高濃底物體系制備谷氨酰胺肽的方法
【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及谷氨酰胺肽制備技術(shù)領域，具體涉及高濃底物體系制備谷氨酰胺肽的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酰胺（Glutamine)是谷氨酸的y-羧基酰胺化的氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨 基酸之一，分子量146. 15Da，分解溫度185°C，等電點5. 65,屬中性氨基酸。作為20種構(gòu)成 蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，谷氨酰胺占人體全身游離氨基酸一半以上，是機體含量最豐富 的氨基酸，人體內(nèi)的谷氨酰胺主要儲存于腦、骨骼肌和血液中。因此，谷氨酰胺被認為是目 前所知的最重要的氨基酸之一，并被稱為"條件性必需氨基酸"。谷氨酰胺肽是一類含有谷 氨酰胺肽的總稱。由于谷氨酰胺在肽鏈的氮端時不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸，因此，谷氨酰 胺肽常指當含有非氮端谷氨酰胺的肽類。與游離谷氨酰胺相比，谷氨酰胺肽的穩(wěn)定性和溶 解性都會大大提高，因此谷氨酰胺肽是實現(xiàn)游離谷氨酰胺穩(wěn)定化的有效途徑。谷氨酰胺肽 的活性常用肽中非氮端谷氨酰胺的含量和肽的分子量來表征。
[0003] 以谷朊粉為原料，經(jīng)調(diào)漿、蛋白酶酶解、分離、過濾、噴霧干燥等工藝制成小麥面筋 蛋白酶解產(chǎn)物，商品名為小麥低聚肽。面筋蛋白酶解產(chǎn)物或小麥低聚肽中均含有大量谷氨 酰胺肽。2012年中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會根據(jù)《中華人民共和國食品安 全法》和《新資源食品管理辦法》有關(guān)規(guī)定，批準了小麥低聚肽作為新資源食品。
[0004] 據(jù)報道，小麥低聚肽具有保護胃腸粘膜、抗氧化、增強免疫力、緩解運動疲勞和提 升耐缺氧能力等活性。楊小車等發(fā)現(xiàn)對SD大鼠灌喂小麥蛋白的胃蛋白酶解物，能夠提尚SD 大鼠免疫器官的重量，增加腸道SIgA的分泌量，改善腸道免疫功能。周業(yè)飛等利用彈性蛋 白酶制得的小麥蛋白酶解物可提高AA肉雞免疫器官的重量和免疫器官指數(shù)。王石等研究 表明，在仔豬斷乳日糧中添加小麥蛋白酶解物能有效降低仔豬的腹瀉率，且效果優(yōu)于血漿 蛋白添加組。
[0005] 關(guān)于谷氨酰胺肽的制備主要有兩種途徑：一是通過化學法合成，目前已見上市的 主要是二肽，有丙氨酰谷氨酰胺（Ala-Gin)和甘氨酰谷氨酰胺（Gly-Gln)兩種，這兩種肽 主要以注射類液體藥劑的形式存在；二是通過蛋白酶控制酶解植物蛋白如小面面筋蛋白獲 得富含谷氨酰胺的肽段。這兩種方法各有利弊：化學合成法存在價格高和有機試劑難以完 全去除等潛在安全隱患，優(yōu)點是產(chǎn)品中谷氨酰胺含量較高，目前主要用于醫(yī)藥領域；蛋白酶 酶解谷朊粉制備谷氨酰胺肽反應條件溫和，無有毒有害成分生成，但酶解產(chǎn)物中谷氨酰胺 含量相對低，目前酶解產(chǎn)物主要用于食品及保健食品領域。根據(jù)面筋蛋白控制酶解制備谷 氨酰胺肽體系溶劑的不同，可分為水體系和乙醇體系。下面分別進行介紹。
[0006] 1992年，日本學者Tanabe等人首次以小麥面筋蛋白水溶液為原料，采用 Molsin在37°C酶解24h，之后采用Actinase E在pH 7. 0、37°C酶解24h制得谷氨酰胺 肽，經(jīng)Sephadex G-15純化后得到谷氨酰胺肽中非氮端Glx(谷氨酰胺+谷氨酸）含量達 50. 33g/100g。將該谷氨酰胺肽喂養(yǎng)節(jié)食大鼠和飼料中添加甲氨蝶呤的大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨 酰胺肽與模擬氨基酸混合物相比，能增加節(jié)食大鼠的粘膜蛋白質(zhì)含量，改善甲氨蝶呤誘導 的小腸結(jié)腸炎。近年來，中國學者對谷氨酰胺肽的酶解制備工藝進行了深入的研究。吉林 農(nóng)業(yè)大學馬洪龍利用堿性蛋白酶水解小麥面筋蛋白的最適條件： pH 8. 0,溫度70°C，酶濃 度4 %，底物濃度7 %，反應時間150min。在此條件下，酶解產(chǎn)物中的有效谷氨酰胺含量為 17. 65%，占酶解樣品中Glx(Gln與Glu之和，含量22. 83%)的77. 31%，三氯乙酸氮溶 指數(shù)為77. 86%，蛋白含量76. 03%，游離氨基酸含量2. 06%，說明酶解產(chǎn)物的有效Gin含 量高，且肽含量高。