(hào)應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值(CT值大于18);FAM是檢測(cè)信號(hào)，用于檢測(cè)是否存在突變位點(diǎn)；在內(nèi)標(biāo)信號(hào)達(dá)到要求后，以FAM信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)CT值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，CT值小于32為陽性，CT值大于35為陰性，CT值在32和35之間為弱陽性。所述的一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，其中步驟(2)所述的待測(cè)樣品包括手術(shù)切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病理組織、石蠟切片、全血、血漿、血清或胸腔積液。優(yōu)選地，所述的一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，其中熒光定量PCR反應(yīng)體系為
I X PCR緩沖液
MgCl2 2. 0 5. OmmoldNTP :0. 2 0. 8mmol各條引物0. I I. 0 u mol各條探針0. I l.Ou molTaq 酶I 2Units模板:4 6 V- I總體積:20^30 u I。優(yōu)選PCR反應(yīng)條件為
第一階段94°C 5min ；
第二階段94°C 10s,60°C 30s，40 個(gè)循環(huán)；
第二階段40個(gè)循環(huán)時(shí)，收集FAM和JOE信號(hào)。另外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的試劑盒，包括PCR反應(yīng)緩沖液和上述的至少一組引物和探針。本發(fā)明經(jīng)過大量試驗(yàn)、研究和分析成功地篩選出能夠用于快速、靈敏、有效的檢測(cè)EGFR基因基因突變的引物組合和探針組合，并利用這些引物和探針開發(fā)出具有這樣的優(yōu)點(diǎn)的用于檢測(cè)EGFR基因基因突變的引物組合物、探針組合、試劑盒和方法。利用這些引物和探針可以檢測(cè)出人7號(hào)染色體外顯子18 21上常見的29種突變，包括點(diǎn)突變和缺失突變。這29種基因突變見下表。表I :EGFR基因常見基因突變
突變名稱I基因突變I外顯子I堿基變化
Ex18-ml G719A— 182156G>C
Exl8-m2~G719S— 182155G>A
Exl8-m3~ G719C— 182155G>T
Ex19-ml E746_A750del(l)— 192135—2249dell5
Exl9-m2~E746_A750del (2)— 192236—2250dell5
Exl9-m3 |L747_P753>S|l9丨2240—2257dell8
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)人類EGFR基因突變的引物及探針，包括下列5組引物和探針中的至少一組(1)5,-ggtgacccttgtctctgtgttcttgtcc-3’ SEQ ID NO: I5’ _ gtgccgaacgcaccggatg _3’SEQ ID NO: 2 5， _ gtgccgaacgcaccggagtt _3，SEQ ID NO: 3 5’ - gccgaacgcaccggagga _3’SEQ ID NO: 45， - FAM/ccttcaagatcctcaagagagcttggttggg/BHQl-3， SEQ ID NO: 5 (2)5，-gggcagcatgtggcaccatct-3’SEQ ID NO: 6 5’ - ccttgttggctttcggagatgtcttg _3’ SEQ ID NO: 7 5’ - tccttgttggctttcggttccttg _3’ SEQ ID NO: 8 5’ - tccttgttggctttcggagatattttg -3’ SEQ ID NO: 9 5’ - ccttgttggctttcggagccttg -3’ SEQ ID NO: 10 5’ - ccttgttggctttcggagattgct -3’ SEQ ID NO: 11 5’ - tggctttcggagatgttggttcct -3’ SEQ ID NO: 12 5’ - ccttgttggctttcggagattcctt -3’ SEQ ID NO: 13 5’ - gttggctttcggagatggttccttg -3’ SEQ ID NO: 145， - FAM/tctcaccttctgggatccagagtccctatga/BHQl-3， SEQ ID NO: 15 (3)5’_cccgtatctcccttccctgattacctt -3’ SEQ ID NO: 16 5’ - gcacacaccagttgagcaggtact -3’ SEQ ID NO: 17 5’ - cctccaccgtgcagctcatcct -3’SEQ ID NO: 18 5， - caggaagcctacgtgatggccct -3，SEQ ID NO: 19 5’ - cagcgtggccagcgtggac -3’SEQ ID NO: 20 5’ - tgatggccagcgtggacggt -3’SEQ ID NO: 21 5’ - agcgtggacaacccccaccac -3’SEQ ID NO: 225， - FAM/cccttcggctgcctcctggactatgt/BHQl-3， SEQ ID NO: 23 (4)5，- cacagcagggtcttctctgtttca -3，SEQ ID NO: 24 5’ - gcacccagcagtttggcac -3’ SEQ ID NO: 25 5’ - tggtattctttctcttccgcacccaggt -3’ SEQ ID NO: 265， - FAM/ tcttgacatgctgcggtgttttcaccagtac/BHQl-3， SEQ ID NO: 27 (5)5，- cttccagtttgccaaggcacgag -3，SEQ ID NO: 28 5’ - cctctgcacataggtaatttccaaattcc -3’ SEQ ID NO: 295， - JOE/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQl-3， SEQ ID NO: 305， - FAM/ccacctcacagttattgaacatcctctggagg/BHQl-3， SEQ ID NO: 31。
2.—種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，包括以下步驟 (1)提供權(quán)利要求I所述的5組引物和探針的至少一組； (2)待測(cè)樣品的處理和模板的提?。? (3 )配制熒光定量PCR反應(yīng)體系； (4)用步驟(I)的引物和探針擴(kuò)增待測(cè)的突變基因靶序列； (5)利用ARMS引物區(qū)分野生型和突變型基因序列，通過反應(yīng)體系的FAM和JOE的熒光強(qiáng)度來判斷檢測(cè)結(jié)果JOE是內(nèi)控信號(hào)，用于檢測(cè)上樣的DNA量是否在允許范圍內(nèi)，JOE信號(hào)應(yīng)達(dá)到設(shè)定閾值(CT值大于18);FAM是檢測(cè)信號(hào)，用于檢測(cè)是否存在突變位點(diǎn)；在內(nèi)控信號(hào)達(dá)到要求后，以FAM信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)CT值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，CT值小于32為陽性，CT值大于35為陰性，CT值在32和35之間為弱陽性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，其特征在于步驟(2)所述的待測(cè)樣品包括手術(shù)切除的新鮮病理組織、甲醛固定石蠟包埋病理組織、石蠟切片、全血、血漿、血清或胸腔積液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)人類EGFR基因突變的方法，其特征在于熒光定量PCR反應(yīng)體系為 I X PCR緩沖液MgCl2 2. 0 5. OmmoldNTP :0. 2 0. 8mmol各條引物0. I I. 0 u mo I各條探針0. I l.Ou molTaq 酶:1 2Units模板4 6 U I總體積:20^30 u Io
5.—種檢測(cè)人類EGFR基因突變的試劑盒，其特征在于包括PCR反應(yīng)緩沖液和權(quán)利要求I所述的至少一組引物和探針。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)EGFR基因突變的引物、探針、試劑盒及檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法包括(1)提供引物和探針；(2)檢測(cè)樣本的處理和DNA提?。?3)熒光定量PCR反應(yīng)體系的成分；(4)待檢測(cè)的EGFR突變基因的靶序列；(5)利用ARMS引物區(qū)分野生型和突變型基因，反應(yīng)結(jié)果通過FAM和JOE的熒光強(qiáng)度來判斷。本發(fā)明所提供的引物、探針及檢測(cè)方法可同時(shí)檢測(cè)EGFR基因上的29種突變，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快，整個(gè)檢測(cè)過程只需要60分鐘。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102747157SQ20121024386
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者喻德華, 趙平鋒, 趙珊珊 申請(qǐng)人:武漢海吉力生物科技有限公司