一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及丙谷二肽的制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] N(2) -L-丙氨酰-L-谷氨酸胺（又稱(chēng)丙氨酰谷氨酰胺）屬于氨基酸的衍生物，簡(jiǎn)稱(chēng) 丙谷二肽，主要用作氨基酸類(lèi)腸外營(yíng)養(yǎng)劑，具有重要的醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003] 丙谷二肽的制備技術(shù)主要有化學(xué)合成法和微生物酶轉(zhuǎn)化法，化學(xué)合成法主要存在 合成路線長(zhǎng)、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、環(huán)境污染大、工藝條件嚴(yán)格和成本高的缺點(diǎn)。
[0004] 公布號(hào)為CN104480075A的專(zhuān)利公開(kāi)了一種生物酶催化轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方 法，其生物酶制備和使用采用生物酶凍干粉的形式，使用不方便，且酶活低，物料反應(yīng)率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，具有生產(chǎn) 時(shí)間短、工藝控制簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方便無(wú)污染、物料反應(yīng)率高、低成本的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二 肽的方法，包括以下步驟： 1) 生物酶液的制備：將生物酶溶解在緩沖溶液中，控制pH值在7. 0±2. 0內(nèi)，控溫5~ l〇°C，制得生物酶液，其中所含酯?；D(zhuǎn)移生物酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~20% ;所屬酯?；D(zhuǎn)移 生物酶為胞內(nèi)酶，其基因載體為大腸桿菌和酵母菌； 2) 將底物L(fēng)-丙氨酸衍生物和谷氨酰胺溶解在純化水中，之后將生物酶液均勻滴加到 反應(yīng)液中，同時(shí)加入酸液或堿液控制反應(yīng)液pH在5~10,控溫15~25°C反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程取 樣檢測(cè)丙谷二肽生成量，當(dāng)其含量最高時(shí)，一般為60~120g/L，停止反應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化液經(jīng)分 離得到丙谷二肽； 所述L-丙氨酸衍生物為L(zhǎng)-丙氨酸的酯類(lèi)衍生物。
[0007] 優(yōu)選的，所述緩沖溶液為磷酸氫二鉀-磷酸緩沖溶液。
[0008] 所述酸液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%_50%的鹽酸、硫酸、磷酸或醋酸，所述堿液為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為10%-50%的碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水或三乙胺。
[0009] 進(jìn)一步地，所述L-丙氨酸衍生物為丙氨酸異丙酯或丙氨酸甲酯。
[0010] 進(jìn)一步地，所述丙氨酸異丙酯加入量與谷氨酰胺的加入量的質(zhì)量之比為2:1。
[0011] 進(jìn)一步地，所述丙氨酸甲酯加入量與谷氨酰胺的加入量的質(zhì)量之比為1.4~ 1. 2:1〇
[0012] 進(jìn)一步地，所述生物酶的加入量與谷氨酰胺的加入量的質(zhì)量之比為12~ 17:100〇
[0013] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于： 1)本發(fā)明將生物酶溶解于緩沖溶液中制成生物酶液使用，相比現(xiàn)有技術(shù)中采用生物酶 凍干粉，能夠使酶的活性更高，酶活可達(dá)4500~6000U，酶的催化轉(zhuǎn)化能力更高，催化轉(zhuǎn)化 反應(yīng)效率高，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，更適用工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
[0014] 2)本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)改進(jìn)了物料的加入順序，首先將底物完全溶解于水中使 混合更均勻，再緩慢滴加生物酶液，物料反應(yīng)率更高，轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%以上。
[0015] 3)本發(fā)明工藝控制簡(jiǎn)單、質(zhì)量指標(biāo)容易控制、實(shí)施成本低，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面舉例對(duì)本發(fā)明方法作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017] 實(shí)施例1 取生物酶350g溶解在3000ml的磷酸氫二鉀-磷酸緩沖溶液中，調(diào)節(jié)PH至7. 5,控溫 5~10°C，制備得到生物酶液。經(jīng)檢測(cè)酶活為5122U。用純化水分別與鹽酸、氨水配制質(zhì)量 分?jǐn)?shù)15%的稀鹽酸和稀氨水備用。