劉文豪采用胰蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶連續(xù)酶解小麥面筋蛋白制備谷 氨酰胺肽，在底物濃度3g/100mL、pH8. 0的條件下，先經(jīng)胰蛋白酶在48°C下酶解2h，再用堿 性蛋白酶在68°C條件下酶解時間80min后制得較高含量的谷氨酰胺肽，經(jīng)lOOOODa透析后 產(chǎn)品有效谷氨酰胺含量為21. 35g/100g。蔡木易等人公開了一種以小麥谷朊粉為原料，采 用Alcalase和木瓜蛋白酶兩次分步酶解制得小麥谷氨酰胺肽的方法。其制備工藝如下： 將小麥谷朊粉以100 :6_12(L :kg)的液料比與水混配調(diào)漿，調(diào)整pH值范圍為9-11，加熱至 50-80°C，保溫攪拌20-60min。然后將反應罐中的堿性料液栗入片式離心機中，分離成清液 和渣料。收集渣料，將渣料加水稀釋，加熱至50-80°C，攪拌并分離。同樣的處理方式重復 3次。純化后的渣料以100 :40-50的水渣比加水混合、攪拌，調(diào)pH至7-9,加熱至40-60°C， 按每克蛋白質(zhì)2000-5000U加入Alcalase，反應3-5小時。然后，按每克蛋白質(zhì)1000-2000U 酶量加入木瓜蛋白酶，溫度45-55°C，酶解1-2小時。最后，將酶解液加熱滅酶。小麥蛋白酶 解液用管式離心機離心，取離心清液，用孔徑0.05-0. lym的微濾和超濾設備進行過濾。小 麥蛋白酶解液經(jīng)濃縮、脫色、膜過濾和噴霧干燥，得小麥谷氨酰胺肽粉。經(jīng)檢測，該方法所制 備的谷氨酰胺肽混合物中分子量小于l〇〇〇Da的組分占90%以上，谷氨酰胺-精氨酸-谷 氨酰胺（Gln-Arg-Gln，QRQ)的含量在2.0%以上。谷氨酰胺肽其中的谷氨酰胺含量達到 23. 54%〇
[0007] 上述工藝制備的面筋蛋白酶解物中谷氨酰胺含量普遍在20% -25%左右，明顯 低于母體谷朊粉中谷氨酰胺的含量，其原因是：（1)部分蛋白酶有一定的谷氨酰胺酶活力； (2)酶解產(chǎn)生部分游離谷氨酰胺和氮端含谷氨酰胺的肽，這兩者均不穩(wěn)定。（3)熱處理和酸 堿處理導致面筋蛋白發(fā)生脫酰胺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種高濃底物體系制備谷氨酰胺肽的方法，克服現(xiàn)有技術(shù) 存在的上述不足。
[0009] 本發(fā)明的目的至少通過如下技術(shù)方案之一實現(xiàn)。
[0010] 高濃底物體系制備谷氨酰胺肽的方法，該方法包括如下步驟：
[0011] (1)谷朊粉的酶解：將谷朊粉與水按質(zhì)量比1:1~1:1. 5混合，加入蛋白酶，在 50~60 °C酶解4-12h，得谷朊粉酶解液；
[0012] (2)將谷朊粉酶解液滅酶，噴霧干燥，得到谷氨酰胺肽。
[0013] 進一步地，步驟（1)中所述的蛋白酶的谷氨酰胺酶活力小于lGTU/ml或lGTU/g。
[0014] 進一步地，步驟（1)中所述的蛋白酶為Alcalase2. 4L、Novozym? 37071、風味蛋白 酶500MG和諾維信Neutrase中任意一種。
[0015] 進一步地，步驟（1)中所述的蛋白酶的添加量為谷朊粉重量的0. 5% -2%。
[0016] 進一步地，步驟（2)中所述的滅酶條件85~95°C滅酶10~15min。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：
[0018] 本發(fā)明提供的谷氨酰胺肽的制備方法，其氮溶指數(shù)、分子量分布以及TCA可溶性 氮含量與傳統(tǒng)方法無明顯差異，但水解產(chǎn)物中谷氨酰胺含量明顯提高。本發(fā)明制備的谷氨 酰胺肽中谷氨酰胺的含量在27-29%之間，明顯高于目前商業(yè)化的谷氨酰胺肽。
【具體實施方式】
[0019] 以下結(jié)合實例對本發(fā)明的實施作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護不限于此。
[0020] 谷氨酰胺酶活力定義為：催化谷氨酰胺酶水解產(chǎn)生谷氨酸和氨離子。一個谷 氨酰胺酶單位（GTU)定義為：在37°C，pH6.0條件下將L-谷氨酰胺（濃度1%)轉(zhuǎn)化為 1 ymol的L-谷氨酸所需要的酶量。測定方法參照：Wakayamam, Yamagata T, Kamemura A, et al. Characterizationof salt-tolerant glutaminase from Stenotrophomonasmaltophil iaNYff-81 and its application in Japanese soy sauce fermentation[J]. IndMicrobio IBiotechnol,2005,32(9):383-390.
