一種二肽片段液固結(jié)合制備胸腺法新的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種以二肽片段液固結(jié)合制備胸腺法新的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胸腺法新（Thymosin)，商品名日達(dá)仙，由美國SciClone公司申請(qǐng)，意大利Patheon 公司生產(chǎn)。目前已在全球五十多個(gè)國家上市，適應(yīng)癥有慢性乙肝，慢性丙肝，癌癥輔助藥物， 疫苗增強(qiáng)劑，免疫刺激劑。此外，治療肝癌及惡性黑色素瘤已完成二期臨床。胸腺法新有著 良好的安全記錄，根據(jù)治療超過30萬例患者的經(jīng)驗(yàn)看來，被證明無明顯的副作用以及有很 好的耐受性。胸腺法新被用于治療老年患者（高達(dá)101歲），兒童患者（僅13個(gè)月大）以 及免疫功能低下患者，并未引發(fā)明顯副作用以及毒性反應(yīng)。此外，胸腺法新與其他藥物，例 如干擾素結(jié)合治療時(shí)并無明顯的惡化副作用的現(xiàn)象出現(xiàn)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，胸腺法新以高于 推薦使用量800倍的劑量測(cè)試時(shí)并無證據(jù)顯示不良的臨床癥狀發(fā)生。
[0003] 胸腺法新是由28個(gè)氨基酸組成的多肽，氨基酸序列如下所示：Ac-Ser-Asp-Ala-A Ia-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Va I-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH 目前，胸腺法新的合成主要有化學(xué)合成法（如CN 10409688 A，CN 102199205)及基 因工程法（如CN1431311)，其中基因工程法工藝繁瑣，純化復(fù)雜，應(yīng)用不如固相合成法普 遍。專利CN 102199205公開了一種逐個(gè)氨基酸偶聯(lián)的固相合成方法，但該方法合成周期 長，困難位點(diǎn)連接效率低，缺失肽嚴(yán)重；專利CN 10409688 A公開了一種以片段方式偶聯(lián) 合成胸腺法新的方法，將胸腺法新肽鏈分成三段，之后片段連接完成胸腺法新合成；專利 201310202015. 1 在合成 26 位 Ala 和 27 位 Glu 時(shí)引入片段二肽 Fmoc-Ala-Glu (OtBu)-OH, 解決了采用CTC樹脂合成胸腺法新中二肽Glu-Asn容易從樹脂上斷裂下來的難題；總之，這 類使用肽片段的合成方法雖然解決了部分困難位點(diǎn)難于偶聯(lián)、部分肽片段容易從樹脂上斷 裂下來的難題，但是仍不能解決胸腺法新中多個(gè)連續(xù)氨基酸片段的合成、純化以及偶聯(lián)過 程中的反應(yīng)效率低、損失嚴(yán)重等問題。
[0004] 眾所周知，胸腺法新含有多個(gè)連續(xù)氨基酸片段，例如23~22位的Val~Val，20 位~19位的Lys~Lys，13位~12位的Thr~Thr，9位~8位的Ser~Ser，4位~3位 的Ala~Ala ;在胸腺法新合成過程中經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除23位~22位的連續(xù)Val相對(duì)容易連 接之外，剩余四個(gè)連續(xù)氨基酸偶聯(lián)均較為困難、連接效率不高；并且在固相合成過程中，連 續(xù)氨基酸往往容易產(chǎn)生缺失肽，且部分缺失肽在后續(xù)純化過程中難以分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決胸腺法新合成中所遇到的以上難點(diǎn)，本發(fā)明提供一種以二肽片段液固結(jié)合 制備胸腺法新的方法，既能避免缺失肽的生成，又能提高總體合成效率，解決19位，12位，8 位，3位偶聯(lián)困難需要連續(xù)復(fù)投的問題；同時(shí)與逐個(gè)位點(diǎn)偶聯(lián)相比，因解決了四個(gè)位點(diǎn)的偶 聯(lián)困難問題，可較大幅度的提高最終粗肽的純度和收率。與片段偶聯(lián)相比，合成過程簡便， 物料成本降低，有利于胸腺法新的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案： 一種以二肽片段液固結(jié)合制備胸腺法新的方法，其特征在于，包括如下步驟： (a) Fmoc-Lys (Boc) -OSu 與 H-Lys (Boc) -OH 在堿 A 溶液中偶聯(lián)生成二肽 Fmoc-Lys (Boc) -Lys (Boc) -OH ;Fmoc-Thr (tBu) -OSu 與 H-Thr (tBu) -OH 在喊 A 溶液中偶聯(lián)生 成二肽 Fmoc-Thr (tBu) -Thr (tBu) -OH ;Fmoc-Ser (tBu) -OSu 與 H-Ser (tBu) -OH 在喊 A 溶液中 偶聯(lián)生成二肽 Fmoc-Ser (tBu) -Ser (tBu) -OH ;Fmoc-Ala_OSu 與 H-Ala-OH 在喊 A 溶液中偶聯(lián) 生成一狀 Fmoc_Ala_Ala_OH。