[0018] 取反應(yīng)底物丙氨酸異丙酯5kg和谷氨酰胺2. 5kg溶解在50L純化水中，將生物酶 液緩慢均勻加入到反應(yīng)底物中，控制加入速度15ml/min，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)液的pH，用制得的 稀鹽酸和稀氨水加入反應(yīng)底物中，控制反應(yīng)液pH在5~10,同時(shí)保持溫度15~25°C。反 應(yīng)過(guò)程中抽樣檢測(cè)，液相色譜法檢測(cè)生成的丙谷二肽量，丙谷二肽生成量為最大時(shí)停止反 應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化液中丙谷二肽含量5. 0%wt，谷氨酰胺剩余量為0. 13%wt，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離提純后 制得力肽3. 5kg，轉(zhuǎn)化率93. 5%。
[0019] 實(shí)施例2-4 實(shí)施例2-4中生物酶、底物的用量見(jiàn)表1，生物酶溶解在300ml的磷酸氫二鉀-磷酸緩 沖溶液中，經(jīng)檢測(cè)酶活為5428U。底物溶解在50L純化水中，其余步驟和反應(yīng)條件與實(shí)施例 1相同，反應(yīng)停止后轉(zhuǎn)化液中各物質(zhì)含量見(jiàn)表2。
[0020]
實(shí)施例5-7 實(shí)施例5-7中生物酶、底物的用量見(jiàn)表3,生物酶溶解在2900ml的磷酸氫二鉀-磷酸緩 沖溶液中，底物溶解在60L純化水中，其余步驟和反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同，反應(yīng)停止后轉(zhuǎn) 化液中各物質(zhì)含量見(jiàn)表4。
[0021]
需要說(shuō)明的是，反應(yīng)液中調(diào)控pH用稀鹽酸和稀氨水可根據(jù)需要，制備成不同濃度，方 便使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 生物酶液的制備：將生物酶溶解在緩沖溶液中，控制pH值在7. 0±2. 0內(nèi)，控溫5~ l〇°C，制得生物酶液，其中所含酯?；D(zhuǎn)移生物酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~20% ;所屬酯?；D(zhuǎn)移 生物酶為胞內(nèi)酶，其基因載體為大腸桿菌和酵母菌； 2) 將底物L(fēng)-丙氨酸衍生物和谷氨酰胺溶解在純化水中，之后將生物酶液均勻滴加到 反應(yīng)液中，同時(shí)加入酸液或堿液控制反應(yīng)液pH在5~10,控溫15~25°C反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程取 樣檢測(cè)丙谷二肽生成量，當(dāng)其含量最高時(shí)，停止反應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離得到丙谷二肽； 所述L-丙氨酸衍生物為L(zhǎng)-丙氨酸的酯類(lèi)衍生物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于所述緩沖 溶液為磷酸氫二鉀-磷酸緩沖溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于所述酸液 為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%_50%的鹽酸、硫酸、磷酸或醋酸，所述堿液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%_50%的碳酸 鈉、碳酸氫鈉、氨水或三乙胺。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于所述 L-丙氨酸衍生物為丙氨酸異丙酯或丙氨酸甲酯。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于，所述丙 氨酸異丙酯加入量與谷氨酰胺的加入量的質(zhì)量之比為2:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于，所述丙 氨酸甲酯加入量與谷氨酰胺的加入量的質(zhì)量之比為1. 4~1. 2:1。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，其特征在于，所述生 物酶的加入量與谷氨酰胺的加入量的質(zhì)量之比為12~17:100。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及丙谷二肽的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種生物酶轉(zhuǎn)化制備丙谷二肽的方法，包括：1）生物酶液的制備：將生物酶溶解在緩沖溶液中，控制pH值在7.0±2.0內(nèi)，控溫5～10℃，制得生物酶液，其中所含酯酰基轉(zhuǎn)移生物酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～20%；2)將底物L(fēng)-丙氨酸的酯類(lèi)衍生物和谷氨酰胺溶解在純化水中，之后將生物酶液均勻滴加到反應(yīng)液中，同時(shí)加入酸液或堿液控制反應(yīng)液pH在5～10，控溫15～25℃反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程取樣檢測(cè)丙谷二肽生成量，當(dāng)其含量最高時(shí)停止反應(yīng)，所得轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離得到丙谷二肽。本發(fā)明方法使得酶的活性高，物料反應(yīng)率更高，具有工藝控制簡(jiǎn)單、質(zhì)量指標(biāo)容易控制、成本低的優(yōu)點(diǎn)，更適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12P21/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105274174
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510854874
【發(fā)明人】李斌水, 何連順
【申請(qǐng)人】精晶藥業(yè)股份有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日