[0021] 實施例1
[0022] 將谷朊粉與1. 5倍水混合，添加谷朊粉重量1 %的不同蛋白酶，55°C水解10h，95°C 滅酶10min，噴霧干燥得谷氨酰胺肽。不同商品化蛋白酶的谷氨酰胺酶活力測定結(jié)果見表 1，谷氨酰胺含量如表2。申請人發(fā)現(xiàn)大部分商品化的蛋白酶均有一定的谷氨酰胺催化講解 活力。
[0023] 表 1
[0024]
[0025] 由表1可見，大部分商品化蛋白酶酶制劑具有一定的谷氨酰胺酶催化活力，說明 商品化酶制劑中本身含有谷氨酰胺酶或是蛋白酶具有谷氨酰胺酶催化活力。其中性蛋白酶 6號的谷氨酰胺酶活力達到18. 49GTU/g。谷氨酰胺酶為來自日本味之素公司，標注活力為 100GTU/g，測定結(jié)果為 112. 05GTU/g。
[0026] 表 2
[0027]
[0028] 由表2可見，眾多蛋白酶中谷氨酰胺酶活力較高的中性蛋白酶6號、木瓜蛋白酶和 丹尼斯克堿性蛋白酶所制備的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量均低于25%，而蛋白酶中谷氨酰 胺酶活力較低的諾維信37071、諾維信Neutrase、諾維信Alcalase和風味蛋白酶500MG所 制備的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺含量一般在26% -29%。
[0029] 實施例2
[0030] 將谷朊粉與不同比例重量水混合，添加谷朊粉重量1 %的諾維信37071，60°C水解 7h，90°C滅酶15min，噴霧干燥得谷氨酰胺肽。
[0031] 表 3
[0032]
[0033] 由表3可見，隨著酶解體系中加水比例的增加，谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量呈 下降趨勢。當谷朊粉與水按質(zhì)量比1:1~1:1. 5混合時，谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量在 27%左右。
[0034] 實施例3
[0035] 將谷朊粉與1. 5重量水混合，添加谷朊粉重量2%的風味蛋白酶500MG，60°C水解 12h，92°C滅酶13min，噴霧干燥得谷氨酰胺肽。谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量為26. 8%。
【主權(quán)項】
1. 高濃底物體系制備谷氨酰胺肽的方法，其特征在于該方法包括如下步驟： (1) 谷朊粉的酶解：將谷朊粉與水按質(zhì)量比1:1~1:1. 5混合，加入蛋白酶，在50~ 60°C酶解4_12h，得谷|]元粉酶解液； (2) 將谷朊粉酶解液滅酶，噴霧干燥，得到谷氨酰胺肽。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)中所述的蛋白酶的谷氨酰胺酶 活力小于lGTU/ml或lGTU/g。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)中所述的蛋白酶為 Alcalase2. 4L、Novozym? 37071、風味蛋白酶 500MG 和諾維信 Neutrase 中任意一種。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（1)中所述的蛋白酶的添加量為谷 朊粉重量的〇. 5%-2%。5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟（2)中所述的滅酶條件85~95°C 滅酶10~15min。
【專利摘要】本發(fā)明提供了高濃底物體系制備谷氨酰胺肽的方法。本發(fā)明以谷朊粉為原料，通過提高酶解體系中谷朊粉的濃度水解制備富含谷氨酰胺的小肽，具體包括步驟：（1）谷朊粉的酶解：將谷朊粉與水按質(zhì)量比1:1～1:1.5混合，加入蛋白酶，在50～60℃酶解4-12h，得谷朊粉酶解液；（2）將谷朊粉酶解液滅酶，噴霧干燥，得到谷氨酰胺肽。本發(fā)明制備的谷氨酰胺肽中谷氨酰胺的含量在27-29%之間，明顯高于目前商業(yè)化的谷氨酰胺肽。
【IPC分類】C12P21/06
【公開號】CN105132504
【申請?zhí)枴緾N201510621715
【發(fā)明人】崔春, 錢楊鵬, 任嬌艷
【申請人】華南理工大學
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月24日