[0007] (b)以WangResin或CTC樹脂為固相載體，在偶聯(lián)劑存在下，依次 與 Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-0H， Fmoc-Glu(OtBu) -OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Val-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-〇H， Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Leu-OH， Fmoc-Asp(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-〇H，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-〇H，F(xiàn)moc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Ala-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH發(fā)生偶聯(lián)接肽反應(yīng)；經(jīng)N端乙?；螅脗?cè)鏈保護(hù)的胸腺法新肽樹脂，其 結(jié)構(gòu)如下； AC-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-G Iu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(-Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin; (c)胸腺法新肽樹脂經(jīng)過裂解，純化，凍干得到胸腺法新精肽。
[0008] 其中步驟（a)中所述的二肽片段Fmoc-Lys 〇oc) -Lys (Boc)制備方法為：將 H-Lys(Boc)-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%體積的有 機(jī)溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入0. 8~I. 0倍摩爾量（以H-Lys(Boc)-OH的 量計(jì)）Fmoc-Lys (Boc)-OSu有機(jī)溶劑B溶液；TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束減壓蒸發(fā)去 掉有機(jī)溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取，析晶得 Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH。
[0009] 步驟（a)中所述的二肽片段Fmoc-Thr (tBu) -Thr (tBu) -OH的制備方法為：將 H-Thr (tBu)-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%體積的有 機(jī)溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入0. 8~I. 0倍摩爾量（以H-Thr (tBu)-OH的 量計(jì)）Fmoc-Thr (tBu)-OSu有機(jī)溶劑B溶液；TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束減壓蒸發(fā)去 掉有機(jī)溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取，析晶得 Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-OH。
[0010] 步驟（a)中所述的二肽片段Fmoc-Ser (tBu) -Ser (tBu) -OH的制備方法為：將 H-Ser (tBu)-OH和堿A按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%體積的有 機(jī)溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入0. 8~I. 0倍摩爾量（以H-Ser (tBu)-OH的 量計(jì)）Fmoc-Ser (tBu)-OSu有機(jī)溶劑B溶液；TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束減壓蒸發(fā)去 掉有機(jī)溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取，析晶得 Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-OH。
[0011] 步驟（a)中所述的二狀片段Fmoc-Ala-Ala-OH的制備方法為：將H -Ala-OH和喊A 按照摩爾比1:1~2的比例溶解在水中，加入5~20%體積的有機(jī)溶劑B助溶，待完全溶 解后，攪拌下滴加入〇. 8~I. 0倍摩爾量（以H-Ala-OH的量計(jì)）Fmoc-Ala-OSu有機(jī)溶劑B 溶液；TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束減壓蒸發(fā)去掉有機(jī)溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液 調(diào)溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Ala-Ala-〇H。
[0012] 以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、三乙胺、二乙胺、N-乙基 二異丙基胺、N，N-二異丙基乙胺等中的一種； 有機(jī)溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙 腈中的一種或幾種。
[0013]步驟（a)中所述的 Fmoc-Lys(Boc)-OSu 的制備方法為：將 Fmoc-Lys (Boc)-OH 和 HOSu按照摩爾比為1:1. 0-1. 2量溶于THF中，冰水浴下將1. 0-1. 2倍摩爾量的DCC/THF(以 Fmoc-Lys (Boc) -OH的量計(jì))溶液滴加到上述溶液中，I h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25°C繼續(xù)攪拌 反應(yīng)2 h ;反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去60-70%體積的有機(jī)溶劑，在剩余油狀物中 加入3-4倍體積的石油醚，等析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-Lys (Boc)-OSu。
[0014]步驟（a)中所述的 Fmoc-Thr (tBu)-OSu 的制備方法為：將 Fmoc-Thr (tBu)-OH 和 HOSu按照摩爾比為1:1. 0-1. 2量溶于